不同生長期黃芩莖葉中野黃芩苷的含量變化＃*

王圣常 田素青 候愛霞 靳維榮

1.梁山縣中醫(yī)醫(yī)院中藥房,山東 濟(jì)寧 272600;2.濟(jì)寧市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,山東 濟(jì)寧 272000;3.泰安中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,山東 泰安 270000;4.山東省聊城市人民醫(yī)院中藥研究室,山東 濟(jì)寧 252004

有關(guān)黃芩的記載,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中可以看到,黃芩屬于唇形科多年的草本植物,黃芩主要分布于我國的華北、東北和西南等地區(qū)。黃芩作為一種中藥材,中醫(yī)上在進(jìn)行用藥時,主要使用的時黃芩根,暴露在地上的黃芩莖和黃芩葉通常不作為中醫(yī)用藥的材料。但是,在進(jìn)行實(shí)際采摘的過程中,很多非傳統(tǒng)黃芩用藥的部分,比如黃芩的葉、莖部與花朵等也和黃芩根一起采收了。且這部分中藥材的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于黃芩根的產(chǎn)量。但黃芩根之上的莖、葉與花都未得到充分利用,不僅造成了環(huán)境污染,還浪費(fèi)了大量資源[1]。黃芩地上部分莖葉所含黃芩苷含量遠(yuǎn)低于根部,但野黃芩苷含量高達(dá)黃芩苷的10倍,幾乎與根部持平[2]。

在中醫(yī)范疇內(nèi),黃芩性寒,有苦味,有清熱解毒、下火燥濕、止血安胎的功效。而且,現(xiàn)代研究表明,黃芩莖葉具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降壓、降血脂、解熱、鎮(zhèn)痛、提高機(jī)體免疫力等藥理學(xué)活性和高效低毒的特點(diǎn),主要化學(xué)成分包括黃芩苷、野黃芩苷等黃酮類化合物[3]。過氧化物酶(POD)在植物體內(nèi)比較常見,是一種活性比較高的酶。而且,在不同物種的不同生長時期,或是同一物種的同一時期的不同器官,以及同一器官不同組織內(nèi),都存在特異性。近幾年,黃芩莖葉的研究已成為熱點(diǎn),通過我們前期對不同時期黃芩成分的研究,以及黃芩不同器官在不同采收期的過氧化物同工酶研究中發(fā)現(xiàn)不同生長期的黃芩POD同工酶種類發(fā)生變化。植物體內(nèi)各種酶類變化會引起相應(yīng)控制的化學(xué)成分變化,黃芩莖葉中以野黃芩苷為代表的黃酮類是否也發(fā)生相應(yīng)的變化,目前還沒有研究。本文采用反相高效液相色譜梯度洗脫法對不同生長期黃芩莖葉中野黃苷含量進(jìn)行檢測,以期為黃芩莖葉最佳采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究材料

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100,美國安捷倫科技公司)；色譜純:甲酸、甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心),其余試劑為分析純；野黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號27740ˉ01ˉ8)。

1.2 試驗(yàn)藥材 黃芩莖葉:此次試驗(yàn)使用的樣品已經(jīng)由山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定,鑒定結(jié)果為本研究中黃芩莖葉均為干燥的黃芩莖葉。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察本次研究中黃芩苷、野黃芩苷線性范圍及一年中不同采收期黃芩莖葉中野黃芩苷的含量。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用比較常用的C18高效液相色譜儀,色譜柱:Phenomenex Prodigy ODS3一C18(4.60 mm x 250 mm,5μm),流動相:甲醇ˉ0.02%(28:72)甲酸,流速為1.0ml/min,檢測波長為276nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣體積為5μL。將流動相梯度洗脫時間程序進(jìn)行調(diào)整,見表1。

表1 梯度洗脫時間表

2.2 對照品溶液制備 精密稱取適量野黃芩苷對照品,用甲醇配制成濃度分別為0.096mg·mlˉ1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取黃芩莖葉各0.3g,精密稱取后,加入濃度70%的40ml乙醇,加熱回流3.0 h,放冷,濾過,濾液置100ml容量瓶中,取少量的70%乙醇對容器和殘?jiān)M(jìn)行分次洗滌,洗液濾入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻,即得。

2.4 線性范圍的考察 精密量取上述野黃芩苷對照品溶液,照品溶液,分別進(jìn)樣5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,20.0μl,按上述色譜條件測定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積值為縱坐標(biāo)(Y),得回歸方程:Y＝196.4X＋216.55,r＝0.9994,結(jié)果表明野黃芩苷進(jìn)樣量在0.470 0～1.8800μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果圖2和表2。

表2 野黃芩苷、黃芩苷線性范圍Table 4-8 Linear ranges of scutellarin and baicalin

圖2 野黃芩苷、黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Linear ranges of scutellarin and baicalin

2.5 精密度考察 精密吸取對照品15μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定野黃芩苷峰面積,其RSD為0.3%,說明儀器精密度和方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液5μl,分別測定0,1,2,3,5,9,12,24,48,72 h野黃芩苷在72h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.86%,說明樣品在72 h內(nèi)穩(wěn)定,表明樣品溶液在72 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

3 樣品重復(fù)性良好。

3.1 樣品含量測定取黃答莖葉各0.3g,精密稱定,按“2.1”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法對黃答莖和葉進(jìn)行含量測定,每批平行測定3份,計(jì)算其含量,樣品圖譜見圖5～7。結(jié)果見表5～7。

圖5 .混合對照品HPLC圖

Fig.5 HPLC of reference substance

圖6 .黃芩莖葉HPLC圖譜

Fig.6 HPLC of Radix Scutellaria

表3 黃芩莖葉中黃酮類成分的含量(n＝3)

