UDT1/TDR基因過表達(dá)對(duì)水稻育性的影響

宋露，唐佳琦，田曉杰，卜慶云

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

0 引 言

水稻是重要的糧食作物，世界上一半以上人口都以其為主食。而水稻的產(chǎn)量與育性密切相關(guān)，其雄性生殖器官正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育是水稻繁衍過程的關(guān)鍵保障[1]。水稻雄性不育(MS，male sterility)是雄性器官發(fā)育異常，花粉不具有受精活力，但雌性器官發(fā)育和功能均正常的現(xiàn)象[2]。

在水稻雄性生殖器官花藥的結(jié)構(gòu)中，花藥壁由外到內(nèi)分別由表皮層、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層這4層不同的細(xì)胞組成。絨氈層位于花藥壁的最內(nèi)層，直接與小孢子接觸，絨氈層的正常發(fā)育能保障花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂周期正常完成，在發(fā)育后期它分泌胼胝質(zhì)降解酶來分解胼胝質(zhì)，使小孢子釋放出來，并為花粉粒的進(jìn)一步成熟提供營(yíng)養(yǎng)，絨氈層細(xì)胞向雄配子體運(yùn)輸物資的直接通道是烏氏體[3]。絨氈層的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的過程，主要分為2個(gè)階段：分化形成[4]和退化降解[5]。絨氈層在小孢子母細(xì)胞形成期初步形成，由次級(jí)壁細(xì)胞經(jīng)過兩次分裂后形成于花藥壁的最內(nèi)層[4]；從小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂初期至小孢子早期，絨氈層細(xì)胞質(zhì)顏色開始逐漸加深，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡信號(hào)，在小孢子中期絨氈層開始退化降解，最終在成熟花粉期完全消失[5]。調(diào)控絨氈層發(fā)育的基因大多編碼轉(zhuǎn)錄因子，通過直接或間接調(diào)控絨氈層的分化形成或退化降解，進(jìn)而使絨氈層的生理功能出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻，引起雄性不育。因此，解析相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能是了解水稻絨氈層發(fā)育調(diào)控的重要部分。

研究發(fā)現(xiàn)，bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控水稻絨氈層發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子[6]。其中，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子UDT1(UNDEVELOPEDTAPETUM1)是調(diào)控水稻絨氈層早期發(fā)育的關(guān)鍵基因，它參與次生壁細(xì)胞向成熟絨氈層的分化過程。在減數(shù)分裂前，突變體udt1-1的花藥壁和小孢子母細(xì)胞發(fā)育相對(duì)正常，但減數(shù)分裂期絨氈層異常空泡化，小孢子不能生成，絨氈層細(xì)胞降解延遲，最終導(dǎo)致無花粉型雄性不育，且無法結(jié)出可育籽粒[7]。另一編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的TDR(TAPETUMDEGENERATIONRETARDATION)通過正向觸發(fā)絨氈層細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)來調(diào)控水稻絨氈層的發(fā)育和降解，突變體tdr表現(xiàn)為絨氈層和中層PCD滯后以及花粉壁的缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致雄性完全不育[9]。UDT1和TDR都通過調(diào)控絨氈層標(biāo)記基因(OsC4、OsC6和OsCP1)的表達(dá)來調(diào)節(jié)絨氈層的發(fā)育和降解，這些基因在udt1和tdr突變體中顯著下調(diào)[8-9]。EAT1(ETERNALTAPETUM1)同樣是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，EAT1可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease，ASP)的表達(dá)，并可與TDR相互作用，作用于TDR的下游。eat1-1突變體的絨氈層細(xì)胞增厚，烏氏體形狀不規(guī)則，花藥發(fā)育和小孢子形成過程異常終止，造成雄性不育[10]。編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的TIP2(TDRINTERACTINGPROTEIN2)的突變體tip2影響了花藥的早期發(fā)育，其花藥壁內(nèi)藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層三層細(xì)胞不能正常分化形成，后期中層和絨氈層PCD中斷，導(dǎo)致小孢子母細(xì)胞發(fā)育停滯，造成雄性完全不育[11-12]。這些研究結(jié)果表明，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子影響水稻絨氈層的發(fā)育，對(duì)水稻花粉的育性產(chǎn)生了很大的影響。除編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的基因外，參與水稻花藥絨氈層發(fā)育調(diào)控的基因還有OsGAMYB[13-14]、PTC1(PERSISTENTTAPETALCELL1)[15]、DTC1(DEFECTIVETAPETUMCELLDEATH1)[16]、API5(APOPTOSISINHIBITOR5)[17]、EDT1(EARLIERDEGRADEDTAPETUM1)[18]、MTR1(MICROSPOREANDTAPETUMREGULATOR1)[19]、TIP3(TDRINTERACTINGPROTEIN3)[20]、BM1(BAYMAX1)[21]、OsMADS3[22]、OsMADS8[23]、OsAGO2[24]、OsALDH2b[25]等。

