高能重離子束輻射水稻誘變育種研究進展

溫曉婷,張鑫,李景鵬,余麗霞,周利斌,楊福

(1.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長春 130102；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國科學院 近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

0 引 言

人工誘變將植物的突變頻率提高了約10～1 000倍[1]，廣泛應用于各個領(lǐng)域，在提升作物產(chǎn)量[2]、改良瓜果蔬菜[3]、改造花卉[4]以及微生物育種[5]等方面取得了巨大成果。利用各種誘變技術(shù)已培育出3 000多個植物品種，其中培育的水稻品種約占25%[6]。重離子束是一種新型誘變劑，相比于誘變育種中其他誘變源，重離子具有較高的傳能線密度(Linear Energy Transfer，簡稱LET)和較高的生物學效應(Relative Biological Effectiveness，簡稱RBE)，可以在較高的存活率下獲得較高的突變率，引起更為顯著的生物學效應[7]。重離子束的種類一般包括碳(C)、氮(N)、氖(Ne)、氬(Ar)、鐵(Fe)、氦(He)和氧(O)。我國科學家余增亮等[8]利用離子束本身具有的質(zhì)量沉積、能量沉積、電荷沉積、離子濺射、局部刻蝕和通道作用，率先將低能離子束注入技術(shù)用于水稻等農(nóng)作物的品種改良，首創(chuàng)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的低能離子束注入和低能離子束介導轉(zhuǎn)基因技術(shù)[9]。至此，離子束注入技術(shù)作為一種新方法，一個新興的交叉學科—離子束生物工程學問世，并立即受到國內(nèi)外專家的關(guān)注。日本在重離子束輻射水稻誘變技術(shù)研發(fā)及應用領(lǐng)域走在世界的前列，把重離子束輻射生物技術(shù)列為“人類前沿科學計劃”，成為21世紀生命科學研究的支撐技術(shù)之一[10]。重離子束主要分為能量大于MeV的高能重離子束和能量在KeV范圍內(nèi)的低能重離子束[11]。我國最初關(guān)注低能重離子束輻射對植物的影響[8]，直到近幾年才將高能重離子束輻射誘變技術(shù)應用到農(nóng)作物育種方面，而日本這方面研究的較早，并在水稻方面開展了研究，培育出了水稻新品種。本文簡述了近些年國內(nèi)外高能重離子束輻射誘變技術(shù)在水稻育種方面的研究，重點介紹了高能重離子束輻射誘變水稻的原理及特點，輻射誘變引起的水稻各性狀的改變及水稻新品種的培育，以期為高能離子束在水稻育種中進一步應用提供有價值的參考。

1 高能重離子束輻射誘變水稻的分子生物學特點

高能重離子束是由回旋加速器產(chǎn)生的加速離子沿著粒子路徑在局部區(qū)域密集形成的高效能量沉積[12]，具有更高的傳能線密度，對目標生物的DNA及蛋白質(zhì)等分子有更大的損傷。研究表明LET值越高，會誘導越復雜的雙鏈斷裂(Double strand break,DSB)[13]。DSB的修復途徑主要有兩種：同源重組(Homologous recombination,HR)和非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)[14]，NHEJ為C離子輻射植物DNA損傷的主要修復途徑[15]，可在各個細胞周期發(fā)生，該修復途徑不依賴于同源基因，因此更容易導致復雜的基因突變[16]。

射線與高能重離子束的誘變原理相似，都是將快速運動的帶電粒子作用于目標植物，但由于加速粒子沉積方式不同，產(chǎn)生了不同的誘變效果[17]。已有研究表明高能重離子束與射線的誘變效果存在顯著差異(表1)。Li等[18]通過比較誘變水稻的全基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γ-射線傾向于誘導小的突變，而C離子束主要誘導結(jié)構(gòu)變異(Structural variant,SVs)，后者的遺傳變異類型是遺傳多樣性的來源[19]。Yang等[20]通過比較γ-射線與C離子束對水稻的誘變特性發(fā)現(xiàn)，γ-射線誘導更多的多核苷酸變異(Multiple nucleotide variant,MNV)，而離子束更多的誘導小的插入與缺失和大片段缺失，并沒有發(fā)現(xiàn)SVs。產(chǎn)生以上結(jié)果差異的可能原因為：使用的材料不同[21]、輻射劑量不同[22]、測序方法和數(shù)據(jù)分析手段的不同[19]。因此，高能重離子束能產(chǎn)生更多的基因組變異類型，有更高的相對生物學效率、更寬的突變譜[23]以及更高的誘變效率[24]。

