AdipoR1/STAT3 通路在異丙酚后處理保護(hù)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

彭 粵，韓 紅，張 欣，任從才，武雅琦，鄧夢娟，伍德強(qiáng)

（1 中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院麻醉科 廣東 深圳 518034）

（2 中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院心臟外科 廣東 深圳 518034）

冠脈搭橋手術(shù)即再灌注療法是治療缺血性心臟病的主要方式，但其本身會導(dǎo)致組織的致死性損傷，即缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）。硏究發(fā)現(xiàn)，再灌注早期應(yīng)用靜脈麻醉藥異丙酚（丙泊酚）可模擬缺血后處理，減少心肌梗死的發(fā)生，稱為異丙酚（丙泊酚）后處理（propofol postconditioning, PPC）；激活第一型血紅素氧化酶（heme oxygenase1, HO-1）進(jìn)而活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator oftranscription3, STAT3）是PPC 抗IRI 的主要機(jī)制。但糖尿病患者對異丙酚后處理的心肌保護(hù)作用不敏感，本研究旨在進(jìn)一步闡明糖尿病心肌中IRI 的分子機(jī)制并尋求相應(yīng)的治療措施，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗材料

（1）實(shí)驗動物：清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6 ～8 周齡，體重200 ～220 g，本研究符合倫理學(xué)要求（動物倫理審批號：中大附八科研倫理2020-019-01）。（2）主要試劑與儀器：鏈脲菌素STZ，水合氯醛，異丙酚，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、ECL 發(fā)光液，LC3 Ⅱ/Ⅰ、HO-1、STAT3、p-STAT3 一抗、APN-si、AdipoR1-si、HO-1-si、STAT3-si、APN-adv、HO-1-adv，TUNEL 試劑盒，二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺，冷凍離心機(jī)，ALC-V9A 呼吸機(jī)，Vista120 心電圖儀，One Touch 血糖儀等。

