羥基七元瓜環(huán)固相微萃取測定環(huán)境水體中的硝基苯酚異構體

趙雨璇，董 南，董美玉

(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025)

作為重要有機合成中間體的鄰、間、對硝基苯酚在化工材料、農藥和染料等工業(yè)領域有著廣泛的應用。它們已被證實為環(huán)境內分泌干擾物之一，被聯(lián)合國環(huán)境署列為環(huán)境必測項目之一[1]。硝基苯酚在生產(chǎn)和使用過程中會隨生活污水及工業(yè)廢水進入環(huán)境水體，對動物、微生物、植物和人體健康造成巨大的危害[2]。這幾種異構體具有相似的物理化學性質，同時測定較難，從而一直是人們關注的課題。目前，環(huán)境水體中硝基苯酚的測定方法有色譜法、電化學方法[3]和毛細管電泳法[4]等。其中，色譜法是最常用的分析方法，包括氣相色譜[5]、氣相色譜-質譜聯(lián)用[6]及液相色譜-質譜聯(lián)用[7]等。色譜法由于檢測靈敏度較低而環(huán)境水樣中硝基苯酚的含量很低，需對樣品進行預處理以滿足儀器的測定要求。液/液萃取[6]、固相萃取[8]是傳統(tǒng)的樣品前處理方法，具有較好的富集、凈化能力，但大量的有毒、有害有機溶劑的使用，較復雜的操作以及較多的樣品使用量是其主要的缺陷。

固相微萃取(soild phase micro-extraction, SPME)于1989年由加拿大Waterloo大學Pawliszy教授課題組提出，是一種新型微型化和綠色環(huán)保的樣品前處理技術。這種方法具有樣品用量少、操作簡單、富集倍數(shù)高的特點，可以集成樣品的吸附、解吸、進樣于一體，不使用或使用很少的有機溶劑[9-10]。SPME有多種萃取形式，包括管內固相微萃取、固相微萃取纖維和固相微萃取攪拌棒(stir-bar sorptive extraction, SBSE)等。瓜環(huán)是一類人工合成的新型大環(huán)化合物。亞甲基橋聯(lián)不同數(shù)目的苷脲單元形成不同空腔大小的瓜環(huán)(Q[n],n=5～10)。瓜環(huán)對分子的識別作用可通過疏水的空腔和富含羰基氧原子的端口來完成，呈現(xiàn)出作用模式豐富、分子識別能力強的特點。疏水的空腔與中性小分子或分子的中性部分通過疏水作用發(fā)生主客體包結作用，而瓜環(huán)的端口因呈負電性可與分子的極性部分發(fā)生離子-偶極、氫鍵等作用[11-12]。

本文團隊報道將普通七元瓜環(huán)衍生化為單羥基七元瓜環(huán)(Q[7]-OH)后與端羥基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)一起作為固定相，溶膠-凝膠法制備了基于單羥基七元瓜環(huán)的固相微萃取攪拌棒并應用于食品中殘留雌激素的測定[13]。本文基于該萃取小棒良好的分子識別能力，首次對環(huán)境水樣中的3種硝基苯酚異構體同時進行了富集。為了提高萃取小棒對硝基苯酚異構體的萃取效率，對影響萃取效率的因素，如萃取時間、溶液pH值、鹽離子濃度、解吸溶劑、解吸時間等進行了優(yōu)化，并在最優(yōu)萃取條件下，利用SBSE-高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)-二極管陣列檢測器(diode-array detector, DAD)方法對水中的硝基苯酚異構體進行了測定，取得了滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈，色譜純；磷酸、氯化鈉、二氯甲烷，分析純。三氟乙酸(TFA)，γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷 (KH-560)，端羥基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)，甲基三甲氧基硅烷(MTMOS)，含氫硅油(PMHS)均購自阿拉丁試劑公司(上海)。去離子水由Millipore 公司超純水器制得。對照品鄰硝基苯酚、間硝基苯酚和對硝基苯酚購自阿拉丁試劑公司，用甲醇配成濃度為1.0×10-4g/mL的混合儲備液，于冰箱中4 ℃保存。混合貯備液經(jīng)甲醇進一步稀釋配成不同濃度的標準工作溶液并于冰箱中4 ℃保存。

島津LC-10A高效液相色譜儀(日本)，配備自動進樣器和二極管陣列檢測器(diode-array detector, DAD)； KQ2200 型超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司)；ZNCL-S-5D 多點智能磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)。TGL-16C高速離心機(上海安亭儀器廠)。

