檳榔多酚提取物中總多酚和兒茶素類的含量測定

馬江紅，王 榮，杜 興，趙安鵬，王子晗，張浩波 （. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 70000；. 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科, 甘肅 蘭州 70050；. 甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院, 甘肅 蘭州 70070）

檳榔為棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子，居“四大南藥”之首，入藥最早記錄在《李當(dāng)之藥錄》中[1]，具有行氣利水，消積殺蟲，截瘧等功效，用于治療寄生蟲病、關(guān)節(jié)炎、青光眼、水腫、腳氣、瘧疾等疾病[2]。檳榔主要含生物堿、多酚、多糖、脂肪酸、鞣質(zhì)、氨基酸、三萜類、礦物質(zhì)、檳榔紅色素、粗纖維、油脂、維生素等多種物質(zhì)[3-4]。藥理研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗寄生蟲、抗老化、清除自由基、修護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗疲勞、改善胃腸功能、治療糖尿病、抑菌等作用[5]，文獻(xiàn)報道檳榔的抗氧化作用與其含有的多酚類物質(zhì)有關(guān)[6-12]。

課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，檳榔醇提取物能顯著增強(qiáng)H9c2 細(xì)胞的耐缺氧能力[13]，進(jìn)行高原實(shí)地研究發(fā)現(xiàn)，檳榔多酚能夠顯著改善高原實(shí)地缺氧大鼠的血?dú)庵笜?biāo)，能提高其肝、肺、心組織中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶活性，降低其肝、肺、心組織中丙二醛的含量，檳榔多酚提取物的抗缺氧作用與消除過量的氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[14-15]。同時，課題組進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，檳榔多酚提取物能預(yù)防高原肺水腫的發(fā)生，該作用與其減輕肺水腫、維持肺泡毛細(xì)血管通透性、改善氧化應(yīng)激損傷及病理損傷有關(guān)[16]。由此可見，將檳榔多酚提取物開發(fā)為新的抗高原缺氧藥物具有很大的潛力。檳榔多酚成分復(fù)雜，文獻(xiàn)報道檳榔多酚中含有兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸、沒食子酸等，另外藥理研究表明，兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸具有抗氧化、抗炎等作用[17-21]，基于此，本研究采用紫外分光光度法對檳榔多酚提取物中總多酚的含量進(jìn)行測定；并建立檳榔多酚提取物中兒茶素類成分的HPLC 測定方法，以期為檳榔多酚提取物的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

檳榔由聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科中藥房提供，沒食子酸（上海源葉生物科技有限公司，批號Y19M8C36143，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、兒茶素（中國食品藥品檢定研究院，批號110 877-201 604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）、表兒茶素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號K2009336，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、原兒茶酸（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-20 110 310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.78%)，甲醇、乙腈均為色譜純；酒石酸鈉鉀、七水合硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、甲酸均為分析純。

1.2 儀器

Ultimate 3000DGLC 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技）、超微量分光光度計NP80（德國IMPLEN公司），電子分析天平（上海梅特勒-托利多有限公司），超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)（上海天巨源設(shè)備有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檳榔多酚提取物的制備

取檳榔藥材20 kg，粉碎后過3 號篩，分別加入10 倍、8 倍、6 倍量的80%乙醇，80 ℃加熱回流提取3 次，時間分別為2、1.5、1.5 h，合并提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇，得浸膏。浸膏加入等體積水懸浮，加入到已經(jīng)處理好的AB-8 大孔吸附樹脂柱上，純水洗脫除雜，20%乙醇洗脫，收集20%洗脫液，減壓回收乙醇得浸膏，真空60 ℃干燥，制得干燥檳榔多酚提取物1，命名為：BLDF202001。大孔吸附樹脂經(jīng)80%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇得浸膏，真空60 ℃干燥，制得干燥檳榔多酚提取物2，命名為：BLDF202002。提取物2 加水懸浮，加入到已經(jīng)處理好的聚酰胺層析柱上，純水洗脫除雜，80%乙醇洗脫，收集80%洗脫液，減壓回收乙醇得浸膏，真空60 ℃干燥，制得干燥檳榔多酚提取物3，命名為：BLDF202003。

2.2 對照品及供試品溶液的制備

2.2.1 沒食子酸對照品溶液

精密稱取沒食子酸對照品5 mg，置于5 ml 容量瓶中，加蒸餾水超聲使其充分溶解，定容，配制成1 mg/ml 的對照品溶液。

2.2.2 兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸對照品溶液

分別精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含兒茶素1.92 mg/ml、表兒茶素2.46 mg/ml 和原兒茶酸1.12 mg/ml 的單一對照品儲備液。

2.2.3 檳榔多酚供試品溶液

精密稱取檳榔多酚提取物10 mg，置于10 ml容量瓶中，加乙醇超聲，使其充分溶解，定容，配制成1 mg/ml 的供試品溶液。

2.2.4 兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸供試品溶液

精密稱取檳榔提取物50 mg，置于10 ml 棕色容量瓶中，用甲醇超聲使其充分溶解，定容，配制成濃度為5 mg/ml 的供試品儲備液。精密吸取供試品儲備液2 ml，置于5 ml 容量瓶中，用50%的甲醇定容至刻度，搖勻，臨用前過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 檳榔總多酚含量測定

