姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠腸道機(jī)能的調(diào)節(jié)作用

王麗 吉喆 董麗 路昕 秦菲 胡戈周海濤*曹建民*

(1.北京體育大學(xué),北京 100084;2.北京聯(lián)合大學(xué),北京 100101;3.北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191;4.常州大學(xué),江蘇 常州 213164)

隨著生活水平提高,人民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化,高糖、高脂飲食攝入大幅增加。血脂紊亂、高血壓、非酒精性脂肪肝等疾病發(fā)病率持續(xù)增高。近年來(lái),全球兒童、青少年血脂異常發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。血脂紊亂極易誘發(fā)腸道菌群紊亂、腸黏膜屏障損傷[1]。血脂紊亂患者腸道菌群呈現(xiàn)明顯的特異性[2]。研究證明調(diào)節(jié)腸道菌群不僅可以有效保護(hù)血脂紊亂患者腸道黏膜屏障[3],還可以改善其血脂水平[4]。姜黃素及有氧運(yùn)動(dòng)均具有改善腸道生理功能和降血脂作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)以高血脂癥大鼠為模型,探討姜黃素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)血脂紊亂大鼠腸黏膜屏障、腸道菌群等腸道生理功能的影響,以期為營(yíng)養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)的聯(lián)合干預(yù)改善兒童、青少年時(shí)期高脂飲食誘導(dǎo)血脂紊亂及其并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只5 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,體重180～200 g,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0010】,飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(京)2021-0053】,作息模擬正常生物節(jié)律,室溫20～24℃,濕度50%～70%,標(biāo)準(zhǔn)大鼠籠飼養(yǎng),高脂飼料由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2019-0010】。所有操作均符合北京體育大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(批準(zhǔn)號(hào):2019094A)。

1.1.2 主要試劑與儀器

姜黃素(純度:95%,寧波中藥制藥股份有限公司,批號(hào):CP20191007);蘇木精伊紅染液(Servicebio公司,批號(hào):G1005)、一抗(兔抗):閉鎖小帶蛋白-1(zonaoccludens-1,ZO-1) (Immunoway 公司,批號(hào):YN1410)、二抗:辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(天德悅公司,批號(hào):S004)、糞便DNA 小提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,批號(hào):IVD3301-50)。病理切片機(jī)(徠卡,德國(guó));脫水機(jī)(DIAPATH,意大利);高速組織研磨儀(Servicebio,中國(guó));酶標(biāo)檢測(cè)儀(Thermo FC,美國(guó));VeritiProTMPCR 儀(ABI,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)條件

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后稱重,使用隨機(jī)數(shù)字表法分組,分為普通飲食+安靜組(CON 組)、高脂飲食+安靜組(HDC 組)、高脂飲食+姜黃素+安靜組(HDM 組)、高脂飲食+有氧運(yùn)動(dòng)組(HDE 組)和高脂飲食+姜黃素+有氧運(yùn)動(dòng)組(HDME 組),每組8只,共5 組。各組自由攝食飲水;CON 組普通飼料喂養(yǎng),其他各組高脂飼料喂養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[8]確定姜黃素實(shí)驗(yàn)劑量為200 mg/(kg·d)。

1.2.2 干預(yù)手段

第3 周,HDM 組和HDME 組訓(xùn)練前0.5 h 灌胃姜黃素溶液,每天1 次,其余各組均以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃;HDE 組和HDME 組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)[9],坡度5°,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度:70%～75%最大攝氧量,運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng):60 min,頻率:每天1 次,每周6 d,訓(xùn)練周期:6 周,其他組無(wú)任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)取材

末次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后24 h 取材。取材前稱重,質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%烏拉坦麻醉,腹主動(dòng)脈取血,靜置2 h 后3000 r/min 離心10 min 制備血清。冰上取盲腸部位腸道內(nèi)容物,置于凍存管中,-80℃冰箱凍存待測(cè)。取盲腸全段,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液沖洗干凈后分為兩部分,部分組織置于4%多聚甲醛溶液固定,其余組織存于液氮中速凍,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

