水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因OsERF096啟動(dòng)子克隆及活性分析

陳悅，陳茜，董偉峰，才曉溪，沈陽(yáng)，楊珺凱，賈博為，孫明哲，孫曉麗

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 作物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

0 引 言

水稻(OryzasativaL.)是世界上最主要的糧食作物之一[1]。由于水稻起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，因此相比其他谷類(lèi)作物，水稻對(duì)冷脅迫更敏感。低溫對(duì)水稻的傷害主要表現(xiàn)為種子發(fā)芽緩慢、幼苗萎蔫或黃化、孕穗期及抽穗開(kāi)花期花藥不開(kāi)裂、花粉不能正常發(fā)育等，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低，產(chǎn)量下降[2]。低溫冷害嚴(yán)重制約我國(guó)水稻生產(chǎn)，世界水稻主產(chǎn)區(qū)也普遍存在低溫冷害問(wèn)題[3]。因此，解析水稻耐冷調(diào)控機(jī)制，提高水稻耐冷性對(duì)保障水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)是一類(lèi)植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，該家族蛋白含有一個(gè)保守的 AP2/ERF DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]。AP2/ERF家族依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域相似性可分為 AP2(APETALA2)、ERF(Ethylene-responsive)、DREB(Dehydration-responsive element binding proteins)、RAV(Related to ABI3/VP1)和 Soloist共5個(gè)亞家族[5]。已有研究表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合 GCC-box(AGCCGCC)、DRE/CRT(A/GCCGAC)或 GT-1(GAAAAA)等元件，調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)，最終引起生理生化變化，幫助抵抗外界逆境脅迫[6]。其中，DREB亞家族蛋白被證明是植物冷脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的核心組分，又稱(chēng)CBF(C-repeat binding factor)[7-9]。OsDREB1A-C在水稻冷脅迫期間被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，可通過(guò)與 GCC-box 結(jié)合激活靶基因表達(dá)參與水稻冷脅迫應(yīng)答[10]。遺傳學(xué)證據(jù)顯示OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1D和OsDREB1F過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻和擬南芥對(duì)冷脅迫的耐受性[11-13]。但目前對(duì)ERF亞家族參與冷脅迫的研究報(bào)道較少。

啟動(dòng)子作為基因表達(dá)的重要調(diào)控元件，能夠控制基因轉(zhuǎn)錄，決定基因的表達(dá)水平，是表達(dá)載體的重要組成部分[14]。已有多個(gè)研究報(bào)道，水稻AP2/ERF啟動(dòng)子中存在多種順式作用元件，并鑒定了其上游的轉(zhuǎn)錄因子/蛋白。ERF 亞家族蛋白OsDERF1(Drought-responsive ERF genes)和 OsERF109 可直接與OsERF3和OsAP2-39啟動(dòng)子中的GCC-box或DRE/CRT元件結(jié)合，激活其基因表達(dá)，負(fù)調(diào)控水稻耐旱性[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，光敏色素相互作用因子OsPIL16(Phytochrome interacting factor-like protein)能夠直接與OsDREB1B啟動(dòng)子區(qū)的 N-box(CACGC/AG)結(jié)合，激活OsDREB1B基因表達(dá)從而正調(diào)控水稻耐冷性[17]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子OsERF096，其表達(dá)顯著受冷脅迫誘導(dǎo)，并已證實(shí)其負(fù)調(diào)控水稻耐冷性[18]。為了探究冷脅迫誘導(dǎo)OsERF096表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究克隆了OsERF096啟動(dòng)子序列，根據(jù)順式作用元件分布情況設(shè)計(jì)4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的GUS組織化學(xué)染色和qRT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，冷脅迫處理前后GUS染色程度和基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異。該結(jié)果為深入闡釋OsERF096基因表達(dá)調(diào)控及功能研究提供了重要線(xiàn)索，為啟動(dòng)子功能對(duì)調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

本研究所用野生型擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)。選取飽滿(mǎn)的Col-0種子，用5%的NaClO溶液消毒5～8 min，滅菌ddH2O沖洗5～7次，4 ℃春化3 d，播種于1/2MS培養(yǎng)基，置于人工氣候培養(yǎng)室 22 ℃-Light-14 h/22 ℃-Dark-10 h培養(yǎng)。