1.2 實(shí)驗方法

（1）大鼠Ⅰ型糖尿病心肌缺血-再灌注損傷模型制備。Ⅰ型糖尿病大鼠模型制備：50 只實(shí)驗鼠自由攝食飲水，設(shè)置飼養(yǎng)條件：室溫21 ～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h 晝夜光照，普通飼料喂養(yǎng)，一次性尾靜脈注射STZ（60 mg/kg）（pH 為4.2 ～4.5 的檸檬酸緩沖液中溶解，注意避光），72 h 后連續(xù)8 周監(jiān)測大鼠空腹12 h 后的血糖與胰島素水平，血糖≥15 mmol/L，并出現(xiàn)多飲多食多尿癥狀時視為模型誘導(dǎo)成功。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），進(jìn)行氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)行容量控制機(jī)械通氣模式，呼吸參數(shù)設(shè)定：潮氣量1 mL/100 g，呼吸頻率45 ～60 次/分，吸、呼比為1：1.5。使用生理信號記錄儀（八道），連續(xù)監(jiān)測三導(dǎo)聯(lián)心電圖；股靜脈穿刺置管連接微量輸液泵用于輸注丙泊酚/0.9%氯化鈉溶液。右側(cè)頸動脈穿刺置管連接壓力換能裝置，監(jiān)測LVSP、+dp/dt、-dp/dt。穩(wěn)定15 min 后，置右側(cè)臥位，左側(cè)第3 ～5 肋間開胸，剪開心包，大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型制備：左冠狀動脈前降支走行下方穿6-0 絲線，心肌和結(jié)扎線之間墊直徑為2 mm，長0.5 cm 的聚乙烯硬管，結(jié)扎線收緊，見結(jié)扎部位以下心肌顏色明顯變暗，心電圖示ST 段顯著抬高，說明缺血成功；松開結(jié)扎線后，心臟表面顏色變紅，抬高的ST 段下降50%以上表明再灌注成功，缺血30 min，再灌注2 h。（2）動物分組與給藥。將42 只Ⅰ型糖尿病大鼠隨機(jī)分為6 組（= 7）：Ⅰ組：對照組，只穿線，不結(jié)扎，靜脈持續(xù)輸注3 mL/kg/h 0.9%氯化鈉溶液；Ⅱ組：心肌缺血-再灌注損傷組，缺血前10 min靜脈持續(xù)輸注3 mL/kg/h 0.9%氯化鈉溶液；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組：心肌缺血再灌注損傷-異丙酚后處理低、中、高劑量組，缺血后27 min 靜脈持續(xù)輸注不同濃度丙泊酚2、4、8 mg/kg 各8 min，再用灌注液灌注2 h。（3）建立心肌細(xì)胞HR 模型。將H9C2 細(xì)胞用含1 g/L 葡萄糖，1%青霉素/鏈霉素+10%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基傳代。傳代后選取7 ～15 代細(xì)胞給予實(shí)驗處理，將細(xì)胞分組如下：①低糖培養(yǎng)：對照組（C 組），缺氧復(fù)氧組（HR 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理組（HR+PPC 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理+HO-1 沉默組（HR+PPC+HO-1 si 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理+STAT-3 沉默組（HR+PPC+STAT-3-si 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理+STAT-3 沉默+HO-1 轉(zhuǎn)染組（HR+PPC+STAT-3-si+HO-1-adv 組），APN沉默組（HR+PPC+APN-si 組）。②高糖培養(yǎng)：對照組（C組），缺氧復(fù)氧組（HR 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理組（HR+PPC 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理+APN 腺病毒組（HR+PPC+APN-adv 組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理+APN 腺病毒+STAT3 沉默組（HR+PPC+APN-adv+STAT3-si組），缺氧復(fù)氧+異丙酚后處理+APN 腺病毒+AdipoR1沉默組（HR+PPC+APN-adv+AdipoR1-si 組）。每組設(shè)置3 個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁12 h 生長至30%左右時更換新鮮培養(yǎng)基，低糖組用低糖培養(yǎng)基（5.5 mM），高糖組用高糖培養(yǎng)基（35 mM）培養(yǎng)48 h。除對照組外，每組細(xì)胞棄去陳舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，用37 ℃預(yù)熱的PBS 清洗3 次后更換15 mL 無糖無血清DMEM 培養(yǎng)基。連接好氣體管道，打開缺氧盒進(jìn)出氣口夾子，75%乙醇擦拭缺氧盒內(nèi)外，將裝有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放在缺氧盒中，蓋上蓋子密封好，打開94%氮?dú)?5%二氧化碳+1%氧氣氣體，將氣體流量控制在20 ～25 L/min，給缺氧盒充氣15 min，使缺氧盒內(nèi)氧氣充分排出，然后依次關(guān)閉缺氧盒出氣口、總進(jìn)氣口、缺氧盒進(jìn)氣口，并迅速用止血鉗夾閉缺氧盒側(cè)面通氣管道增強(qiáng)密閉性。再將缺氧盒放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)45 min 模擬缺氧環(huán)境，復(fù)氧時PPC 組更換含有異丙酚的新鮮培養(yǎng)基處理15 min，然后各組更換低糖/高糖新鮮培養(yǎng)基復(fù)氧2 h。復(fù)氧2 h 后，分別吸取細(xì)胞上清并刮取細(xì)胞作后續(xù)實(shí)驗。（4）檢測指標(biāo)及方法。①通過監(jiān)測心臟血流動力學(xué)反映心臟功能：通過Millar tip catheter（F2, Model SPR-612 Milar）監(jiān)測心臟功能。將Millar tip catheter 從小鼠右頸總動脈插入左心室，記錄各項血流動力學(xué)指標(biāo)，如心率（Heart rate, HR）、收縮末容積（end systolic volume, ESV）、舒張末容積（end diastolic volume, EDV）、收縮末壓力（end systolic pressure, ESP）、舒張末壓力（end diastolic pressure,EDP）、每搏輸出量（stroke output, SV）、平均動脈壓（mean arterial pressure, MAP）左室內(nèi)壓最大上升與下降速率（±m(xù)axjmum rate of rise of left ventri cular pressure，±m(xù)ax dP/dt）等。②檢測心肌梗死面積：再灌注結(jié)束時再次結(jié)扎LAD，左室內(nèi)注入2%伊文氏藍(lán)2 ～3 mL，離斷并取出心臟，用PBS 沖洗兩遍，去除心房與右心室后低溫（-80 ℃）冰凍2 h。將冰凍后的心臟自心底向心尖垂直于心臟縱軸方向平均切成6 片1 mm 厚的環(huán)行切片，置于1%TTC 的PBS 中37 ℃孵育20 min。以濕重計算心肌缺血區(qū)（伊文氏藍(lán)未染色而呈現(xiàn)磚紅色）、梗死區(qū)（TTC 未染色而呈現(xiàn)蒼白色）的重量。心肌梗死范圍（%）=TTC 未染區(qū)/伊文氏藍(lán)未染區(qū)×100%。③Elisa法檢測缺血前及再灌注后血漿及心肌APN 水平：缺血前和再灌注后通過股動脈采集大鼠外周血，將血漿標(biāo)本以4 ℃、3 000 r/min 離心10 min 后，取上清為血漿標(biāo)本。將血漿標(biāo)本及研磨后的心肌組織液按各Elisa 試劑盒說明書操作。④TUNEL 試劑盒測定各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平：心肌組織常規(guī)石蠟切片脫蠟，采用末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 原位平端標(biāo)記法染色檢測細(xì)胞凋亡。染色結(jié)束后，在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果以Tunel 陽性細(xì)胞核/總細(xì)胞核×100%表示。⑤采用Western blotting 分析心肌組織中LC3II/LC3I、HO-1和STAT3 蛋白及磷酸化水平：取液氮凍存的大鼠心肌組織研磨成粉末，根據(jù)樣本量加入RIPA 裂解緩沖液，冰浴30 min 充分裂解后在4 ℃下12 000×g 離心30 min，取上清液為組織總蛋白，按照蛋白定量BCA 試劑盒對蛋白進(jìn)行定量分析?？偟鞍咨蠘恿繛?0 ～50 μg，用8%～12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF 膜2 h，洗膜3×5 min 后加入對應(yīng)的一抗（1:1 000），置于4 ℃搖床過夜，再度洗膜3×5 min 后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1:5 000 ～1:10 000 稀釋），室溫孵育2 h,充分洗膜后加入ECL 發(fā)光劑反應(yīng)1 min，將PVDF 膜迅速置于塑封膜并放入暗盒進(jìn)暗房顯影，然后用Image J 軟件對條帶進(jìn)行灰度統(tǒng)計分析。⑥觀察AdipoR1、AdipoR2、HO-1、STAT3 等蛋白的亞細(xì)胞定位（使用免疫熒光染色分析、共聚焦顯微鏡）：心肌組織冰凍切片復(fù)溫后，用0.1%Triton x-100 破膜后，10%羊血清室溫封閉1 h，加入分別來源于不同種屬的單克隆抗體（1:100），4 ℃孵育過夜。PBS 充分洗滌后分別加入帶有熒光標(biāo)記的相應(yīng)二抗IgG，常溫孵育2 h，充分洗滌后封片，在共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 PPC 對減輕糖尿病心肌缺血再灌注損傷的效果