表1 高能重離子束輻射與其他物理輻射的對比

化學誘變中常用的誘變劑為烷化劑，可將堿基烷基化，發(fā)生嘌呤與嘧啶的轉(zhuǎn)化以及置換突變[30]，主要引起單核苷酸變異(Single nucleotide variant,SNV)[31]，而高能重離子束可誘導產(chǎn)生更多的基因變異類型和更高的染色體畸變率[22]。Oono等[31]對水稻品種日本晴的突變體進行分析發(fā)現(xiàn)，高能重離子束主要誘導GC>AT的轉(zhuǎn)換，占38%，其次為AT>GC，占33%，而甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)優(yōu)先烷基化鳥嘌呤(G)的殘基，主要誘導GC>AT的轉(zhuǎn)換，為93%[32]，且在Phe、Ile、Lys、Asn和Tyr的非同義位置缺少G和C，只產(chǎn)生26種氨基酸轉(zhuǎn)換類型[33]，而離子束輻射不存在特異性，可誘導170種氨基酸轉(zhuǎn)換類型[31]。Kazama等[14]比較了重離子束和EMS的誘變效應，發(fā)現(xiàn)重離子束主要誘導大片段的缺失與重排，EMS誘導更頻繁的滲漏突變。相較于EMS，高能重離子束有更強的穿透力，可更快誘導突變發(fā)生，并且化學誘變劑多為有毒試劑，對人體造成極大危害[17]。

低能重離子束單核能僅KeV，對植物組織的穿透深度極淺[34]，可對靶向組織的細胞膜和細胞壁產(chǎn)生刻蝕作用，使后續(xù)離子束沿著刻蝕通道攻擊遺傳物質(zhì)[35]，而高能重離子束的單核能在MeV以上，可穿透植物組織深度達幾厘米[36]，直接作用于植物遺傳物質(zhì)，對植物基因的物理損傷更大，產(chǎn)生更豐富的基因組變異類型[37]。

因此，高能離子束較射線輻射、化學誘變劑及低能重離子束的輻射效果更好，可以產(chǎn)生各種類型的遺傳變異，以及更廣泛的突變表型?？梢?，高能重離子束在水稻育種中有很大的應用潛力。

2 用于誘變水稻的高能重離子束種類、輻射劑量及受體材料的選擇

2.1 高能重離子束的選擇

離子束的種類很多，選擇合適的離子束對于水稻育種是非常重要的。已有研究證實不同種類的重離子束產(chǎn)生的誘變效果不同。Kazama等[14]對不同誘變處理的擬南芥進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)Ar離子束主要誘導染色體重排，C離子束主要誘導單堿基替換(Single base substitutions,SBS)和小片段的插入與缺失，產(chǎn)生差異的原因可能為Ar離子束與C離子束誘導的基因的修復途徑不同。Sjahril等[38]發(fā)現(xiàn)C離子束輻射產(chǎn)生更多的突變植株類型，而Ar離子束輻射的突變體后代發(fā)芽率更高。并且有研究表明C離子束輻射的相對幼苗存活率高于Ar和Fe[39]。不同的離子特性決定了LET的值，LET越高產(chǎn)生的DNA損傷越多，在需要高LET時，應選擇較重、帶高電荷且速度較慢的離子[11]。