前人研究已經(jīng)表明了UDT1/TDR功能的缺失會(huì)嚴(yán)重影響絨氈層的發(fā)育進(jìn)而影響水稻的育性[7-9]，然而，UDT1/TDR過表達(dá)植株是否會(huì)影響水稻的育性目前尚不清楚，為了進(jìn)一步分析UDT1/TDR基因?qū)λ居缘挠绊?，本研究利用植物基因過表達(dá)技術(shù)，分別對(duì)水稻UDT1和TDR基因進(jìn)行過量表達(dá)，通過對(duì)獲得的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型觀察，明確了UDT1和TDR的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致水稻育性降低，豐富了UDT1/TDR對(duì)水稻育性的調(diào)控機(jī)理，也為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株

本研究以粳稻“龍粳11”為實(shí)驗(yàn)材料，獲得過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料。植株在哈爾濱(北緯45°)的室外，以25 cm×25 cm的植物間距種植于盆栽盒，自然長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株TOP10，農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和植物載體PC1390U均由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所水稻分子育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 UDT1/TDR基因的過表達(dá)載體構(gòu)建

利用超純總RNA提取試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取龍粳11幼穗的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara公司)作為PCR擴(kuò)增模板。在Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站(http://rice.uga.edu/)下載UDT1(LOC_Os07g36460)、TDR(LOC_Os02g02820)的基因序列并通過Primer 5設(shè)計(jì)引物序列。采用引物UDT1-CDS-F和UDT1-CDS-R(表1)擴(kuò)增UDT1基因的編碼區(qū)(coding sequence,CDS)序列；采用引物TDR-CDS-F和TDR-CDS-R(表1)擴(kuò)增TDR基因的CDS序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)BamHI和KpnI酶切的PC1390U載體片段連接構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TOP10，挑取單菌落于37 ℃，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后，利用快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取質(zhì)粒，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送交吉林庫美生物有限公司測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證無誤的即為成功構(gòu)建的過表達(dá)載體。

表1 本研究中所用的引物

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的UDT1、TDR過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)野生型龍粳11水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過濃度為60 mg·L-1的潮霉素(Hygromycin,Hyg)篩選抗性愈傷組織，分化獲得T0代過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株分子生物學(xué)檢測(cè)

將T0代轉(zhuǎn)基因植株種植于室外盆栽盒中，對(duì)每株T0代植株提取葉片的全基因組DNA，通過潮霉素基因特異引物HPT(表1)進(jìn)行PCR檢測(cè)，產(chǎn)物大小為900 bp的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株，種植并收獲種子用于下一代種植。將T0代收獲的種子室溫浸種1 d，37 ℃催芽2 d，育秧后種植于室外盆栽盒中，在苗期提取T1代植株葉片基因組DNA，繼續(xù)利用引物HPT鑒定，選擇鑒定為陽性的株系用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株UDT1/TDR基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)檢測(cè)

為了檢測(cè)目的基因UDT1和TDR在野生型和過表達(dá)材料UDT1-OE/TDR-OE中的表達(dá)量，提取對(duì)照材料龍粳11和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株UDT1-OE/TDR-OE的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)目的基因表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株表型分析

穎花觀察：水稻抽穗后開花前1 d，去掉小穗的穎殼，在顯微鏡(奧林巴斯SZX16)下觀察雄蕊和雌蕊的顏色和形態(tài)。

花粉染色觀察：水稻抽穗后開花前1 d，將樣品固定在甲醛-乙酸-乙醇(FAA)溶液中，進(jìn)行1% I2-KI(1%I2，8%KI，W/V)染色鏡檢，取穗部上中下各3個(gè)小穗進(jìn)行觀察。鏡檢時(shí)，打開穎殼，小心剝離出花藥，置于載玻片上，滴加20 μL的I2-KI滴劑，用鑷子搗碎花藥，釋放出花粉粒，于顯微鏡(奧林巴斯BX53)下觀察花粉粒的活力。