1.2 OsERF096基因啟動(dòng)子序列獲得及克隆

通Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/)獲取OsERF096基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 500 bp序列作為啟動(dòng)子序列。利用Primer 5.0軟件選取合適位置設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物POsERF096-1215-F/POsERF096-1215-R(表1)。

表1 本研究所用引物

采用Axy PrepTMGenomic DNA purification kit(Axygen)提取水稻幼苗葉片的基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，NanoVue Plus測(cè)定DNA濃度。以提取的水稻葉片DNA為模板，采用KOD高保真聚合酶(TOYOBO)PCR擴(kuò)增，克隆OsERF096啟動(dòng)子。PCR反應(yīng)體系如下：2×KOD Mix 25 μL，上游和下游引物(10 μM)各1 μL，ddH2O 13 μL及gDNA 10 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，68 ℃延伸10 s，30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-Blunt Cloning Vector(TransGen Biotech)連接，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后將陽(yáng)性克隆送交公司測(cè)序。

1.3 OsERF096啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

對(duì)上述克隆獲得的OsERF096啟動(dòng)子序列，利用New PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/action=newplace)和Plant CARE(http://intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/)工具進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，篩選與冷脅迫及參與冷脅迫應(yīng)答的激素相關(guān)的元件。

1.4 OsERF096啟動(dòng)子缺失片段克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)OsERF096啟動(dòng)子(POsERF096-1215)順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)行 5′端缺失片段設(shè)計(jì)，并設(shè)計(jì)3條上游序列(表1)，擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的OsERF096啟動(dòng)子片段。利用EcoRⅠ/NcoⅠ酶切和T4DNA連接酶連接，將獲得的4條啟動(dòng)子序列分別替換pCAMBIA3301載體上的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建4個(gè)GUS基因表達(dá)載體POsERF096-1215-GUS、POsERF096-1102-GUS、POsERF096-827-GUS、POsERF096-501-GUS。

1.5 擬南芥侵染及鑒定

采用凍融法，將上述4個(gè)啟動(dòng)子載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404，并進(jìn)行農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化到Col-0中。將收獲的T0代種子播種于含有15 mg·L-1草銨膦的1/2 MS培養(yǎng)基篩選抗性苗，采用啟動(dòng)子序列特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 GUS組織化學(xué)染色

將轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗或組織完全浸沒(méi)GUS染色液中，于37 ℃過(guò)夜孵育，移至75%乙醇中脫色后觀察GUS染色情況，并拍照保存。試驗(yàn)選取3個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)株系取5株用于GUS染色。GUS染色液配方如下：200 mM NaH2PO4、200 mM Na2HPO4、100 mM Na2EDTA、5 mM K3[Fe(CN)6]、5 mM K4[Fe(CN)6]、X-Gluc、TritonX-100[19]。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)GUS基因表達(dá)

采用Trizol(Invitrogen)試劑法提取總RNA，經(jīng)gDNA wiper(Vazyme)清除基因組DNA，利用HiScriptIIIRT Super Mix(Vazyme)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以稀釋5倍的cDNA為模板，以Actin2基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。qRT-PCR反應(yīng)體系15 μL：2×Top qMix 7.5 μL、上游和下游引物(10 μM)各0.3 μL、ddH2O 4.9 μL、cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性4 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，Ct值取3次技術(shù)重復(fù)平均值，相對(duì)表達(dá)量取三次生物學(xué)重復(fù)平均值。使用Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖，采用Duncan檢驗(yàn)方法進(jìn)行多重比較及差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsERF096啟動(dòng)子克隆與順式作用元件分析

通過(guò)Phytozome網(wǎng)站獲取OsERF096基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 500 bp作為啟動(dòng)子序列，選取合適位置設(shè)計(jì)特異性引物。以日本晴水稻基因組DNA為模板，采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(圖1)，PCR產(chǎn)物連接T-vector后送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示成功克隆OsERF096啟動(dòng)子序列(1 215 bp)，將其命名為POsERF096-1215。

注：M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL8000; OsERF096-1215:OsERF096啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物。

利用New PLACE和PlantCARE在線(xiàn)軟件，對(duì)獲得的OsERF096啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)(圖2)，發(fā)現(xiàn)該序列中包含多個(gè)參與低溫應(yīng)答及逆境相關(guān)的激素信號(hào)應(yīng)答的元件，如低溫響應(yīng)元件MYCCONSENSUSAT(CANNTG)，脫落酸響應(yīng)元件ABRERATCAL(MACGYGB)、RYREPEATBNNAPA(CATGCA)、PROXBBNNAPA(CAAACACC)、MYB1AT(TAACCA)，水楊酸響應(yīng)元件WBBBOXATNPR1(TTGAC)，赤霉素響應(yīng)元件HVAL21(TATCCAC)、MYBGAHV(TAACAAA)等(表2)。上述結(jié)果暗示OsERF096表達(dá)可能響應(yīng)激素和低溫脅迫。