2.2 最佳輻射劑量的選擇

高能重離子束的不同輻射劑量有不同的誘變效果，有研究發(fā)現(xiàn)高劑量輻射抑制生長，而低劑量輻射可促進生長[40]。Zhao等[41]利用不同劑量的碳(C)離子束輻射水稻，發(fā)現(xiàn)低劑量的重離子束主要誘導CG位點的高甲基化，可能激活生物的代謝、合成機制；高劑量的重離子束誘導CG位點的低甲基化，可能誘導植物的抗逆性。因此需選用最佳輻射劑量以獲得最大效果的突變。Yamaguchi等[29]發(fā)現(xiàn)水稻種子的存活率與輻射劑量存在“肩部”效應曲線，通過比較輻射水稻的突變率與致死率，發(fā)現(xiàn)肩部劑量是不改變遺傳背景而獲得有用突變體的標準；并表明220 MeV和320 MeV的C離子束以及100 MeV的He離子束誘變水稻的肩部劑量分別為20 Gy、60-80 Gy以及150 Gy[17]。而一些學者認為存活下來的植株有更大的變異幅度，將半致死率作為最佳輻射劑量[42]。最佳輻射劑量的選擇需依據(jù)突變體的萌發(fā)、早期生長以及田間出苗等性狀指標以及染色體變異和染色體分裂等細胞學形態(tài)來衡量[43]。

2.3 輻射受體材料的選擇

不同發(fā)育階段的組織對離子束的敏感性不同，一般選用的靶向材料為花藥、愈傷組織，發(fā)育中的胚和莖節(jié)、吸漲后的種子、幼芽以及干燥的種子[44]。水稻中最常用的誘變組織是種子，種子含水量直接影響其輻射敏感性，吸水種子的敏感性高于干燥種子，在125 MeV·u-1的C離子束輻射下，干種子的最佳輻射劑量是150 Gy，而吸水種子的最佳輻射劑量為20 Gy[45]。含12%～15%水分的種子有更好的誘變效果，可避免氧的增效作用，復合輻射產(chǎn)生的自由基，降低對種子的損傷，提高種子存活率[46]。

3 高能重離子束輻射誘變水稻重要性狀基因功能分析

利用高能重離子束已經(jīng)產(chǎn)生了許多具有不同優(yōu)良性狀的突變體，不僅豐富了種質(zhì)資源庫，還為進一步探究了水稻的分子與生理機制提供基礎。

3.1 水稻重要農(nóng)藝性狀基因功能研究

水稻農(nóng)藝性狀的改良是提高作物產(chǎn)量的重要手段，許多研究挖掘了產(chǎn)量與性狀之間的關(guān)系，在水稻中產(chǎn)量由株高、生育期、分蘗能力、穗長、粒型、結(jié)實率和每穗粒數(shù)等間接性狀以及每株穗數(shù)，每穗飽滿粒數(shù)和千粒重等直接性狀決定[47]。利用高能重離子束可對水稻的多種農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響(表2)。

表2 高能重離子束誘變水稻產(chǎn)生的表型改變

水稻的矮化增加了水稻的抗倒伏性，也更多的將光合作用產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到生殖生長中，提高水稻產(chǎn)量[48]。莊楚雄等[49]利用Ar離子束輻射水稻，產(chǎn)生了由隱性基因控制的半矮桿突變表型，初步定位發(fā)現(xiàn)突變位點與Semi-dwarfgene(Sd-1)不連鎖，對兩個突變株系Ar-10和104進行限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP)比對，推測突變位點位于突變熱點附近。Oono等[31]篩選出了由碳(C)離子束誘變產(chǎn)生的矮化突變體3098和885，利用全外顯子測序分析發(fā)現(xiàn)，3098突變體在Guaninenucleotide-bindingProteinAlpha-1subunit(GPA1)上存在128 kp的缺失，表現(xiàn)為Daikoku矮化(D1)特征，并推測該突變?yōu)殡s合突變，在突變體885中并沒有檢測到相關(guān)基因的突變。

