超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鮮蛋中氟苯尼考?xì)埩袅康牟淮_定度分析

譚美齡，閻睿，賀靈芝，張椿翊，任靜

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000； 2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100）

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC）是新一代酰胺醇類抗生素，具有抗菌譜廣、耐藥性小、抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于人和動(dòng)物疾病的防治［1］。氟苯尼考具有一定的免疫毒性和胚胎毒性，可通過疾病治療或飼料添加的方式在家禽體內(nèi)殘留并不斷積累，進(jìn)而傳遞至蛋品中，并通過食物鏈對(duì)人體產(chǎn)生危害［2］。我國(guó)在GB 31650—2019 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》［3］中規(guī)定產(chǎn)蛋期家禽禁用氟苯尼考。

在氟苯尼考?xì)埩袅康臋z測(cè)工作中，由于儀器設(shè)備、試劑等諸多因素，分析結(jié)果存在誤差，需要進(jìn)行測(cè)定不確定度分析。不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)的表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性的參數(shù)［4］。一個(gè)科學(xué)、準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果應(yīng)包含與其相關(guān)的不確定度來表示該測(cè)量值的可信賴程度。

筆者根據(jù)JJF 1135—2005 《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》、JJF 1059.1—2012 《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS—GL006—2019 《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》等相關(guān)指導(dǎo)性文件的要求［5-8］，參照GB/T 22338—2008 《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》［9］液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定鮮蛋中氟苯尼考?xì)埩袅?，并?duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，為提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和評(píng)估其它農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)方法的不確定度提供技術(shù)的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜系統(tǒng)-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：色譜系統(tǒng)為DIONEX UltiMate-3000型，三重四極桿質(zhì)譜儀為TSQ Quantum Access Max型，配ESI離子源，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

高速離心機(jī)：3-30KS型，德國(guó)SIGMA實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司。

微孔濾膜：孔徑為0.22 μm，北京迪馬科技有限公司。

氟苯尼考（FFC）：批號(hào)為B0002300，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司。

乙酸銨、正丙醇、正己烷：分析純，重慶川東化工公司。

鮮蛋：市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境及器具

所有操作均在（20±5）℃的環(huán)境溫度及50%～70%的相對(duì)濕度條件下進(jìn)行，并假設(shè)溫度波動(dòng)服從均勻分布［10］。在該環(huán)境條件下，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.1×10-3℃-1，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1。本實(shí)驗(yàn)所用玻璃量器均符合A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，容量允差均以20 ℃時(shí)的示值為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取FFC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 08 g，用甲醇配制成FFC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（質(zhì)量濃度為99.792 μg/mL）；準(zhǔn)確移取上述溶液1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇配制成FFC標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（質(zhì)量濃度為997.92 ng/mL）；準(zhǔn)確移取FFC標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇配制成FFC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度為99.792 ng/mL）；用合適的移液器分別準(zhǔn)確吸取FFC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100、200、500、1 000 μL至5只10 mL容量瓶中，加入10%甲醇水溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.499、0.998、1.996、4.990、9.979 ng/mL的FFC系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品制備

參照GB/T 22338—2008［9］中的方法對(duì)鮮蛋中的FFC進(jìn)行提取和凈化。氮?dú)獯蹈珊?，?0%甲醇水溶液復(fù)溶至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 色譜

色 譜 柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為5 mmol/L乙酸銨水溶液，設(shè)置梯度洗脫程序，0～1.5 min，A相為體積分?jǐn)?shù)為10%，1.5～4 min，A相從10%線性增加至90%，并保持至7.50 min，7.50～7.51 min，A相從90%線性降回至10%，并保持至10 min，流量為0.20 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃。

1.5.2 質(zhì)譜

離子源：電噴電離ESI（-）；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（selective reaction monitoring，SRM）；電噴霧電壓：-2 500 V；霧化器蒸發(fā)溫度：300 ℃；毛細(xì)管溫度：350 ℃；鞘氣：35 Arb；輔助氣：10 Arb；離子吹掃氣：0；定量離子對(duì)：m/z355.942＞335.837;定性離子對(duì)：m/z355.942＞184.913；碎裂電壓：-53 V；碰撞電壓：-12 V（定量）/-21 V（定性）。

1.6 數(shù)學(xué)模型的建立

式中：X——試樣中FFC的殘留量，μg/kg；

c——利用擬合曲線法測(cè)得試樣溶液中FFC

的殘留濃度，ng/mL；

V——試樣溶液最終定容體積，mL；

F——重復(fù)性系數(shù)；

m——稱取試樣的質(zhì)量，g；

R——回收率，%。

2 不確定度來源

根據(jù)數(shù)學(xué)模型，影響鮮蛋中氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定結(jié)果的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度、樣品溶液體積量取、稱樣質(zhì)量、重復(fù)性。不確定度來源示意圖如圖1所示。

圖1 不確定度的來源

3 不確定度評(píng)定

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（ρ）引入的不確定度

因標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定來源主要有FFC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、稱量過程、溶液的定容及移取過程、曲線擬合過程［11-13］。

3.1.1 FFC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，F(xiàn)FC的純度誤差為2.0%，按照B類評(píng)定，均勻分布的包含因子k=，則由FFC純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(ρ)=2.0%/99.0%/k=0.011 7

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度。根據(jù)電子天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.05mg，按照B類評(píng)定，均勻分布的包含因子k=，則由FFC稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(m)=0.05/10.08/k=0.002 86