2.3.1 線性關(guān)系

采用酒石酸亞鐵法測定檳榔多酚的含量[14]，精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的沒食子酸對照品溶液各0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 ml，置于5 ml 容量瓶中，加蒸餾水至1 ml，再加入酒石酸亞鐵溶液1 ml，用pH 7.5 的磷酸緩沖溶液定容，混勻，靜置15 min，以蒸餾水為空白參照，在540 nm 處測定吸光度值。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得沒食子酸對照品的線性回歸方程：A=12.44X+0.073 1，r=0.999 4，表明沒食子酸對照品溶液在9.8～58.8 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取沒食子酸對照品溶液0.1 ml，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，重復(fù)測定6 次，沒食子酸對照品溶液的吸光度RSD 值為0.40%，表明該方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（BLDF202001）6 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，檳榔提取物中總多酚的吸光度RSD 值為1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（BLDF202001）10 mg，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、5、10、15、30 min 和1、2、4、8、12、24 h 后，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，檳榔提取物中總多酚吸光度的RSD 值為2.8%，表明該供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取同一供試品溶液（BLDF202001）0.1 ml，按“2.3.1”項(xiàng)下方法分別于7、9、11、13、15、17、21 min測定吸光度，檳榔提取物中總多酚吸光度的RSD值為0.93%。表明該供試品溶液在21 min 內(nèi)顯色穩(wěn)定，提示總多酚含量測定應(yīng)等待7 min 之后，在21 min 之前完成。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批（BLDF202001）已知含量的檳榔多酚提取物，平行6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液0.1 ml，置于5 ml 棕色容量瓶中，加入沒食子酸對照品溶液0.1 ml，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，沒食子酸的加樣回收率為98.44%，RSD 值為1.4%。。

2.3.6 樣品中總多酚的含量測定

吸取0.3 ml 的供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，平行測定3 次，計算總多酚的含量。3 批檳榔提取物中總多酚的含量見表1。

表1 3 批檳榔多酚提取物中總多酚的含量(n=3)

2.4 HPLC 測定檳榔多酚提取物中兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸的含量

2.4.1 色譜條件

色譜柱：AcclaimRSLC120 C18柱（3 mm×150 mm，3 μm）；流動相為：乙腈（A）-0.3%甲酸溶液（B），梯度洗脫程序見表2；檢測波長：280 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.4.2 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取50%的甲醇，混合對照品溶液，供試品溶液各5 μl，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各峰分離度均較好，各組分的分離度大于1.5，符合定量分析要求，理論板數(shù)以兒茶素計，不低于6 000。其中原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素的保留時間分別為4.273、7.017 和8.433 min，色譜圖見圖1。

圖1 各成分的HPLC 色譜圖

2.4.3 線性關(guān)系

分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下兒茶素對照品儲備液0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 ml；表兒茶素儲備液0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 ml；原兒茶酸儲備液0.005、0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 ml，用50%的甲醇定容于5 ml 容量瓶中，配制成不同濃度的對照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，以對照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3，表明兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸分別在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 檳榔多酚提取物中兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸的線性方程

2.4.4 精密度試驗(yàn)

取各成分濃度約為20 μg/ml 的混合對照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。兒茶素、表兒茶素和原兒茶酸峰面積的RSD 值分別為0.65%、0.96%、2.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（BLDF202001）按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、4、8、12、18 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積。兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸峰面積的RSD 值分別為1.1%、1.6%、1.1%，表明供試品溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取檳榔多酚提取物（BLDF202001）約50 mg，精密稱定，平行6 份，分別按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，計算供試品中兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.9%、2.4%、0.10%，RSD 值分別為1.0%、2.1%、2.1%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的檳榔多酚提取物（BLDF 202001）25 mg，置于5 ml 容量瓶中，共6 份，分別精密加入一定量的兒茶素、表兒茶、原兒茶酸對照品溶液，分別按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，計算回收率和RSD值。兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸的平均回收率為99.17%、101.67%、101.18%；RSD 值分別為2.5%、1.2%、1.8%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.8 樣品含量測定

取3 批按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件分別測定。3 個批號的供試品中兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸的含量見表4。

表4 3 批檳榔多酚提取物中兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸的百分含量(%, n=3)

3 討論

本研究比較了不同種類的流動相，首先參照文獻(xiàn)采用乙腈-2%乙酸溶液[21-22]，結(jié)果表兒茶素分離效果不好，且基線不平穩(wěn)。后采用甲醇-2%乙酸溶液，乙腈-0.2%甲酸溶液，乙腈-0.3%甲酸溶液3 種流動相系統(tǒng)，并比較了不同的柱溫、流速、進(jìn)樣量等條件確定最佳的色譜條件。結(jié)果顯示，采用柱溫35 ℃、乙腈-0.3%甲酸溶液梯度洗脫，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量5 μl 時，3 種成分分離效果較好。

本實(shí)驗(yàn)采用酒石酸亞鐵法測定檳榔多酚提取物中總多酚的含量，并建立了同時測定檳榔多酚提取物中兒茶素、表兒茶素和原兒茶酸的HPLC 測定方法，該法準(zhǔn)確度高、快速、簡便，可為檳榔多酚的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。