水稻抽穗期是水稻重要的農(nóng)藝性狀之一，決定了品種種植地區(qū)及季節(jié)適應性[50]。Ichitani等[51]利用220 MeV的C離子束誘變粳稻品種Taichung 65產(chǎn)生了晚抽穗突變體KGM26、KGM27，分別由純合隱性基因FLOWERINGTIME1(FLT1)和FLOWERINGTIME1(FLT2)控制。連鎖分析發(fā)現(xiàn)FLT1位于8號染色體的短臂上，推測與Earlyheadingdate3(Ehd3)在同一位點上；FLT2位于9號染色體著絲粒附近，是一個新的基因。Oono等[31]利用高能C離子束產(chǎn)生了早抽穗突變體786-5、IRB3517-3和IRB3790-2，早抽穗突變體786-5在M3代中純合，測序分析發(fā)現(xiàn)突變體的PHYTOCHROMEB基因上存在一個5bp的缺失；在IRB3517-3中與早抽穗相關(guān)的基因定位在3號染色體上，存在33.6 kb的缺失，并推測HEADINGDATE16(HD16)是假定的候選突變基因；IRB3790-2在M5代獲得純合突變株系，并在6號染色體上檢測到染色體倒位(Inversions,INV)，一個INV突變位點位于HEADINGDATE1(HD1)基因的第二外顯子上，該基因編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)HEADINGDATE3(HD3)基因的表達。

葉片是水稻光合作用的主要場所，葉片損傷也會對水稻產(chǎn)量造成嚴重損失[52]。Peng等[53]利用C離子束輻射產(chǎn)生了葉片異常萎蔫的突變表型，通過混合群體分離分析(Bulked segregant analysis,BSA)、分子標記連鎖分析和MutMap分析將突變位點位于11號染色體上的著絲粒區(qū)域，約1 030 kb之間，同一位點上的6個基因發(fā)生了非同義突變，結(jié)合基因表達水平推測LOC_Os11g19810為m3基因，編碼含有PWWP結(jié)構(gòu)域的蛋白。Yamatani等[54]在C離子束輻射后代中篩選出E型持綠突變體delayedyellowing1-1(dye1-1)，精細定位表明DYE1編碼PSI天線復合體的亞單位—Lhca4，其第二外顯子上存在單堿基替換，使蛋白穩(wěn)定性降低。蛋白質(zhì)電泳分析顯示突變體的PSI-LHCI超復合體中存在嚴重缺陷，但LHCII的含量顯著上升，為研究LHCI與LHCII之間的相互作用提供了材料。Maekawa等[55]利用高能C離子束在穩(wěn)定的黃葉突變體中誘導產(chǎn)生了雜色黃葉突變體，且該突變體可與分離的恢復體共遺傳，通過分析推測穩(wěn)定的黃葉表型是由非自主性轉(zhuǎn)座子引起的，由離子束輻射產(chǎn)生的染色體斷裂而導致的低甲基化激活了沉默的自主轉(zhuǎn)座子。

通過離子束誘變產(chǎn)生了不同農(nóng)藝性狀的突變，利用正向遺傳學手段將突變表型與基因建立聯(lián)系，對挖掘水稻基因以及闡明誘變本質(zhì)具有重要的作用。

3.2 水稻主要品質(zhì)性狀的基因功能研究

隨著人們生活水平的提高，對食物的需求不僅僅局限于飽腹這一方面，粒型、淀粉含量、安全性作為衡量水稻品質(zhì)性狀的重要指標，挖掘更多調(diào)控基因，解析其調(diào)控機制也成為近年來的熱點方向。利用高能重離子束誘變也可以對水稻的品質(zhì)性狀進行改良，從而滿足人們對高品質(zhì)水稻的追求。

不同地區(qū)對水稻粒型與口感的需求不同[56]。Morita等[57]利用高能離子輻射粳稻品種日本晴，產(chǎn)生了只有籽粒長度增加的longgrain1(lin1)突變體，對F2代進行表型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在Os06g0675200基因(LIN1)上存在1bp的缺失，產(chǎn)生了長粒突變體表型，并發(fā)現(xiàn)LIN1基因在種子植物中廣泛同源，有望通過基因滲入或CRISPR編輯技術(shù)改變粒型。程維民等[65]利用高能C離子束輻射武運粳7號，產(chǎn)生了直鏈淀粉及蛋白含量變異的突變體，其變異系數(shù)分別為13.7%和12.8%，并將品質(zhì)性狀與農(nóng)藝性狀進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量以及蛋白質(zhì)含量與水稻表型密切相關(guān)，對品種的選育有指導意義。