漂亮的銷售數(shù)據(jù)和新興的電商模式所蘊(yùn)含的經(jīng)濟(jì)力量背后，是對(duì)其所反映的社會(huì)文化、民生等問(wèn)題的思考，這一思考已經(jīng)超越國(guó)界。例如“雙十一”便捷快速、江浙滬包郵、爆倉(cāng)越來(lái)越少等優(yōu)點(diǎn)，就曾引發(fā)某些國(guó)家民眾對(duì)本國(guó)低效郵政系統(tǒng)強(qiáng)烈抗議和吐槽。去年的“雙十一”更是有阿里等國(guó)內(nèi)電商自組的快遞公司進(jìn)入俄羅斯等國(guó)家，實(shí)現(xiàn)了國(guó)外買家最快一個(gè)小時(shí)后收貨的“夙愿”。全球化就通過(guò)這樣的“毛細(xì)血管”逐步臻于完善，各大網(wǎng)購(gòu)平臺(tái)帝國(guó)正在用無(wú)與倫比的購(gòu)物體驗(yàn)征服全世界。

1.2.4 血清血脂水平的測(cè)定

全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C) 和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)。

1.2.5 HE 染色檢測(cè)大鼠盲腸組織形態(tài)

制備大鼠盲腸組織石蠟切片,切片入蘇木素染液染3～5 min,自來(lái)水洗,分化液分化,自來(lái)水洗,返藍(lán)液返藍(lán),流水沖洗。切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min,入伊紅染液染色5 min。切片依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ5 min -無(wú)水乙醇Ⅱ5 min-無(wú)水乙醇Ⅲ5 min -二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min 透明,中性樹膠封片。最后顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。圖像中細(xì)胞質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.6 Western Blot 檢測(cè)盲腸組織ZO-1 蛋白表達(dá)

稱取適量大鼠盲腸組織,加入RIPA 蛋白提取劑勻漿,4℃離心提取后,使用BCA 方法進(jìn)行蛋白定量,電泳時(shí)上樣量為20 μg。一抗ZO-1(1/1000)4℃孵育過(guò)夜。次日洗膜并加入一抗相同種屬的二抗(1/10000)孵育2 h。TBST 洗膜6 次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,凝膠成像儀中顯像。β-actin 為內(nèi)參。

1.2.7 16S rDNA 基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸道菌群

取適量盲腸內(nèi)容物,對(duì)內(nèi)容物腸道菌群DNA 樣本V3-V4 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、文庫(kù)制備、文庫(kù)質(zhì)檢、定量,使用設(shè)定的TAG 序列進(jìn)行樣本區(qū)分。PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán);72℃終端延伸8 min,4℃保存。采用Illumina Hiseq 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.8 生物信息學(xué)分析

參考Silva 數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)97%相似度將序列聚類獲得操作分類單元,并進(jìn)行分類注釋[10]?；诓僮鞣诸悊卧垲惤Y(jié)果,根據(jù)線性判別分析(liner discriminant analysis,LDA)進(jìn)行LEfSe 多級(jí)物種差異判別分析,并找出組間具有顯著差異的物種[11];使用Rstudio 軟件分析群落的多樣性及差異并制圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠血脂水平的影響

TC:與CON 組相比,HDC 組顯著升高(P＜0.05);與HDC 組相比,HDM 組、HDE 組、HDME 組顯著降低(P＜0.05);與HDME 組相比,HDM 組顯著升高(P＜0.05)。TG:與CON 組相比,HDC 組顯著升高(P＜0.05);與HDC 組相比,HDM 組、HDE組、HDME 組顯著降低(P＜0.05)。HDL-C:與CON組相比,HDC 組顯著降低(P＜0.05);與HDC 組相比,HDE 組顯著升高(P＜0.05)。LDL-C:與CON組相比,HDC 組顯著升高(P＜0.05);與HDC 組相比,HDME 組顯著降低(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠血脂水平的影響(n=8,)Table 1 Effects of curcumin and/or aerobic exercise on lipid levels in dyslipidemia rats (n=8,)

表1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠血脂水平的影響(n=8,)Table 1 Effects of curcumin and/or aerobic exercise on lipid levels in dyslipidemia rats (n=8,)

注:與CON 組相比,*P ＜0.05;與HDC 組相比,#P ＜0.05;與HDME 組相比,△P ＜0.05。Note.Compared with group CON,*P ＜0.05.Compared with group HDC,#P ＜0.05.Compared with group HDME,△P ＜0.05.

