大豆多肽發(fā)酵液脫色及不同超濾組分抗氧化研究

李樂樂 楊學(xué)為 羅雪韻 范柳 尹樂斌

摘 要：為探究豆渣發(fā)酵液的脫色效果和不同分子質(zhì)量大豆多肽的體外抗氧化能力，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣酶解液制備大豆多肽，利用活性炭脫色處理，再采用超濾分離將豆渣多肽發(fā)酵液分級出

5～10 kDa，3～5 kDa，500～3 000 Da和<500 Da的4個組分。分別研究4個組分的大豆多肽對DPPH自由基、OH自由基、ABTS陽離子自由基的清除能力。結(jié)果表明，最佳脫色條件為活性炭添加量1%、脫色溫度50 ℃、脫色時間45 min;不同組分對3種自由基均有一定的清除活性，其中<500 Da的組分對ABTS陽離子自由基清除活性最強(qiáng)，5～10 kDa多肽組分對DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，3～5 kDa多肽組分對-OH自由基清除活性最強(qiáng)。本研究為大豆多肽的生理活性研究提供了理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：豆渣;大豆多肽;超濾;抗氧化活性

Study on Decolorization of Soybean Polypeptide Fermentation Broth and Antioxidant Activity of Different Ultrafiltration Components

LI Lele1， YANG Xuewei1， LUO Xueyun1， FAN Liu1， YIN Lebin1，2*

（1.School of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Soybean Products Processing and Safety Control， Shaoyang 422000， China）

Abstract： In order to explore the decolorization effect of soybean residue fermentation broth and the antioxidant capacity of soybean peptides with different molecular weight in vitro， soybean peptides were prepared from soybean residue enzymatic hydrolysate fermented by Bacillus subtilis， decolorized by activated carbon， and then separated by ultrafiltration. The soybean residue polypeptide fermentation broth was divided into 4 components of 5～10 kDa， 3～5 kDa， 500～3 000 Da and <500 Da. The scavenging abilities of four components of soybean peptides to DPPH radical， OH radical and ABTS cationic radical were studied. The results showed that the optimum decolorization conditions were 1% of activated carbon， 50 ℃ decolorization temperature and 45 min decolorization time; different components have certain scavenging activities against three kinds of free radicals. Among them， the component less than 500 Da has the strongest scavenging activity against ABTS cationic free radicals， the

5～10 kDa polypeptide component has the strongest scavenging activity against DPPH free radicals， and the

3～5 kDa polypeptide component has the strongest scavenging activity against -OH free radicals. This study provides theoretical guidance for the study of physiological activity of soybean peptides.

Keywords： bean dregs; soybean polypeptide; ultrafiltration; antioxidant activity

豆渣是豆制品加工副產(chǎn)物，其富含膳食纖維、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分。由于豆渣有機(jī)物豐富，水分大且口感粗糙，導(dǎo)致其處理成本高昂，豆渣的綜合利用也成為豆制品企業(yè)急需解決的問題[1]。大豆多肽即肽基蛋白水解物，其主要是通過酶解和微生物發(fā)酵使大分子蛋白水解為小分子多肽，研究表明大豆多肽具有抗氧化、降血壓、降血糖和抗疲勞等生理活性[2-4]。不同分子量大豆多肽生理活性也存在差異。鄧成萍等[5]運(yùn)用中性蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶水解制備大豆多肽，并超濾分離成4個多肽組分，同時探究不同分子量多肽的物理性質(zhì)和生物活性，研究發(fā)現(xiàn)小分子大豆多肽的DPPH自由基清除能力和ACE抑制活性顯著增強(qiáng)。