成熟期穗部觀察：成熟期觀察水稻穗部的結(jié)實(shí)情況并統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 UDT1/TDR基因的過表達(dá)載體構(gòu)建

采用PC1390U載體作為UDT1和TDR植物過量表達(dá)載體，該載體含有潮霉素植物選擇標(biāo)記基因，以組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)(圖1A)。采用基因特異引物PCR(表1)分別擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為704 bp(UDT1)和1659 bp(TDR)的目的條帶，PCR產(chǎn)物與經(jīng)BamHI和KpnI酶切的PC1390U載體片段連接，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，獲得預(yù)期大小目的片段(圖1B)，表明目的片段已成功連入PC1390U空載體中。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。

2.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株分子生物學(xué)檢測(cè)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型龍粳11，獲得潮霉素陽性轉(zhuǎn)基因T0代UDT1-OE植株15株，TDR-OE植株17株，對(duì)其中收獲到種子的4個(gè)陽性UDT1株系和3個(gè)陽性TDR過表達(dá)株系繼續(xù)繁殖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖1C)，對(duì)4個(gè)陽性UDT1和3個(gè)陽性TDR過表達(dá)株系種植的T1代共90株進(jìn)行潮霉素鑒定，其中陽性共76株，選擇以上T1代陽性的植株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株UDT1/TDR基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)檢測(cè)

利用qRT-PCR方法檢測(cè)野生型龍粳11和UDT1-OE/TDR-OE陽性過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系T1代體內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)四個(gè)陽性UDT1過表達(dá)株系UDT1-OE-1、UDT1-OE-2、UDT1-OE-3、UDT1-OE-4體內(nèi)UDT1表達(dá)水平均有不同程度的提高，分別提高了約6、10、44、54倍(圖1D)；三個(gè)陽性TDR過表達(dá)株系TDR-OE-1、TDR-OE-2、TDR-OE-3體內(nèi)TDR表達(dá)水平均有不同程度的提高(圖1E)，分別提高了約90、150、210倍。

注：A：過表達(dá)重組載體PC1390U-UDT1/TDR示意圖。LB為DNA左邊界，Hyg為潮霉素抗性基因，CaMV 35S promoter為花椰菜病毒35S啟動(dòng)子，RB為DNA右邊界；B：重組載體的雙酶切鑒定(BamHI和KpnI)。1代表1390U-UDT1陽性單克隆，2代表1390U-TDR陽性單克隆，M為DNA標(biāo)記；C：T0代植株轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。1-4代表T0 代UDT1-OE陽性植株，5-7代表T0 代表TDR-OE陽性植株，8為陰性對(duì)照，9為陽性對(duì)照，M為DNA 標(biāo)記；D-E：T1代表轉(zhuǎn)基因陽性植株轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)。LJ11為野生型，UDT1-OE-1～UDT1-OE-4為4個(gè)UDT1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，TDR-OE-1～TDR-OE-3為3個(gè)TDR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

2.4 UDT1、TDR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型特征

2.4.1UDT1、TDR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)統(tǒng)計(jì)。觀察UDT1-OE不同株系的結(jié)實(shí)率情況，發(fā)現(xiàn)UDT1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)率均有不同程度的降低。其中UDT1-OE-1、UDT1-OE-2結(jié)實(shí)率顯著下降，分別為67.63%、63.54%，而UDT1-OE-3、UDT1-OE-4結(jié)實(shí)率幾乎為0(圖2A，B)。

觀察TDR-OE不同株系的結(jié)實(shí)率情況，發(fā)現(xiàn)TDR-OE-1、TDR-OE-2、TDR-OE-3結(jié)實(shí)率均幾乎為0(圖2C，D)。因此，過表達(dá)UDT1、TDR會(huì)導(dǎo)致結(jié)實(shí)率的顯著下降。

2.4.2UDT1、TDR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株花粉活力統(tǒng)計(jì)。I2-KI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型花藥中充滿飽滿的深藍(lán)色可育花粉，4個(gè)UDT1過表達(dá)UDT1-OE株系中，過表達(dá)倍數(shù)較低的UDT1-OE-1、UDT1-OE-2可育花粉粒比例顯著下降，分別為73.6%、69.3%(圖2E，F(xiàn))，而UDT1過表達(dá)倍數(shù)較高的UDT1-OE-3、UDT1-OE-4花藥中無花粉粒釋放(圖2E，F(xiàn))，進(jìn)而觀察了其整個(gè)花藥的染色情況，發(fā)現(xiàn)野生型花藥中充滿了深藍(lán)色的可育花粉粒，而在UDT1-OE-3、UDT1-OE-4花藥中觀察不到任何花粉粒(圖2E)。