水稻中有毒物質(zhì)的積累不僅阻礙水稻的正常生長，也危害人體健康。Ishikawa等[66]利用高能C離子束輻射日本水稻品種越光，得到了鎘(Cd)含量極低的突變體(lcd-kmt1，lcd-kmt2，lcd-kmt3)，對雜交突變體后代進行連鎖分析和候選基因的圖位克隆發(fā)現(xiàn)，突變基因位于7號染色體上，編碼假定的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白OsNRAMP5，控制Cd離子的轉(zhuǎn)運，并開發(fā)了檢測OsNRAMP5多態(tài)性的DNA標記，有望通過標記輔助選擇將該基因轉(zhuǎn)移到其它水稻品種中。Ishikawa等[67]利用高能C離子束輻射越光，得到了銫(Cs)含量是野生型一半的突變體(lcs1)，對雜交品種進行數(shù)量性狀位點(Quantitative Trait Locus,QTL)分析，與放射性元素降低相關(guān)的主效QTL定位于6號染色體上，經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)是編碼SALT OVERLY SENSITIVE 2(OsSOS2)蛋白的基因發(fā)生了缺失，并且發(fā)現(xiàn)同時攜帶lcs1與lcd-kmt2等位基因的水稻株系，有望培育具有低鎘且低銫(Cs)含量的水稻新品種。

利用高能重離子束輻射水稻能產(chǎn)生較寬的突變譜[17]，可誘導產(chǎn)生不同品質(zhì)性狀的突變，有利于快速篩選出有利突變進而出培育優(yōu)質(zhì)水稻品種，且相較于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，輻射誘變所產(chǎn)生的水稻新品種更容易被人們接受。

3.3 水稻抗逆性的基因功能研究

在自然條件下，水稻會遭受包括病蟲害、土壤鹽堿、干旱及高溫低溫等一系列的生物脅迫和非生物脅迫，提高水稻對不利環(huán)境的適應性是改良水稻的一項重要研究。

開發(fā)抗病水稻品種、研究抗病分子機制對提高水稻產(chǎn)量有非常重要的價值，利用高能重離子束輻射誘變技術(shù)培育出許多抗病水稻新品種[2,45,62]，但沒有進一步的探索。而對低能重離子束誘變產(chǎn)生的抗稻瘟病突變體目前已經(jīng)進行了較深入的研究。DNA指紋圖譜分析突變體存在多態(tài)性片段，測序分析發(fā)現(xiàn)該片段與假病斑基因(Spl11)相關(guān)[68]。Xu等[69]利用低能N離子束(25 KeV)與中能Ne離子束(80 MeV)誘變得到的spl29、spl30、spl31和spl33突變體，這些突變體由單隱形基因控制，通過基因定位發(fā)現(xiàn)spl29和spl31為spl1的等位基因，而spl30與spl33可能為新的抗病基因，該研究為創(chuàng)建突變體文庫提供了寶貴的材料。

鹽堿和干旱是限制水稻生產(chǎn)的重要因素，培育耐鹽、耐旱水稻品種可減輕土地資源浪費及種植區(qū)缺水造成的負面影響。Hasan等[62]利用C離子束輻射MR219，篩選出22株耐鹽和35株耐旱突變體，在M3代中發(fā)現(xiàn)了純合突變系，為研究水稻耐鹽、耐旱的生理機制提供了優(yōu)良種質(zhì)資源。Zhang等[70]利用C離子束輻射通禾899，產(chǎn)生了耐鹽堿突變品系東稻122。Ichida等[71]利用C離子束輻射日本晴，篩選出了耐鹽的水稻品系6-99，14-45和18-36。對此類突變系的調(diào)控基因及機制分析并沒有進行深入研究，可能原因是植物的耐旱、耐鹽性是由多基因控制的，且受外界環(huán)境影響很大[72]。利用離子束誘變產(chǎn)生的此類水稻新品種，對于鹽堿地的開發(fā)具有非常重要的作用。