異丙酚后處理（PPC，2 mg/kg）減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注（I/R）損傷，其保護(hù)作用伴隨著心肌APN含量，HO-1 和磷酸化STAT3 的表達(dá)量升高，但是在糖尿病大鼠中，PPC 保護(hù)作用消失，見圖1。

圖1 異丙酚后處理（PPC，2 mg/kg）減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注（I/R）損傷

2.2 AdipoR1 或STAT3 缺失對APN 恢復(fù)糖尿病心臟對PPC 保護(hù)作用的敏感性

為了進(jìn)一步研究APN 恢復(fù)糖尿病心肌對PPC 敏感性的機(jī)制，我們在原代心肌細(xì)胞和H9C2 心肌細(xì)胞上展開實(shí)驗并得出以下結(jié)果。PPC 可減輕低糖培養(yǎng)下H9C2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后過度的自噬與凋亡，單獨(dú)沉默HO-1 或STAT3 可取消PPC 的這種保護(hù)作用，而沉默APN 后這種保護(hù)作用并沒有消失，而且在沉默STAT3 后即使轉(zhuǎn)染HO-1腺病毒來增加HO-1 的表達(dá)，PPC 的保護(hù)作用仍然無法恢復(fù)，見圖2A-B。高糖培養(yǎng)下PPC 并不能減輕H9C2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后過度的自噬與凋亡，外源性的APN 可恢復(fù)高糖環(huán)境中H9C2 細(xì)胞對PPC 的敏感性，減少心肌細(xì)胞凋亡與自噬，但沉默HO-1 或STAT3 可取消PPC 的保護(hù)作用，見圖2C-D。