注：A-D，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與野生型成熟穗部表型(A，C)及結(jié)實(shí)率(B，D)。標(biāo)尺為1 cm，數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=10)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異用不同的小寫字母表示(P<0.05，采用Tukey顯著性差異檢驗(yàn)的單因素方差分析)。E-H，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與野生型的花粉育性(E，G)和花粉染色率(F，H)。(E，G)，LJ11、UDT1-OE、TDR-OE的花粉或花藥I2-KI染色，標(biāo)尺為20 μm，數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=5)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異用不同的小寫字母表示(P<0.05，采用Tukey顯著性差異檢驗(yàn)的單因素方差分析)。I-J，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與野生型的穎花表型。上排圖片為雄蕊表型，下排圖片為雌蕊表型，標(biāo)尺為1 mm。

觀察TDR-OE不同株系的KI-I2染色情況，發(fā)現(xiàn)3個(gè)TDR過表達(dá)株系中均無花粉粒釋放(圖2G，H)，隨后觀察了其整個(gè)花藥的染色情況，發(fā)現(xiàn)野生型花藥中充滿了深藍(lán)色的可育花粉粒，而在TDR-OE-1、TDR-OE-2、TDR-OE-3花藥中均觀察不到任何花粉粒(圖2G)。UDT1、TDR的過表達(dá)會(huì)嚴(yán)重影響花粉活力進(jìn)而影響水稻結(jié)實(shí)率。

2.4.3UDT1、TDR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株花藥形態(tài)。在開花前1d取野生型及過表達(dá)株系UDT1-OE穎花，剝開內(nèi)外穎殼，在解剖鏡下進(jìn)行花藥形態(tài)特征觀察。野生型花藥飽滿，直立于花絲上，長(zhǎng)度較長(zhǎng)，呈現(xiàn)為黃色(圖2I)；UDT1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株花藥形態(tài)有不同程度的變化，其中UDT1-OE-1、UDT1-OE-2表現(xiàn)出明顯的花藥卷曲且變短，但顏色與野生型無明顯差別(圖2I)，而UDT1基因表達(dá)量較高的UDT1-OE-3、UDT1-OE-4花藥表現(xiàn)出嚴(yán)重的顏色發(fā)白，長(zhǎng)度變短，皺縮卷曲，呈半透明的絲狀(圖2I)。而UDT1-OE雌蕊的表型與LJ11無區(qū)別(圖2I)，說明UDT1只對(duì)雄性生殖器官有影響。

同時(shí)觀察過表達(dá)株系TDR-OE穎花，剝開內(nèi)外穎殼，在解剖鏡下進(jìn)行花藥形態(tài)特征觀察。發(fā)現(xiàn)TDR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株花藥顏色變淺，長(zhǎng)度變短，表面皺縮，花藥形態(tài)明顯變差(圖2J)。綜上所述，過表達(dá)UDT1、TDR會(huì)對(duì)水稻花藥的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響。

3 結(jié)論與討論

本研究通過構(gòu)建UDT1和TDR基因過量表達(dá)載體，以黑龍江優(yōu)質(zhì)粳稻品種龍粳11為背景材料，獲得了的UDT1-OE及TDR-OE過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，通過I2-KI染色、花藥形態(tài)觀察及結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)明確了UDT1和TDR的過表達(dá)對(duì)水稻育性的影響。