注：圖中箭頭代表DNA正/反鏈的5′方向。

表2 OsERF096啟動(dòng)子序列順式作用元件分析

2.2 OsERF096啟動(dòng)子片段缺失設(shè)計(jì)及GUS表達(dá)載體構(gòu)建

為分析OsERF096啟動(dòng)子中響應(yīng)冷脅迫的關(guān)鍵區(qū)域，根據(jù)順式作用元件分布情況，設(shè)計(jì)了 4個(gè)不同長(zhǎng)度的OsERF096啟動(dòng)子片段。如圖3A所示，POsERF096-1215-GUS含有 7 個(gè)與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件(MYCCONSENSUSAT、ABRERATCAL、PROXBBNNAPA、MYB1AT、WBBBOXATNPR1、HVAL21、MYBGAHV)；POsERF096-1102-GUS缺失了2個(gè)5′端ABA和GA響應(yīng)元件(ABRERATCAL和MYBGAHV)；POsERF096-827-GUS進(jìn)一步缺失了 SA 響應(yīng)元件(WBBBOXATNPR1)；POsERF096-501-GUS只包含3種低溫和ABA響應(yīng)元件(WBBBOXATNPR1、PROXBBNNAPA和MYB1AT)。分別擴(kuò)增4個(gè)OsERF096啟動(dòng)子片段(圖3B)，利用EcoRⅠ和NcoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶連接至pCAMBIA3301植物表達(dá)載體，替換載體上的35S啟動(dòng)子。測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建4個(gè)OsERF096啟動(dòng)子功能分析載體，分別命名為POsERF096-1215-GUS、POsERF096-1102-GUS、POsERF096-827-GUS、POsERF096-501-GUS。

注：A：OsERF096啟動(dòng)子5′端缺失片段示意圖。B：OsERF096啟動(dòng)子5′端缺失片段克隆電泳圖。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL8000；1～3：POsERF096-1215克??；4～6：POsERF096-1102克??；7～9：POsERF096-827克隆；10～12：POsERF096-501克隆。

2.3 OsERF096啟動(dòng)子功能分析載體轉(zhuǎn)化擬南芥

為了快速分析不同啟動(dòng)子片段對(duì)OsERF096基因表達(dá)的作用，本研究將上述構(gòu)建的4個(gè)載體POsERF096-1215-GUS、POsERF096-1102-GUS、POsERF096-827-GUS、POsERF096-501-GUS分別轉(zhuǎn)化Col-0。利用啟動(dòng)子特異性引物對(duì)T1抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖4)，以轉(zhuǎn)化不同啟動(dòng)子片段的擬南芥植株DNA為模板，均擴(kuò)增到與陽(yáng)性對(duì)照目的帶大小相一致的條帶，說(shuō)明OsERF096不同啟動(dòng)子片段均成功整合到Col-0基因組中。

注：A：轉(zhuǎn)POsERF096-1215-GUS擬南芥PCR鑒定；B：轉(zhuǎn) POsERF096-1102-GUS擬南芥PCR鑒定；C：轉(zhuǎn)POsERF096-827-GUS擬南芥PCR鑒定；D：轉(zhuǎn)POsERF096-501-GUS擬南芥PCR鑒定；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL8000；-：水對(duì)照；WT：野生型對(duì)照；+：質(zhì)粒對(duì)照；1～5：T1代glufosinate抗性苗。

2.4 OsERF096啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)檢測(cè)

為了快速鑒定OsERF096啟動(dòng)子片段是否成功驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，本研究首先對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片進(jìn)行 GUS染色(圖5A)。每個(gè)片段均染色3個(gè)以上株系，得到相似結(jié)果。圖5A所示為兩個(gè)單株的染色情況。結(jié)果表明，POsERF096-1215-GUS株系葉片染色最深，顏色由深至淺依次是：POsERF096-1215-GUS> POsERF096-827-GUS> POsERF096-501-GUS>POsERF096-1102-GUS。兩個(gè)染色較深的株系POsERF096-1215-GUS和POsERF096-827-GUS在葉脈和葉肉均有染色，POsERF096-501-GUS葉片染色呈現(xiàn)僅在葉脈，而POsERF096-1102-GUS僅以點(diǎn)狀形式分布在5個(gè)葉齒。上述發(fā)現(xiàn)說(shuō)明OsERF096基因在葉脈表達(dá)水平較高。