溫度過高或過低都會對水稻產(chǎn)量造成負面影響，溫度過高會增加水稻堊白率，影響水稻外觀，進而影響水稻的品質(zhì)性狀。Tabassum等[73]從高能C離子束輻射后代中分離出在高溫下水稻堊白率極高的溫敏粉狀胚乳(flo11-2)突變體，進行全外顯子測序及基因檢測分析發(fā)現(xiàn)，編碼cpHSP70-2的基因存在A>T的替換，并通過回補實驗得到了驗證。flo11-2突變體是作為研究高溫對水稻影響的有用模型。水稻是冷敏感作物，溫度過低阻礙水稻生長甚至導致死亡[74]。Morita等[75]在C離子束誘變的水稻突變后代群體中發(fā)現(xiàn)了對低溫敏感的突變體csv1，在低溫下表現(xiàn)褪綠表型，進行圖位克隆發(fā)現(xiàn)CSV1基因定位于5號染色體上，編碼假定的FAD/NAD(P)氧化還原蛋白，并且在多種植物中發(fā)現(xiàn)了CSV1同源基因，進一步的補充了水稻的耐冷機制。

分析水稻突變體對于挖掘水稻基因功能具有重要的作用，高能重離子束誘變創(chuàng)制了新基因，可通過基因編輯技術(shù)應用新基因，創(chuàng)制新的突變品種。

3.4 對其它性狀基因功能分析

遠緣雜交不親和嚴重阻礙了優(yōu)良種質(zhì)資源的開發(fā)，打破遠緣雜交不親和性對于優(yōu)良水稻品種的研發(fā)具有非常重要的意義。Koide等[76]通過對亞洲栽培稻(Acc108)和非洲栽培稻(Acc108S1)雜交得到的種子進行離子束誘變，得到Acc108S1M突變體，該突變體有極高的花粉育性，通過分析突變區(qū)域以及序列比對，發(fā)現(xiàn)突變體在S1基因座中存在5 bp的缺失，命名為SSPmut，并沒有在Acc108中發(fā)現(xiàn)同源基因，且該基因鄰近OgTPR1基因，兩基因在配子發(fā)育中共表達，通過轉(zhuǎn)基因以及雜交分析表明SSP-gla與其他因子在S1基因座上誘導不育。因此，可以通過高能重離子輻射誘變技術(shù)創(chuàng)建中性等位基因來克服遠緣雜交不育性。

4 高能重離子束輻射在水稻新品種培育上的應用

4.1 水稻輻射親本材料的選擇

一般選擇輻射敏感性強，綜合性狀良好，雜合基因型優(yōu)良的水稻作為親本材料。有研究表明不同水稻品種的輻射敏感性不同，輻射敏感的植株有更高的突變頻率[77]，粳稻的敏感性大于秈稻，但氣候型品種間的差異不明顯[78]；綜合性狀優(yōu)良，缺陷性狀極少的品種更容易進行篩選，更易獲得成功[79]；輻射具有優(yōu)良雜合基因型的親本材料可以增加染色體的交換率，產(chǎn)生超親世代，提高植株的變異頻率，擴大突變范圍[80]。

4.2 輻射后代突變體的篩選

針對不同的突變類型需選用合適的篩選手段。水稻品種的選育分為直接選育和間接選育。直接選育即對水稻的突變性狀直接進行觀察統(tǒng)計，適用于對水稻株高、分蘗、熟期、粒型等可見性狀的篩選，直接選育是誘變育種中最基本也是最常用的突變篩選手段。間接選育即需借助一些手段來識別突變體。如利用基于同步輻射的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外吸收光譜(Synchrotron radiation-based Fourier transform infrared,SR-FTIR)[81]來檢測拋光大米中的碳水化合物及蛋白質(zhì)的含量，利用凱氏定氮法[65]來檢測水稻中的蛋白質(zhì)含量以及利用毛細管耦合質(zhì)譜儀(GE-MS)篩選低草酸鹽含量的水稻突變體[82]；有些需要將突變體置于一定環(huán)境中才表現(xiàn)突變性狀，如對抗病，低溫及耐鹽堿等突變體的篩選；對突變體的分子篩選可以闡明突變的本質(zhì)，解決基因表達不充分問題，如定向誘導基因組局部突變技術(shù)(Targeted Induced Local Lesions in Genomes,TILLING)可直接在基因水平上對重離子束誘變后代進行篩選[17,83]，還可通過微陣列技術(shù)來監(jiān)測離子束誘變水稻突變體中miRNA的表達[84]，此外，結(jié)合分子標記輔助選擇技術(shù)將會極大的提高了水稻選育的效率[66]。對水稻突變性狀的選擇要避免“木桶效應”，應選取綜合性狀優(yōu)良的水稻突變體。