2.2 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠盲腸組織形態(tài)的影響

CON 組腸道紋理清晰,無(wú)炎癥浸染;杯狀細(xì)胞清楚且內(nèi)部無(wú)浸染。與CON 組相比,HDC 組細(xì)胞核數(shù)量減少,腸道紋理模糊,出現(xiàn)炎癥浸染;杯狀細(xì)胞不清楚且內(nèi)部出現(xiàn)炎癥浸染;與HDC 組相比,HDM 組、HDE 組、HDME 組腸道紋理清晰;杯狀細(xì)胞清楚且內(nèi)部出現(xiàn)較少的炎癥浸染;其中HDME 組改善更為顯著(見(jiàn)圖1)。

圖1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠盲腸組織形態(tài)的影響Figure 1 Effects of curcumin and/or aerobic exercise on cecal tissue morphology in dyslipidemia rats

2.3 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠盲腸組織ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

盲腸組織ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá):與CON 組相比,HDC 組顯著降低(P＜0.05);與HDC 組相比,HDM組、HDE 組、HDME 組顯著升高(P＜0.05);與HDME 組相比,HDM 組、HDE 組ZO-1 蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠盲腸組織ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Figure 2 Effects of curcumin and/or aerobic exercise on cecal ZO-1 expression in dyslipidemia rats

2.4 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

Alpha Diversity 多樣性通常用于衡量物種多樣性及均勻度[12]。其中Chao1 指數(shù)用于衡量物種多樣性,Simpson 指數(shù)用于衡量物種均勻度。與CON組比,HDC 組大鼠腸道菌群Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)顯著降低(P＜0.05);與HDC 組比,HDM 組、HDE 組和HDME 組大鼠糞便菌群Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)顯著升高(P＜0.05);與HDME 組比,HDM 組、HDE 組有降低趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

Beta Diversity 多樣性用于分析個(gè)體間微生物組成的相似性[12]。CON 組與HDC 組大鼠腸道菌群分離,無(wú)重疊部分;HDM 組、HDE 組、HDME 組分別與HDC 組分離,且與CON 組重疊,HDME 組重疊百分比最大(見(jiàn)圖3)。

圖3 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠腸道菌群豐度及多樣性的影響Figure 3 Effects of curcumin and/or aerobic exercise on intestinal microflora abundance and diversity in dyslipidemia rats

為進(jìn)一步揭示各組大鼠腸道菌群基因組特征,對(duì)5 組大鼠腸道菌群類群進(jìn)行LDA 分析,統(tǒng)計(jì)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)。圖4A 是5 組樣本從門水平到屬水平的LDA 值,基柱越長(zhǎng)代表該分類單元的差異越顯著。CON 組、HDC 組、HDM 組、HDE組、HDME 組起重要作用的生物標(biāo)識(shí)分別有13 個(gè)、10 個(gè)、6 個(gè)、1 個(gè)、11 個(gè)。圖4B 擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、Papillibacter、Elusimicrobiaceae 等差異最大的前4個(gè)屬在CON 組中富集;梭菌屬、厚壁菌屬、疣微菌屬等在HDC 組富集;Erysipelotrichaceae、Barnesiella 等在HDM 組富集;變形菌屬、Epsilonproteobacteria、螺桿菌屬在HDME 組富集(圖4)。

圖4 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂紊亂大鼠腸道菌群差異性的影響(LEfSe 分析)Note.A.Distribution of LDA scores.The screening threshold of biomarkers was LDA score=2,and the screened biomarkers were arranged according to LDA score value from large to small.B.Clustering tree of species.Phylogenetic trees (phylum to genus level) were constructed from the selected LDA results.Different color nodes represent microbial groups that are significantly enriched in corresponding groups and have significant influence on the differences between groups.The yellow nodes indicate that there is no significant difference in the distribution of bacteria at this level between the two groups.Figure 4 Effects of curcumin and/or aerobic exercise on intestinal microflora difference in dyslipidemia rats (LEfSe analysis)