超濾分離是一種應(yīng)用廣泛的膜分離技術(shù)，在壓力差作用下利用超濾膜將不同分子量物質(zhì)分離，具備操作簡單、成本低、適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)勢，通常被用于分離純化多肽、多糖等活性成分[6]。豆渣經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆多肽，其發(fā)酵液顏色較深。本實(shí)驗(yàn)利用活性炭對發(fā)酵液進(jìn)行脫色處理，超濾分離純化不同組分多肽，并對其抗氧化活性進(jìn)行比較分析，以深入了解不同組分多肽的生理活性，同時為探究大豆多肽的純化技術(shù)提供有效的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與菌株

豆渣由實(shí)驗(yàn)室提供;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），綠隴生物有限公司。

1.1.2 試劑

活性炭，臺山市粵僑試劑塑料有限公司;ABTS，分析純，安徽酷兒生物工程有限公司;DPPH，分析純，南京都萊生物技術(shù)有限公司;抗壞血酸，福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;VELOCITY 14R臺式冷凍離心機(jī)，Dynamica公司;D-7型紫外分光光度計，南京菲勒儀器有限公司;微濾機(jī)組，使用纖維膜和不同分子量的超濾膜，上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆多肽的制備

回收干凈的濕豆渣利用精細(xì)磨粉碎成糊漿狀，加入純化水調(diào)整豆渣的干基使其達(dá)到5.8%，在豆渣糊中加入纖維素酶水解形成豆渣酶解液，將其置于80 ℃水浴鍋滅酶10 min（將pH值調(diào)整為7.2）。將枯草芽孢桿菌接種在豆渣酶解液中開始液態(tài)發(fā)酵（控制發(fā)酵條件為溫度37 ℃，接種量3%，時間60 h），將發(fā)酵液在冷凍離心機(jī)下以10 000 r/min離心10 min后取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 活性炭脫色處理

由于豆渣發(fā)酵液顏色呈黃褐色，因此考慮利用活性炭進(jìn)行脫色處理。量取20 mL發(fā)酵液置于錐形瓶中，在一定的活性炭用量（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%）、脫色溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、脫色時間（15 min、30 min、45 min、

60 min和75 min）下對豆渣發(fā)酵液進(jìn)行脫色處理，脫色液經(jīng)抽濾和離心后，在400 nm波長下測定脫色前后吸光度變化，在540 nm波長下測定脫色前后多肽含量變化，以脫色率和多肽保留率為指標(biāo)，確定最佳脫色條件。脫色率和多肽保留率計算公式如下：

（1）

（2）

式中：A1為脫色前吸光度;A2為脫色后吸光度;B為脫色后多肽含量，%;B0為脫色前多肽含量，%。

1.2.3 超濾分離

將脫色處理后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍離心（5 200 r/min，

12 min），分別通過預(yù)先清洗的纖維膜和10 kDa、5 kDa、3 kDa和500 Da的超濾膜，壓力調(diào)整為

40 MPa，25 ℃下進(jìn)行回流超濾。發(fā)酵液最初體積為4 000 mL，起初將發(fā)酵液通過含有纖維膜的柱子以除去其中的不溶性雜質(zhì)，然后由大到小經(jīng)過10 kDa、5 kDa、 3 kDa、500 Da超濾膜，分階段收集5～

10 kDa、3～5 kDa、500～3 000 Da和<500 Da的組分，將不同組分樣品進(jìn)行冷凍干燥，凍干粉置于

-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多肽的抗氧化性

測定不同多肽組分的ABTS陽離子清除率、DPPH自由基清除率、OH自由基清除率[7-8]。根據(jù)不同自由基在不同波長下存在特征吸收峰確定波長，由于自由基與抗氧化劑共存時，其體系溶液顏色變淺，故可以用于判定多肽樣品的抗氧化能力，根據(jù)不同波長下樣品的吸光度值即可得到不同自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性炭脫色處理

