Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)裝置的研建

程環(huán)，劉松竹，何春澤，何允剛，耿杰

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院科研保障中心，北京 100850； 2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院條件建設(shè)處，北京 100850）

生物安全柜是一種負(fù)壓過濾排風(fēng)柜，可防止含有病原微生物的氣溶膠在實(shí)驗(yàn)操作過程中逸出造成生物氣溶膠污染［1-3］。作為保護(hù)實(shí)驗(yàn)樣本、環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)人員的第一道屏障，生物安全柜的性能必須得到有效校準(zhǔn)或測試，才能充分地保證實(shí)驗(yàn)樣品、環(huán)境、及實(shí)驗(yàn)人員的生物安全［4-8］。國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1815—2020 《Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)規(guī)范》2020年正式實(shí)施，據(jù)調(diào)研軍內(nèi)只有極少數(shù)機(jī)構(gòu)開展生物安全柜校準(zhǔn)或測試，暫無校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，所以在軍內(nèi)建立生物安全柜校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)非常重要［9-10］。

相較于歐洲標(biāo)準(zhǔn)EN 12469［11］、美國標(biāo)準(zhǔn)NSF 49等國外標(biāo)準(zhǔn)［12］，JJF 1815—2020 《Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)規(guī)范》［13］更為科學(xué)和完善，如表1所示。筆者依據(jù)JJF 1815—2020 《Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)規(guī)范》對Ⅱ級生物安全柜各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測量或校準(zhǔn)。建立Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)裝置，對生物安全柜下降氣流流速、流入氣流流速、氣流流型、潔凈度、人員、產(chǎn)品和交叉污染保護(hù)等進(jìn)行測量，可以防止實(shí)驗(yàn)操作過程中產(chǎn)生的感染性微生物氣溶膠對工作人員的威脅，防止生物安全柜以外的污染物進(jìn)入安全柜對實(shí)驗(yàn)樣品造成污染，防止試驗(yàn)操作過程中產(chǎn)生的氣溶膠造成試驗(yàn)樣品的交叉污染，對促進(jìn)生物、化學(xué)等相關(guān)軍事醫(yī)學(xué)研究具有非常重要的意義［14-15］。

表1 生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)表

1 標(biāo)準(zhǔn)裝置的構(gòu)成、工作原理或方法

1.1 主標(biāo)準(zhǔn)器及測量標(biāo)準(zhǔn)性能

風(fēng)速儀：6501-BG型，編號為449547，測量范圍為0～10 m/s，最大允許誤差為±0.015 m/s（或示值的±3%），經(jīng)計(jì)量確認(rèn)符合要求，日本KANOMAX集團(tuán)。

照度計(jì)：941型，編號為31910075，測量范圍為0～1 500 lx，最大允許誤差為±10%，經(jīng)計(jì)量確認(rèn)符合要求，美國Fluck公司。

聲級計(jì)：AWA5636型，編號為351697，測量范圍為30～130 dB，最大允許誤差為±1 dB，分辨力為0.1 dB，有A計(jì)權(quán)模式，計(jì)量檢定合格，杭州愛華儀器有限公司。

塵埃粒子計(jì)數(shù)器：3016型，編號為190902032，塵埃粒徑測量范圍為0.3～10 μm，計(jì)數(shù)測量范圍為（10～100 000）/28.3 L，計(jì)數(shù)最大允許誤差為±20%FS，經(jīng)計(jì)量確認(rèn)符合要求，朗豪貿(mào)易（上海）有限公司。

氣溶膠光度計(jì)（化學(xué)介質(zhì)）：2i型，編號為27575，測量范圍為0.000 1～120 μg/L，示值最大允許誤差為±10%，經(jīng)計(jì)量確認(rèn)符合要求，美國ATI公司。