3 討論

研究表明,宿主腸道菌群水平不僅取決于遺傳因素,還與年齡、飲食、生活環(huán)境等因素密切相關(guān)[13]。高脂飲食致血脂紊亂可誘發(fā)腸道菌群紊亂,破壞腸黏膜屏障完整性,影響脂質(zhì)的消化與吸收,嚴(yán)重危害人體健康[14-15]。Resta[16]研究發(fā)現(xiàn):高脂飲食干預(yù)后,大鼠在脂質(zhì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生次生膽汁酸、硫化氫等有害產(chǎn)物,損害結(jié)腸黏膜,破壞細(xì)菌賴以生存的腸道微環(huán)境。Chen 等[14]研究發(fā)現(xiàn),高脂肪飲食降低了大鼠腸道菌群的豐度和多樣性,擬桿菌門豐度降低和厚壁菌門的豐度增加。食物中的熱量可以被厚壁菌門吸收,從而促進(jìn)脂肪在宿主體內(nèi)的儲(chǔ)存,血清TC、TG 顯著升高。ZO-1 蛋白是構(gòu)成緊密連接必須的多域支架蛋白,在維持緊密連接結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著不可替代的作用[17]。作為標(biāo)志性蛋白,ZO-1 蛋白與腸黏膜屏障功能呈正相關(guān)[18]。ZO-1 蛋白正常表達(dá)可以維持腸黏膜屏障完整,并修復(fù)被損壞的腸道黏膜;其表達(dá)下調(diào)或活性降低則會(huì)影響細(xì)胞間緊密連接形成,阻礙腸黏膜發(fā)揮防御屏障功能,加劇有害細(xì)菌及毒素穿透腸道入血引發(fā)腸源性感染、腸漏的風(fēng)險(xiǎn)。血脂紊亂的發(fā)生與發(fā)展,會(huì)嚴(yán)重?fù)p害腸黏膜屏障緊密連接處的結(jié)構(gòu)域結(jié)合“橋接”ZO-1 蛋白[19]。調(diào)節(jié)腸道菌群不僅可有效改變腸黏膜屏障的完整性和腸道上皮細(xì)胞,還可調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝平衡[20]。生短鏈脂肪酸菌群是維持腸黏膜屏障完整性的關(guān)鍵因素[20]。生短鏈脂肪酸菌屬豐度的增加,有效促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成,可間接刺激杯狀細(xì)胞分泌粘液增強(qiáng)腸黏膜屏障功能和完整性,上調(diào)ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平[20]。本研究中HDC 組大鼠8 周高脂飲食后血脂水平異常,腸道菌群多樣性和均勻度降低(生短鏈脂肪酸菌屬糞球菌屬、瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬豐度降低,厚壁菌門與擬桿菌門比值升高),與Chen等[14]研究相一致;ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低,腸黏膜屏障出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn),通透性增強(qiáng),說(shuō)明8 周高脂飲食不僅可誘發(fā)大鼠血脂紊亂,還可誘發(fā)大鼠腸道菌群紊亂,腸黏膜屏障功能及完整性破壞,建模成功。

姜黃素能夠促進(jìn)腸道益生菌生長(zhǎng),有效改善腸道菌群紊亂,保護(hù)腸黏膜屏障完整[21]。Li 等[22]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過(guò)降低高脂飲食鼠厚壁菌門/擬桿菌門比值及脫硫弧菌豐度,升高阿克曼氏菌屬和生短鏈脂肪酸菌屬豐度,預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性。阿克曼氏菌可通過(guò)增加大鼠胃腸道黏液層厚度,改善胃腸道粘膜屏障,從而阻止有害物質(zhì)通過(guò)腸道進(jìn)入血液,阻止脂肪在體內(nèi)大量?jī)?chǔ)存,改善肥胖引起的高血脂相關(guān)代謝性疾病[23]。短鏈脂肪酸能夠通過(guò)抑制肝脂肪生成酶活性和調(diào)節(jié)膽固醇在血液和肝中的分布來(lái)降低TG 和TC 水平[24-25]。Ghosh 等[26]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過(guò)改善腸黏膜屏障緊密連接結(jié)構(gòu),上調(diào)腸黏膜屏障蛋白o(hù)ccludin、ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平,保護(hù)高脂飲食鼠的腸黏膜屏障。運(yùn)動(dòng)能夠有效促進(jìn)腸道菌群的多樣性和均勻度。Evans 等[5]研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂飲食小鼠擬桿菌屬豐度的上升及放線菌屬和厚壁菌屬豐度的下降,有效降低厚壁菌門/擬桿菌門比值。人體實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)12 周有氧運(yùn)動(dòng)可有效增加老年女性腸道擬桿菌的相對(duì)豐度[27]。此外,有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)減少炎癥浸染的方式保護(hù)高脂飲食鼠腸黏膜屏障的形態(tài)和完整性[28]。

本研究中姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)均能提高血脂紊亂大鼠腸道菌群的多樣性和均勻度。在門水平上,厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著降低。在屬水平上,生短鏈脂肪酸菌瘤胃球菌屬、糞球菌屬豐度升高,有助于短鏈脂肪酸的生成。大量的短鏈脂肪酸有助于提高腸組織ZO-1 蛋白表達(dá)水平,修復(fù)受損腸道黏膜屏障,有效降低血脂水平,與相關(guān)研究較為一致。其中HDME 組效果最佳,說(shuō)明聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單一干預(yù)。

4 結(jié)論

姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)均能夠顯著改善血脂紊亂大鼠血脂水平異常及腸道菌群的多樣性和均勻度,提高有益菌群的豐度;上調(diào)ZO-1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平,修復(fù)受損腸黏膜屏障,調(diào)節(jié)腸道腸能。其中聯(lián)合干預(yù)效果最佳。