圖2 異丙酚后處理（PPC）減少H9C2 細(xì)胞缺氧再復(fù)氧（HR）后細(xì)胞凋亡的程度和過度自噬

3.討論

糖尿病如何導(dǎo)致并加重缺血性心臟病、闡明糖尿病心臟對麻醉藥物后處理所介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用不敏感的分子機(jī)制、并制定相關(guān)有效的防治措施，降低糖尿病患者圍術(shù)期并發(fā)癥及病死率是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究亟待解決的課題。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病心肌中PPC 失去保護(hù)作用且增加異丙酚的劑量并不能有效減少梗死面積，PPC 也不能再升高心肌HO-1 及p-STAT3 的水平，這提示在高糖狀態(tài)下PPC 已不通過活化HO-1 來激活STAT3。而外源性給予APN 使心肌p-STAT3 水平恢復(fù)的同時也恢復(fù)了糖尿病心肌對PPC 的敏感性，但外源性給予APN 不能恢復(fù)心肌HO-1 的水平。上述結(jié)果提示我們糖尿病條件下PPC 抗心肌IRI 可能不是通過HO-1 而是由其他途徑激活STAT3 而達(dá)到的。APN 是新近發(fā)現(xiàn)的一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的，具有抗糖尿病、調(diào)節(jié)能量代謝、保護(hù)血管和心肌等重要生理作用的分子，隨后的研究發(fā)現(xiàn)人類心肌細(xì)胞也能分泌APN。糖尿病患者體內(nèi)APN 水平顯著降低，且與心血管疾病發(fā)病率呈高度負(fù)相關(guān)，提示脂聯(lián)素水平降低可能是導(dǎo)致糖尿病誘發(fā)心血管疾病的重要原因之一。

本研究前期動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，PPC 可以增加非糖尿病大鼠心臟IRI 后APN 的含量，但PPC 的這種作用在糖尿病心臟中消失，與前人的研究結(jié)果相一致。動物實(shí)驗及臨床研究均表明，循環(huán)血液中APN 水平在糖尿病個體中降低且APN 本身有激活細(xì)胞自噬的能力?，F(xiàn)有研究顯示，在非糖尿病狀態(tài)下，APN 可通過心臟特異性APN受體1（AdipoR1）而非AdipoR2 激活心肌成纖維細(xì)胞STAT3。而在糖尿病狀態(tài)下心肌APN 水平降低并伴隨心肌STAT3 的激活減少，外源性APN 恢復(fù)了高糖培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞對PPC 的敏感性，減少了高糖狀態(tài)下H9C2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡和過度自噬，但STAT3或AdipoR1 siRNA 的使用則取消了PPC 的保護(hù)作用。我們在糖尿病動物上實(shí)驗發(fā)現(xiàn)APN 恢復(fù)PPC 的保護(hù)作用伴隨著AdipoR1 而不是AdipoR2 含量的增加，這也再次驗證了他人的結(jié)果。

綜上所述，PPC 在正常及糖尿病狀態(tài)下減輕心肌缺血再灌注損傷具有不同的保護(hù)信號通路。PPC 通過激活HO-1/STAT3 途徑減輕正常心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬，在糖尿病中，PPC 不再通過增加HO-1 的含量來激活STAT3。APN 可恢復(fù)糖尿病心肌對PPC 心肌保護(hù)作用的敏感性并減輕糖尿病大鼠心肌梗死面積，合用PPC 保護(hù)作用更加顯著，其機(jī)制可能是通過脂聯(lián)素受體（AdipoR1）重新激活STAT3 來減輕心肌細(xì)胞過度自噬與凋亡從而達(dá)到抗心肌細(xì)胞死亡的作用。