生物安全柜質(zhì)量檢測儀（適用于碘化鉀法）：ZR-1013型，編 號 為101320110150，流 量 為100 L/min，分辨力為0.1 L/min，流量最大允許誤差為±2.0%，轉(zhuǎn)速最大允許誤差為±500 r/min，經(jīng)計(jì)量確認(rèn)符合要求，青島眾瑞智能儀器股份有限公司。

1.2 檢測環(huán)境條件

溫度：20～30 ℃；相對濕度：30%～65%。

1.3 測量標(biāo)準(zhǔn)裝置的工作原理、方法及依據(jù)文件

依據(jù)JJF 1815—2020 《Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)規(guī)范》對Ⅱ級生物安全柜各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)或測試。

1.3.1 下降氣流流速

在工作區(qū)上方高于前窗操作口上沿100 mm的水平面上確定測量點(diǎn)位置，多點(diǎn)測量穿過該平面的下降氣流流速。測量區(qū)域邊界與安全柜的內(nèi)壁及前操作口的距離為150 mm：測量點(diǎn)有3排，每排7個(gè)測量點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)測量3次，測量點(diǎn)等距離分布，形成的正方形柵格不大于150 mm×150 mm。測試區(qū)域邊界與安全柜的內(nèi)壁及前操作口的距離不小于150 mm。用夾具將風(fēng)速儀探針準(zhǔn)確定位在各測量點(diǎn)進(jìn)行測量。記錄所有測量點(diǎn)測量值，計(jì)算平均下降氣流流速。

1.3.2 流入氣流流速

安全柜前窗開啟至標(biāo)稱高度；用風(fēng)速儀在前操作口平面的兩排點(diǎn)測量氣流流速，第一排在前窗操作口上沿下約開啟高度25%的位置，第二排在前窗操作口上沿下約開啟高度75%的位置；測量點(diǎn)間隔約100 mm，距前操作口的側(cè)邊接近但不小于100 mm測試，每排7個(gè)測量點(diǎn)，每個(gè)測量點(diǎn)重復(fù)3次，記錄每個(gè)點(diǎn)流速，計(jì)算平均值，用所有測量平均值表示流入氣流流速。

1.3.3 照度

在安全柜工作臺面上，沿臺面內(nèi)側(cè)壁中心連線設(shè)置照度測量點(diǎn)，測量點(diǎn)距離不超過300 mm，與側(cè)壁最小距離為150 mm，關(guān)掉安全柜照明燈，使用照度計(jì)從一側(cè)起一次在各測量點(diǎn)測量背景照度，每個(gè)測量點(diǎn)重復(fù)測量3次；打開安全柜的照明燈，啟動風(fēng)機(jī)，依次在各測量點(diǎn)測量照度，每個(gè)測量點(diǎn)重復(fù)測量3次。計(jì)算背景照度和工作時(shí)照度平均值。

1.3.4 噪聲

將聲級計(jì)設(shè)置為“A”計(jì)權(quán)模式；打開安全柜照明及風(fēng)機(jī)，在正常工作狀態(tài)下，在安全柜前面中心水平向外300 mm，且距工作臺臺面380 mm處測量噪聲，重復(fù)測量3次。關(guān)閉安全柜風(fēng)機(jī)照明及風(fēng)機(jī)，如有室外排風(fēng)機(jī)，讓其繼續(xù)運(yùn)行，在相同位置測量背景噪聲，重復(fù)測量3次。計(jì)算背景噪聲平均值。當(dāng)背景噪聲平均值不大于60 dB時(shí)，實(shí)際噪聲為實(shí)測平均值。當(dāng)背景噪聲平均值大于60 dB時(shí)，實(shí)測值參照儀器操作手冊提供的曲線或表進(jìn)行修正，如不滿足，應(yīng)由校準(zhǔn)曲線或下表進(jìn)行修正，噪聲為實(shí)測平均值減去修正值。噪聲測量值修正如表2所示。