本研究進(jìn)一步對(duì)處于2葉期和4葉期的T2代幼苗進(jìn)行GUS染色分析(圖5B/C)。結(jié)果顯示POsERF096-1215-GUS和POsERF096-827-GUS株系幼苗的葉片和根系染色程度均較大，而POsERF096-1102-GUS和POsERF096-501-GUS株系中GUS染色則主要分布在子葉葉脈。以上結(jié)果說(shuō)明相比POsERF096-1102和POsERF096-501，POsERF096-1215和POsERF096-827可以驅(qū)動(dòng)GUS基因以較高水平表達(dá)。

為了驗(yàn)證GUS染色結(jié)果，本研究進(jìn)一步采用靈敏度較高的qRT-PCR分析GUS基因轉(zhuǎn)錄水平，來(lái)驗(yàn)證不同片段長(zhǎng)度的OsERF096啟動(dòng)子的活性(圖5D)。POsERF096-1215-GUS、POsERF096-827-GUS、POsERF096-501-GUS、POsERF096-1102-GUS株系中GUS表達(dá)水平分別為0.98、0.32、0.24和0.06，POsERF096-827-GUS和POsERF096-501-GUS中GUS表達(dá)水平顯著低于POsERF096-1215-GUS，POsERF096-1102-GUS極顯著低于POsERF096-1102-GUS，與GUS染色結(jié)果一致。綜上結(jié)果說(shuō)明POsERF096-1215啟動(dòng)子活性相對(duì)較高，在-1 102 bp～-1 215 bp區(qū)間存在保證OsERF096基因以較高水平表達(dá)的DNA序列元件，而-827 bp～-1 102 bp區(qū)間內(nèi)存在抑制其表達(dá)的序列。

注：A：T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片GUS染色分析；B：T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥2葉齡幼苗GUS染色分析；C：T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥4葉齡幼苗GUS染色分析；D：不同啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)基因株系中GUS基因表達(dá) qRT-PCR 分析。

2.5 冷脅迫對(duì)OsERF096啟動(dòng)子活性的影響

為了研究冷脅迫對(duì)OsERF096啟動(dòng)子活性的影響，對(duì)上述轉(zhuǎn)基因擬南芥株系4葉齡幼苗進(jìn)行4 ℃處理12 h，觀察冷處理前后GUS染色強(qiáng)度(圖6A)。正常生長(zhǎng)條件下，不同啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)基因幼苗染色情況與上述結(jié)果一致。令人意外的是，對(duì)比不同片段長(zhǎng)度的擬南芥幼苗冷處理前后的GUS染色情況發(fā)現(xiàn)，冷處理并未導(dǎo)致GUS染色程度明顯加強(qiáng)。這與我們前期qRT-PCR發(fā)現(xiàn)冷脅迫下OsERF096基因表達(dá)顯著上調(diào)相矛盾。

為證實(shí)GUS染色結(jié)果，本研究通過(guò)qRT-PCR分析了冷脅迫處理下GUS基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與未處理相比，冷處理后不同啟動(dòng)子片段的擬南芥株系中GUS基因表達(dá)均未發(fā)生顯著變化(圖6B)。綜上結(jié)果證實(shí)，本研究所獲得的不同OsERF096啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)，在冷脅迫處理下均未發(fā)生顯著差異。

注：A：冷處理前后T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥4葉齡幼苗GUS染色分析；B：冷處理下不同啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)基因株系中GUS基因表達(dá)qRT-PCR分析。

3 討論

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)重要組成部分，其中存在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，即順式作用元件，通過(guò)與反式作用因子(即轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。因此，對(duì)啟動(dòng)子功能的研究是基因表達(dá)調(diào)控研究的重要內(nèi)容。