（3）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容引入的不確定度。根據(jù)JJG 196—2006 《常用玻璃量器》［12］規(guī)定，100 mL容量瓶容量允差為±0.10 mL，以對(duì)稱分布計(jì)算［14］，取包含因子k1=；溫度波動(dòng)服從均勻分布［10］，取包含因子k2=。由容量和溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u(V1)=0.10/k1=0.040 82 mL

u(V2)=5×1.1×10-3×100/k1=0.317 54 mL

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

綜上，由FFC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.2 FFC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的稀釋

假設(shè)（1±0.007）mL單標(biāo)線吸量管容量誤差服從均勻分布，取包含因子k=，標(biāo)準(zhǔn)中間溶液及FFC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液移液過程產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：?

u(y11)=0.007/k=0.004 04 mL

u(y12)=5×1.1×10-3×1/k=0.003 18 mL

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

假設(shè)（10±0.020）mL容量瓶服從均勻分布，取包含因子k=，在FFC標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的定容過程中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u(d11)=0.10/k=0.057 74 mL

u(d12)=5×1.1×10-3×100/k=0.317 54 mL

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

假設(shè)（100±0.10）mL容量瓶均服從均勻分布，取包含因子k=，在FFC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的定容過程中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u(d21)=0.020/k=0.011 55 mL

u(d22)=5×1.1×10-3×10/k=0.031 75 mL

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其中，F(xiàn)FC標(biāo)準(zhǔn)中間溶液及FFC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液具有相同的（1±0.007） mL單標(biāo)線吸量管移液過程。綜上，由FFC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的稀釋產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合

對(duì)FFC標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的5種質(zhì)量濃度分別平行測(cè)定2次，色譜峰面積見表2。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的色譜峰面積

3.1.3 FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制

根據(jù)JJG 646—2006 《移液器檢定規(guī)程》的要求，按照均勻分布處理［15］，取包含因子k=，移液過程引入的不確定度見表1。

由表1中的數(shù)據(jù)，可以得出由FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），擬合得到線性回歸方程為Y=36 580X+2 474，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。陽性鮮蛋樣品質(zhì)量濃度的4次測(cè)定結(jié)果分別為7.110、7.400、7.577、7.523 ng/mL。

表1 FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制引入的不確定度

回歸方程的估計(jì)誤差S按照式(2)計(jì)算，F(xiàn)FC擬合曲線的相對(duì)不確定度按照式(3)計(jì)算：

式中，S——估計(jì)誤差；

Ai——標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積；

a——擬合曲線的截距；

b——擬合曲線的斜率；

ρi——標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；

n——FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線上點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)［16］。

式中：ρ0——通過曲線回歸方程計(jì)算出的鮮蛋中FFC濃度［17］；

n——FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線上點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)［16］；

p——陽性鮮蛋樣品的測(cè)定次數(shù)，p=4；

ρi——標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入式(2)與式(3)，得到S=7439，urel(c4)=0.018 7。

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（ρ）引入的不確定度：

3.2 樣品溶液體積量?。╒）引入的不確定度［18］

在樣品溶液的定容過程中，刻度試管定容至1 mL的體積允許誤差為±0.008 mL，代入均勻分布的包含因子k=3，由容量和溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

u(V1)=0.008/k=0.004 62 mL

u(V2)=5×2.1×10-4×1/k=0.000 61 mL

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3 稱樣質(zhì)量（m）引入的不確定度

根據(jù)電子天平檢定證書，得其最大允許誤差為±0.000 5 g，按照B類評(píng)定，代入均勻分布的包含因子k=，其相對(duì)不確定度：

urel(m)=0.000 5/5.0011/k=0.000 06 mL

3.4 測(cè)量重復(fù)性（F）引入的不確定度

向陰性鮮蛋樣品中加入FFC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品制備過程同法處理［19-20］。按照A類評(píng)定，將重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值分別代入u(F)=s(F)/，urel(F)=u(F)/，計(jì)算結(jié)果見表3。

3.6 合成不確定度

將各分量的相對(duì)不確定度列于表4，則合成各分量的相對(duì)不確定度：

表4 各分量的相對(duì)不確定度

3.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果報(bào)告

在本研究條件下，陽性鮮蛋中FFC殘留量的測(cè)定值經(jīng)回收率校正為=1.49 μg/kg。取包含因子k=2，置 信 水 平 為95%［21］，擴(kuò) 展 不 確 定 度U=urel(X)×k×=0.19μg/kg。該鮮蛋中FFC 留量的定值結(jié)果為(1.49±0.19)μg/kg。

4 結(jié)語

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 22338—2008 《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》［9］測(cè)定鮮蛋中氟苯尼考的殘留量，依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估了實(shí)驗(yàn)過程中多種因素引入的不確定度。其中影響檢測(cè)結(jié)果的主次因素依次為：標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制與稀釋、方法回收率、測(cè)量重復(fù)性、體積量取、樣品稱量。

在實(shí)際操作中，應(yīng)使用具有溯源性的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；正確配制校準(zhǔn)曲線，提高其線性相關(guān)系數(shù)；增加平行測(cè)定次數(shù)來降低誤差；采用國(guó)標(biāo)方法和經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法，優(yōu)化樣品處理過程，并使用回收率來校正測(cè)量值；定期校準(zhǔn)測(cè)量?jī)x器，并使用校準(zhǔn)證書上的修正值，保持儀器較高的精度、靈敏度和穩(wěn)定性；提高實(shí)驗(yàn)人員的檢測(cè)技術(shù)水平，減少測(cè)量不確定度，從而確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為科學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)，為評(píng)定其它相關(guān)檢測(cè)方法的不確定度提供技術(shù)參考。