根據(jù)文獻[14]的方法, 實驗室自制單羥基七元瓜環(huán)(Q[7]-OH)，結構如圖1所示。

圖1 Q[7]-OH的結構式Fig.1 The structure of Q[7]-OH

1.2 萃取小棒(SBSE)的制備

將1.0 mm × 15 mm 的玻璃管作為萃取小棒的載體，其內心密封一段鐵絲并兩端燒結封死。將此玻璃管浸泡在l mol/L的NaOH溶液中8 h，去離子水清洗后再浸泡在0.1 mol/L的HCl溶液中2 h，最后用去離子水洗至中性并在120 ℃下烘干備用。

SBSE小棒的制備：于10 mL聚氯乙烯離心管中依次加入Q[7]-OH 20 mg，TFA(95%)300 μL，CH2CI2500 μL，OH-PDMS 300 μL，MTMOS 50 μL，PMHS 50 μL和KH-560 300 μL。離心管在渦旋振蕩器上混勻3 min后，在高速離心機上以12 000 r/min離心5 min，用滴管移出上清液置于另一個10 mL的聚氯乙烯離心管中。將處理好的玻璃管放入此清液中進行反復涂覆，涂覆的次數(shù)可控制小棒涂層的厚度。涂覆好的SBSE小棒于氮氣保護下室溫放置12 h成膠。

小棒老化：為使凝膠涂層固化，需對小棒進行加熱老化處理。成膠后的小棒放置于100 mL圓底燒瓶中，氮氣保護下升溫老化小棒。溫度設置為60 ℃，小棒保持30 min，然后升溫至120 ℃停留1 h，最后溫度升到180 ℃保持1 h完成小棒的老化。

小棒清洗：小棒涂層上未反應的固定相可通過清洗的方法去除。將制備好的小棒在80 ℃蒸餾水中浸泡清洗1 h可去除未反應的Q[7]-OH，然后再放入40 ℃二氯甲烷中回流清洗2 h可去除未反應的其他有機反應試劑。制備好的小棒經(jīng)電鏡測量厚度大約為 440 μm ，如圖2所示。小棒的涂層表面具有粗糙、多孔的特點，與文獻[13-14]的結果一致，因此有關的表征如電鏡、紅外、熱重等不過多贅述。

(a)小棒涂層的厚度 (b)小棒的形狀圖2 自制固相微萃取小棒涂層的厚度和小棒的形狀Fig.2 The coating thickness and the appearance of the solid phase microextraction stir bar

1.3 SBSE-HPLC 實驗方法

在10 mL帶密封墊的樣品瓶中放入1根自制的萃取小棒，精密加入經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后的水樣樣品8.0 mL，并在室溫下攪拌萃取50 min。萃取完成后，取出小棒用無塵紙擦干表面的水分。將萃取后的小棒放入200 μL樣品瓶內插管中，加入甲醇100 μL，超聲解吸10 min。取20 μL解吸液進行HPLC分析。小棒每次使用后，需用5 mL甲醇分別超聲洗滌3次以除去吸附的雜質。

1.4 色譜條件

色譜柱，ODS-BP(SinoChrom，4.6 mm×200 mm, 5 μm)；檢測波長220 nm；流動相，甲醇-水(用磷酸調pH=5.0)，其中甲醇的體積分數(shù)為30%；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；溫度，室溫。

2 結果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

用自制的SBSE小棒考察了解吸溶劑的種類、溶液的pH值、鹽離子濃度、萃取時間、解吸時間等因素對3種硝基苯酚異構體萃取效率的影響，確定最佳萃取條件。

2.1.1解吸溶劑的考察

解吸溶劑是影響小棒萃取效率比較重要的因素。合適的解吸溶劑可使吸附的待測物質完全解吸以提高萃取效率。本實驗考察了甲醇、乙醇和乙腈作為解吸溶劑對硝基苯酚異構體萃取效率的影響，結果如圖3(a)所示。從圖3(a)可以看出：甲醇對3種化合物的解吸效果最好，故選做本實驗的解吸劑；自制小棒對鄰硝基苯酚的萃取效率最好，這可能是因為鄰硝基苯酚的空間位阻最小，最有利于分子上的苯環(huán)進入七元瓜環(huán)的空腔而發(fā)生相互作用。

2.1.2萃取溶液的pH值

酸性或堿性化合物在溶液中的存在形式受溶液pH值的影響很大。一般中性存在形式更利于涂層的萃取。酚類化合物是酸性物質，在酸性條件下以分子形式存在有利于萃取。從圖3(b)可以看出，3種硝基苯酚異構體在pH為3時，萃取效率均為最佳，故選擇pH為3作為最佳萃取pH值。