4.3 輻射誘變培育的水稻品種

由高能重離子束誘變技術(shù)結(jié)合不同的選育手段已經(jīng)培育許多水稻新品種。孟加拉國原子農(nóng)業(yè)研究所利用高能C離子束輻射技術(shù)培育出矮桿、生育期短、產(chǎn)量高且耐旱的品種Binadhan-14和Binadhan-19，適宜種植于孟加拉國干旱多發(fā)的地區(qū)[85]。Ishikawa等[67]利用高能C離子束輻射日本水稻品種越光，篩選及培育得到了Cd含量極低的品種Koshihikari Kan No.1，并已經(jīng)在日本有了廣泛的種植。湖南省農(nóng)業(yè)科學院利用高能重離子束誘變產(chǎn)生了低鎘含量的蓮兩優(yōu)1號，蓮兩優(yōu)100以及稻韶香100的雜交稻組合品種[86]。馬來西亞普特拉大學利用高能重離子束對MR219的輻射產(chǎn)生了有益于糖尿病患者食用的水稻ML3與ML30品種[87]。近些年，研究者所在課題組一直致力于由高能C離子束誘變產(chǎn)生水稻新突變體的研究，得到了耐鹽堿品種東稻122、東稻211、東稻812和優(yōu)質(zhì)米種東稻862，都已通過國家審定，并已累積推廣35 000 hm2。

5 存在的問題及展望

高能重離子束誘變產(chǎn)生新的水稻突變品種，創(chuàng)制了新的種質(zhì)資源，豐富了水稻突變體庫，對于水稻的基礎研究以及品種改良具有非常重要的作用，但仍有亟待解決的問題：

5.1 高能重離子束的定點突變

高能重離子束存在殺傷力廣、破壞性大的物理特性，產(chǎn)生了復雜的基因組變異類型，相較于精準突變，誘變產(chǎn)生的突變表型更加隨機，難以得到只包含目標性狀的突變，因此開發(fā)應用于水稻育種中的離子束定向誘變技術(shù)，對獲得理想突變體有非常重要的意義。

5.2 輻射誘變機理的研究

利用高能重離子束已經(jīng)產(chǎn)生了各種類型的水稻突變體，但對很多突變體的研究僅僅局限于表型和現(xiàn)象的描述，并沒有進行更加深入的探討。對水稻突變本質(zhì)進行深入研究，不僅可以將其應用于水稻育種中，還可以揭示雙子葉植物的分子調(diào)控機制。隨著測序技術(shù)的發(fā)展以及分析儀器的改進，對于水稻分子生物學及生理生化的研究提供了基礎平臺。

5.3 精準測序結(jié)果

為了探尋突變本質(zhì)，對突變位點進行了篩選，但由于測序深度、測序手段與數(shù)據(jù)分析工具的不同，使得到突變結(jié)果有很大的差別。測序偏差的存在，影響了數(shù)據(jù)挖掘的準確性，因此就需要研究出新的方法來改變這一缺陷，且不同實驗室的實驗設計和數(shù)據(jù)挖掘流程存在差異，因此很難比較實驗結(jié)果。但是隨著測序技術(shù)以及分析技術(shù)的不斷發(fā)展，一旦突破了這些瓶頸，對于水稻突變體的研究將會有巨大突破。

現(xiàn)在已經(jīng)進入到育種的黃金階段，中央一號文件的正式公布，為育種工作提供了政策支持[88]。高能重離子束在水稻育種中的廣泛應用，產(chǎn)生了大量具有優(yōu)良性狀的突變體，擴充了水稻突變體庫，并有利于未來超級稻的開發(fā)。近年來對水稻突變體的研究開始聚焦到分子水平，對控制表型的基因進行了精細定位，開發(fā)遺傳標記，并應用于水稻育種中。誘變育種與分子育種的結(jié)合大大縮短育種年限，提高了育種的定向性和效率，且隨著測序技術(shù)及分子育種技術(shù)的不斷發(fā)展，兩種育種技術(shù)的結(jié)合將會出現(xiàn)“1+1>2”的效果。