諸多研究表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在水稻逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[20]。正常條件下，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子以較低水平表達(dá)，在干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫下其表達(dá)大幅度增加[6]。如水稻冷脅迫應(yīng)答通路下游的核心成員DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子(OsDREB1s)的表達(dá)，顯著受冷脅迫誘導(dǎo)[21]。ICE1 可識(shí)別并與OsDREB1s啟動(dòng)子中E-box(MYCCONSENSUSAT)結(jié)合，激活OsDREB1s基因表達(dá)，進(jìn)而提高對(duì)非生物脅迫的耐受性[22-23]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫促進(jìn)OsERF109基因表達(dá)，OsERF109蛋白通過(guò)識(shí)別，并結(jié)合OsERF3啟動(dòng)子中的GCC-box或DRE元件激活其表達(dá)，最終負(fù)調(diào)控水稻耐旱性[24]。因此，鑒定基因啟動(dòng)子中逆境應(yīng)答的關(guān)鍵區(qū)域或DNA元件，對(duì)揭示植物響應(yīng)逆境的分子機(jī)制尤其重要。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫處理下OsERF096基因表達(dá)顯著提高。本研究克隆了OsERF096基因啟動(dòng)子，軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其中包含多個(gè)響應(yīng)低溫及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)元件[25-27]。然而，通過(guò)OsERF096啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色和GUS基因qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫處理后，OsERF096啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因未出現(xiàn)預(yù)期的顯著上調(diào)。我們推測(cè)冷脅迫下OsERF096基因表達(dá)上調(diào)可能來(lái)源于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，如miRNA介導(dǎo)的mRNA降解。我們通過(guò)psRNATarget軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)靶向OsERF096基因Mrna序列的miRNA，包括OsmiR1320、OsmiR5809、OsmiR5541、OsmiR2927、OsmiR5075和OsmiR5526[28-32]。同時(shí)，異源表達(dá)也可能造成上述差異。本研究將OsERF096啟動(dòng)子在Col-0異源系統(tǒng)中表達(dá)，可能Col-0中缺乏相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與OsERF096啟動(dòng)子結(jié)合，或異源系統(tǒng)中OsERF096啟動(dòng)子附近DNA甲基化或組蛋白修飾發(fā)生改變，導(dǎo)致表觀遺傳修飾發(fā)生改變。例如，蘋(píng)果MYB10基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化可以調(diào)節(jié)MYB10基因表達(dá)[33]。我們已將OsERF096啟動(dòng)子分析載體轉(zhuǎn)化水稻，后續(xù)將對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中GUS基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。此外，本研究中OsERF096啟動(dòng)子克隆片段較短，缺失了重要冷應(yīng)答元件，也是造成冷脅迫下OsERF096啟動(dòng)子活性與OsERF096基因qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果矛盾的原因之一。Duan等[34]發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫可誘導(dǎo)OsRAV2基因，而OsRAV2啟動(dòng)子區(qū)GT-1元件缺失則不會(huì)產(chǎn)生鹽脅迫應(yīng)激反應(yīng)。后期研究中我們將進(jìn)一步克隆更長(zhǎng)片段的OsERF096啟動(dòng)子進(jìn)行鑒定。

通過(guò)對(duì)比不同啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子中，POsERF096-1215啟動(dòng)子活性最高，而POsERF096-1102最低。這一結(jié)果說(shuō)明在-1 102 bp～-1 215 bp區(qū)間存在保證OsERF096基因以較高水平表達(dá)的DNA序列元件，而-827 bp～-1 102 bp區(qū)間內(nèi)存在抑制其表達(dá)的序列。我們前期研究發(fā)現(xiàn)OsERF096負(fù)調(diào)控水稻耐冷性，后續(xù)研究中可通過(guò)操縱OsERF096啟動(dòng)子抑制其表達(dá)，從而調(diào)控水稻耐冷性。此外，OsERF096啟動(dòng)子中還存在多個(gè)與逆境應(yīng)答相關(guān)的激素響應(yīng)元件，暗示其可能參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，后續(xù)研究有必要分析不同激素處理下OsERF096啟動(dòng)子活性是否發(fā)生變化。

4 結(jié) 論

本研究克隆了OsERF096基因啟動(dòng)子，其中包含多個(gè)冷脅迫及激素相關(guān)順式作用元件。通過(guò)5′截?cái)嘣囼?yàn)發(fā)現(xiàn)，在-1 102 bp～-1 215 bp區(qū)間存在保證OsERF096基因以較高水平表達(dá)的 DNA 序列元件，而-827 bp～-1 102 bp區(qū)間內(nèi)存在抑制其表達(dá)的序列。冷處理下OsERF096啟動(dòng)子活性未發(fā)生顯著變化。