水稻絨氈層的分化形成和退化降解是一個(gè)復(fù)雜的過程。根據(jù)前人對(duì)花粉產(chǎn)生過程的劃分，將水稻花粉產(chǎn)生過程的時(shí)間節(jié)點(diǎn)分為小孢子母細(xì)胞形成期、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期、小孢子發(fā)育早期、小孢子發(fā)育中期、小孢子發(fā)育晚期、二胞花粉發(fā)育早期、二胞花粉發(fā)育晚期、成熟花粉發(fā)育期8個(gè)時(shí)期。在小孢子母細(xì)胞形成期，花藥壁四層細(xì)胞分化形成；在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期，絨氈層的胞質(zhì)開始形成濃縮狀態(tài)；小孢子發(fā)育早期，絨氈層胞質(zhì)呈完全濃縮狀態(tài)；隨著小孢子的逐漸發(fā)育，絨氈層逐漸變?yōu)閹睿湓谛℃咦影l(fā)育晚期呈瓦狀；在二胞花粉發(fā)育早期，小孢子經(jīng)過有絲分裂形成了生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，此時(shí)期的絨氈層僅余下殘留組織；在成熟花粉發(fā)育期，淀粉粒等貯藏物完全充滿了整個(gè)花粉粒，絨氈層完全退化消失，僅余下次生絨氈層壁[26-27]。絨氈層細(xì)胞的分化發(fā)育對(duì)小孢子的正常發(fā)育至關(guān)重要，且在小孢子和花粉發(fā)育后期，絨氈層細(xì)胞必須適時(shí)降解以便為小孢子提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)小孢子和花粉粒的成熟，保證成熟花粉的釋放。絨氈層的降解是一個(gè)細(xì)胞程序性死亡PCD的過程，PCD過程的提前或延遲都會(huì)造成雄性不育[5]。小麥中RAFTIN1基因的提前高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致絨氈層PCD異常而提前降解，小孢子無法得到充足的發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)而造成雄性不育[28]。水稻中OsGAMYB主要在花藥原基和絨氈層細(xì)胞中表達(dá)，其突變體表現(xiàn)為小孢子發(fā)育早期絨氈層細(xì)胞開始異常肥大，PCD過程被抑制，小孢子解體，導(dǎo)致花粉不育[13-14]。

絨氈層細(xì)胞適時(shí)PCD是小孢子正常發(fā)育的重要保障[3]。UDT1主要參與次生壁細(xì)胞向成熟絨氈層的分化，處于減數(shù)分裂期的udt1絨氈層不能正常降解并呈空泡化，小孢子發(fā)育過程受阻、花粉囊內(nèi)無法產(chǎn)生花粉細(xì)胞，從而影響花粉活力[7]。tdr突變體主要表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出染色不加深，不濃縮等PCD異常的超微結(jié)構(gòu)特征，且TUNEL試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)結(jié)果表明，tdr絨氈層PCD信號(hào)微弱，說明其未能降解；對(duì)小孢子發(fā)育階段的tdr突變體花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)編碼半胱氨酸蛋白酶的OsCP1和編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑的OsC6，而半胱氨酸蛋白酶與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，表明TDR與水稻花藥絨氈層的 PCD過程密切相關(guān)[9]。絨氈層細(xì)胞的PCD對(duì)于其發(fā)育及降解過程十分重要，PCD過程的提前或延遲發(fā)生都會(huì)造成雄性不育[5]。前人的研究已經(jīng)揭示了UDT1、TDR的功能缺失會(huì)引起花藥絨氈層PCD的異常，從而導(dǎo)致雄性不育。而我們發(fā)現(xiàn)UDT1、TDR過量表達(dá)也能導(dǎo)致雄性不育的表型，這可能是由于UDT1、TDR在水稻花藥中的表達(dá)是一個(gè)十分精細(xì)的過程，過高或過低的表達(dá)量都會(huì)對(duì)花藥育性造成影響，UDT1、TDR的過表達(dá)植株絨氈層細(xì)胞PCD可能提前發(fā)生，從而導(dǎo)致了不育的表型。因此我們推測(cè)，UDT1、TDR亦可能是通過影響絨氈層PCD的適時(shí)發(fā)生來影響育性的。

本研究進(jìn)一步揭示了UDT1、TDR在水稻中的功能，即UDT1或TDR過量表達(dá)植株花藥發(fā)育受損，長(zhǎng)度變短，顏色發(fā)白，質(zhì)地變差，進(jìn)而影響了可育花粉比例，導(dǎo)致了結(jié)實(shí)率的顯著下降，甚至出現(xiàn)不育的表型。在UDT1-OE的4個(gè)株系中，雄性不育表型的嚴(yán)重程度隨著UDT1表達(dá)量的提高而增大(圖1D，1E，2A，2B，2E，2F，2I)，三個(gè)TDR-OE表達(dá)倍數(shù)均在90以上，均表現(xiàn)出不結(jié)實(shí)、無花粉等雄性完全不育表型(圖1D，1E，2C，2D，2G，2H，2J)。綜上所述，UDT1、TDR在水稻雄性生殖發(fā)育中起著不可或缺的作用，本研究對(duì)豐富花粉發(fā)育新機(jī)制和創(chuàng)制新類型不育種質(zhì)資源具有重要意義。