圖4 11黃芩莖葉中黃酮類成分的含量

2.6 不同生長期黃芩莖葉中野黃芩苷含量變化 采收1年中不同生長期的黃芩莖葉約1g,精密稱定后,按“2.1”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法對野黃芩苷的含量進(jìn)行測定,測定總黃酮中的野黃芩苷含量,見表4。

表4 年中不同生長期黃芩莖葉中野黃芩苷含量(n＝3)

4 討 論

黃芩在中藥材中屬于大宗藥材,而我國每年都會生產(chǎn)大量的黃芩莖葉,但對于黃芩藥材的管控并無嚴(yán)格規(guī)定。近幾年來,隨著有關(guān)黃芩莖葉的研究不斷深入,如何充分利用黃芩莖葉資源也成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。由于目前國家和地方尚無明確的黃芩莖葉藥材使用標(biāo)準(zhǔn),也無有關(guān)黃芩莖葉研制、生產(chǎn)和經(jīng)營等方面的明確規(guī)定,導(dǎo)致黃芩莖葉藥材的管理也受到了限制。因此,加強(qiáng)對黃芩莖、葉等不同部位的野黃芩苷含量進(jìn)行測定,既有助于明確黃芩莖葉的化學(xué)成分生物合成機(jī)理,也有利于確定黃芩莖葉藥材最佳的采收期。同時,還能夠?yàn)辄S芩莖葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

在前期的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用高效液相色譜法對黃芩莖、葉和花進(jìn)行檢測是,黃芩莖、黃芩葉和黃芩花中的野黃芩苷色譜峰信號比較強(qiáng),因此,試驗(yàn)可以選擇野黃芩苷作為檢測的指標(biāo)。并對采用不同提取方法對野黃芩含量檢測結(jié)果的影響進(jìn)行分析,結(jié)果顯示采用70%乙醇作為提取溶劑的時候,先將其靜置半小時,再使用超聲進(jìn)行處理半小時,最后測定的黃芩莖、葉和花中野黃芩苷含量最多。因?yàn)榭紤]到超聲提取的測定方法比較簡單易操作,因此,在進(jìn)行研究時,可以選擇70%乙醇超聲檢測的方式進(jìn)行提取。通過掃描紫外光譜的結(jié)果顯示,335nm波長下吸收最大,因此在試驗(yàn)時可以選擇335nm波長作為檢測的波長。

在本次研究中,采用HPLC法來測定黃芩莖葉中野黃芩苷的含量,并分別對一年中不同生長期內(nèi)黃芩莖葉中的野黃芩苷進(jìn)行測定,研究結(jié)果顯示不同生長時期黃芩莖、葉中的野黃芩苷含量也存在變化,而7、8月份黃芩莖葉中的野黃芩苷含量比其他月份的野黃芩苷含量更高。研究結(jié)果說明,黃芩莖葉最佳的采收期是秋季7、8月份的時候。從化學(xué)成分上看,野黃芩苷是黃酮類化合物,通常存在于糖結(jié)合或是游離狀態(tài)的中藥材中。在植物的葉子、花朵與果實(shí)等組織中,野黃芩苷主要以苷的形式存在,在植物莖部則以游離苷元的狀態(tài)存在[5]。在植物體內(nèi)的生物合成途徑中,黃酮類化合物多為復(fù)合型,是乙酸ˉ丙二酸和莽草酸途徑生物合成的產(chǎn)物。而查爾酮異構(gòu)酶和查爾酮合成酶經(jīng)形成二氫黃酮,再由植物體內(nèi)其他酶作用后,形成野黃芩苷。由于上述兩種原因,黃芩葉中野黃芩苷的含量比黃芩莖中的含量高。

黃芩作為多年草本植物,黃芩莖葉最佳的開花期是7ˉ8月份的時候,8ˉ9月份是果實(shí)成熟期。這個時間在北方正值夏秋交替之際,夏天植物由營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)為生殖生長期,受到氣候的影響,黃芩莖葉也逐漸開始枯萎、凋落。除此之外,黃芩葉比較脆,采收、晾曬和運(yùn)輸期間容易出現(xiàn)脫落的情況,郭梅[6]等人的研究結(jié)果顯示,同一生長期內(nèi)黃芩莖、葉中的野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩苷和木犀草素等黃酮類化合物含量差異較大。其中,黃芩莖、葉中的野黃芩苷含量高于其他3種黃酮類化合物含量,該研究結(jié)果與本次研究的結(jié)果有相符之處。另外,郭梅等人的研究結(jié)果顯示黃芩葉中野黃芩苷的含量在5月最高,主要原因在于5ˉ6月份是黃芩莖葉生長期,處于地上部分的黃芩葉生長旺盛,黃芩根部合成的黃酮類化合物轉(zhuǎn)移至地上部分,因而使得黃芩葉中的野黃芩含量增加。另外,從本次研究測定的結(jié)果看,黃芩葉中的黃芩苷含量明顯比黃芩莖中的黃芩苷含量高,因此,在黃芩莖葉的藥材質(zhì)量檢測中還需要添加有關(guān)黃芩莖葉的檢查項(xiàng)目,并對稱取的重量設(shè)定標(biāo)準(zhǔn),以便為黃芩莖葉藥材的質(zhì)量判斷,提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

綜上所述,高效液相色譜法可以測定不同生長期黃芩莖葉中也黃芩苷的含量水平,確定黃芩莖葉最佳采收期,能夠?yàn)辄S芩莖葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。