2.1.1 脫色溫度對發(fā)酵液脫色效果的影響

如圖1所示，隨著脫色溫度提高，發(fā)酵液脫色率呈先快速上升后趨于緩慢下降的趨勢，多肽保留率呈先急劇下降后緩慢下降得趨勢，當(dāng)脫色溫度低于50 ℃時，隨著溫度升高，發(fā)酵液脫色率快速升高且多肽保留率下降明顯，當(dāng)溫度超過50 ℃時，脫色率和多肽保留率緩慢降低，可能是由于溫度升高，體系中分子加快擴(kuò)散，加速了活性炭對色素及其他分子的吸附，但當(dāng)溫度過高，會使活性炭的解吸大于吸附，同時也會使部分活性成分損失[9]。綜合考慮，選擇脫色溫度50 ℃為最佳。

2.1.2 脫色時間對發(fā)酵液脫色效果的影響

如圖2所示，隨著脫色時間的延長，發(fā)酵液脫色率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢，多肽保留率呈先急劇下降后趨于平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)脫色時間>45 min，發(fā)酵液脫色率和多肽保留率相對穩(wěn)定，這是由于活性炭吸附存在吸附和解析的動態(tài)平衡，在脫色時間45 min時到達(dá)了平衡點(diǎn)。綜合考慮，選擇脫色時間45 min為最佳。

2.1.3 活性炭添加量對發(fā)酵液脫色效果的影響

如圖3所示，隨著活性炭添加量的增加，脫色率升高而多肽保留率降低，當(dāng)活性炭添加量>1%時，盡管脫色效果顯著增強(qiáng)，但是多肽損失嚴(yán)重，這是由于活性炭過量，其吸附表面積增大，吸附能力也進(jìn)一步提高，在此過程中，活性炭不僅除去部分有色雜質(zhì)和臭味，同時也吸附了多糖、蛋白質(zhì)等有機(jī)物，導(dǎo)致小分子多肽損失嚴(yán)重。綜合考慮，選擇活性炭添加量為1%為最佳。

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 ABTS陽離子清除率測定

ABTS與過硫酸鉀反應(yīng)，生成藍(lán)綠色的ABTS自由基在734 nm處有特征吸收峰，當(dāng)與抗氧化劑共存時，體系顏色變淺，在734 nm處的吸光度下降，因其反應(yīng)靈敏、操作簡便而被廣泛應(yīng)用于抗氧化活性指標(biāo)的評定[10]。不同多肽組分對ABTS陽離子清除效果如圖4所示，發(fā)酵液的不同超濾組分樣品均具有一定的清除效果，<500 Da的多肽樣品比其他組分對ABTS陽離子清除效果強(qiáng)。

2.2.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，由于其具有單電子，其醇溶液在517 nm具有明顯的吸收峰，當(dāng)DPPH中單電子與其他抗氧化劑中的單電子配對時，517 nm處吸光度降低，因此常被用來分析體外抗氧化實(shí)驗(yàn)[10]。不同多肽組分對DPPH自由基清除效果如圖5所示，發(fā)酵液的不同超濾組分樣品對DPPH自由基都具有一定的清除效果，其中5～10 kDa的多肽樣品比其他組分清除效果強(qiáng)。

2.2.3 OH自由基清除率測定

OH自由基是活性氧中對生物體毒害作用最強(qiáng)的一種自由基，與細(xì)胞衰老和損傷有關(guān)[11]。不同多肽組分對OH自由基清除效果如圖6所示，發(fā)酵液的不同超濾組分樣品對OH自由基都具有一定的清除效果，其中3～5 kDa的多肽樣品比其他組分清除效果強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣酶解液制備大豆多肽，利用活性炭脫色處理，再通過超濾分離不同組分多肽，并研究不同組分的抗氧化能力。結(jié)果表明，最佳脫色條件為活性炭添加量1%、脫色溫度50 ℃、脫色時間45 min;不同組分對3種自由基均有一定的清除活性，其中<500 Da多肽組分對ABTS陽離子自由基清除活性最強(qiáng)，5～10 kDa多肽組分對DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，3～5 kDa對OH自由基清除活性最強(qiáng)。本研究為探究大豆多肽生理活性和開發(fā)前景提供數(shù)據(jù)參考。

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