2.1.3鹽離子濃度

鹽效應可通過增加溶液中離子強度的方式降低有機物在水中的溶解度，使待測物以分子形式析出，有利于在涂層上的吸附。從圖3(c)可以看出：隨著加入鹽離子濃度的增大，3個硝基苯酚化合物的萃取效率提高，鹽離子濃度為0.30 g/mL時幾乎已達到其飽和濃度，因此采用飽和氯化鈉作為鹽離子濃度。

2.1.4萃取時間

萃取時間越長，待測物在小棒上吸附的量越多，最后吸附達到平衡，萃取量不再增加。從圖3(d)可以看出，當萃取時間為50 min時，吸附量達到最大，所以選擇50 min為最佳萃取時間。

2.1.5解吸時間

解吸時間越長，目標物解吸得越徹底，但過長的解吸時間會縮短涂層的使用壽命。從圖3(e)可以看出，解吸時間為10 min 時就可獲得最好的萃取效率，因此選擇10 min為最佳解吸時間。

圖3 SBSE攪拌棒對硝基苯酚異構體萃取條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the extraction conditions for nitrophenol isomers with SBSE

2.2 SBSE-HPLC-DAD分析方法的方法學驗證

精密量取相同體積不同濃度的混合標準溶液分別加入到8 mL水樣中，配成一系列濃度的加標溶液，按照1.3 和 1.4的方法進行處理并測定。以3個硝基苯酚異構體的峰面積對質量濃度進行線性回歸，得到3個硝基苯酚的線性范圍和相關系數(shù)。方法的檢測限(Ld)和定量限(Lq)分別按照公式Ld= 3S0/S和Lq= 10S0/S進行計算，其中，S0為10次空白試劑所測值的標準偏差，S為分析校準曲線的斜率。日內精密度以濃度為0.8 mg/L的樣品在一日內連續(xù)測定5次的相對標準偏差來表示；日間精密度則以同一個樣品連續(xù)測定5 d，每天重復測定3次的相對標準偏差表示。所有測定結果如表1所示。從表1可以看出：本法的線性范圍為0.01～10.00 mg/L，檢測限為0.002～0.006 mg/L，日內、日間精密度的相對標準偏差(DRS)為2.9%～7.5%, 說明該法具有較寬的線性范圍、良好的靈敏度和重現(xiàn)性。

表1 3個硝基苯酚異構體的分析參數(shù)Tab.1 Analysis parameters of three nitrophenol isomers

2.3 實際樣品分析

為檢驗本方法的適用性，對當?shù)鼗ㄏ铀?、自來水和校園湖水進行了檢測，沒有檢測出3種硝基苯酚異構體。以花溪河水為樣本，在高、中、低3個濃度水平進行了加標回收率實驗，相關的色譜圖如圖4所示，測定結果見表2。3個加標濃度的平均相對回收率為71.5%～116.8%，相對標準偏差為2.4%～8.7%，說明所建立方法的準確度和精密度良好，可用于實際水樣中3種硝基苯酚異構體的測定。

圖4 SBSE小棒萃取硝基苯酚異構體的HPLC-DAD色譜圖Fig.4 The HPLC-DAD chromatograms of nitrophenol isomers extracted by SBSE

表2 花溪河水樣品的分析測定結果Tab.2 Determination of water samples from Huaxi River

2.4 本文方法與其他分析方法的比較

將本文方法與文獻報道的測定水樣中硝基苯酚異構體的方法進行了比較，結果見表3。從表3可以看出，本文方法具有更好的靈敏度，樣品處理簡單、環(huán)保、取樣量少。結果表明：自制萃取小棒選擇性好，萃取性能高，能較好地提高儀器測定的靈敏度。

表3 本文方法與其他分析方法的比較 Tab.3 Comparison of this method with other analytical methods

3 結論

通過溶膠-凝膠方法制備了基于單羥基七元瓜環(huán)的固相微萃取攪拌棒，聯(lián)用HPLC-DAD建立了水樣中3種硝基苯酚異構體的測定方法。通過對萃取條件的優(yōu)化，得到固相微萃取攪拌棒對酚類物質萃取的最優(yōu)萃取條件為：萃取時間50 min, 溶液的pH值為3.0，鹽離子濃度為飽和氯化鈉，解吸溶劑為甲醇，解吸時間10 min。方法的樣品預處理簡單、環(huán)保、樣品用量少。測定結果準確、靈敏，滿足水樣中痕量硝基苯酚異構體的檢測要求。