表2 噪聲測量值修正表

1.3.5 潔凈度

安全柜開機(jī)10 min ；潔凈度的采樣邊界距離內(nèi)表面或前窗100 mm，塵埃粒子計(jì)數(shù)器的采樣口置于前工作臺面向上200 mm的位置。采樣點(diǎn)位于工作臺面四角及中心，每個(gè)采樣點(diǎn)重復(fù)采樣3次，最小采樣量為8.5 L/次。計(jì)算每個(gè)采樣點(diǎn)粒子濃度平均值和總平均值的95%的置信上限（UCL），計(jì)算結(jié)果為潔凈度測試結(jié)果。

1.3.6 高效過濾完整性

運(yùn)行生物安全柜，使用氣溶膠發(fā)生器在高效過濾器上游產(chǎn)生符合濃度的氣溶膠（DOP等）氣體，使用氣溶膠光度計(jì)掃描高效過濾器下游，計(jì)算漏過率。

1.3.7 氣流模式

煙霧分別沿工作區(qū)中心線、觀察屏后、前窗操作口周邊以及安全柜前玻璃窗內(nèi)部兩側(cè)壁之間經(jīng)過，記錄煙霧流動。

1.3.8 人員保護(hù)（碘化鉀法）

使用生物安全柜質(zhì)量檢測儀在安全柜工作區(qū)擺放氣溶膠發(fā)生器與干擾圓筒，在安全柜外部擺放空氣采樣器，啟動安全柜并運(yùn)行至正常狀態(tài)，空氣采樣器吸氣，氣溶膠發(fā)生器使20 mL的碘化鉀氣溶膠化，氣溶膠化結(jié)束15 s后空氣采樣器停止吸氣，將采樣器過濾膜放入氯化鈀溶液，對過濾膜上的棕色斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算保護(hù)性能。重復(fù)試驗(yàn)3次，每次試驗(yàn)結(jié)果都應(yīng)符合要求。

1.3.9 產(chǎn)品保護(hù)（碘化鉀法）

使用生物安全柜質(zhì)量檢測儀在安全柜工作區(qū)擺放空氣采樣器與干擾圓筒，在安全柜外部擺放氣溶膠發(fā)生器，啟動安全柜并運(yùn)行至正常狀態(tài)，空氣采樣器吸氣，氣溶膠發(fā)生器使20 mL的碘化鉀氣溶膠化，氣溶膠化結(jié)束15 s后空氣采樣器停止吸氣，將采樣器過濾膜放入氯化鈀溶液，對過濾膜上的棕色斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算保護(hù)性能。重復(fù)試驗(yàn)3次，每次試驗(yàn)結(jié)果都應(yīng)符合要求。

1.3.10 交叉污染保護(hù)（碘化鉀法）

使用生物安全柜質(zhì)量檢測儀，在工作區(qū)規(guī)定位置擺放氣溶膠發(fā)生器與采樣器，按產(chǎn)品保護(hù)測試方法重復(fù)試驗(yàn)3次，每次試驗(yàn)結(jié)果都應(yīng)符合要求。

2 標(biāo)準(zhǔn)裝置的重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)及不確定度評定

2.1 測量標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)性測試

對生物安全柜質(zhì)量檢測儀、風(fēng)速儀、照度計(jì)、聲級計(jì)、塵埃粒子計(jì)數(shù)器、氣溶膠光度計(jì)的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行6次重復(fù)性測量，均用公式（1）計(jì)算測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差SR來表征其重復(fù)性。測試結(jié)果列于表3。

表3 重復(fù)性測試結(jié)果

式中：xi——每個(gè)測量點(diǎn)實(shí)際測量值；

n——測量次數(shù)(n=6)。

由表3可知，各關(guān)鍵指標(biāo)均符合計(jì)量要求。

2.2 測量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性考核

2.2.1 生物安全柜質(zhì)量檢測儀的穩(wěn)定性考核結(jié)果

每隔一個(gè)半月左右，分別對生物安全柜質(zhì)量檢測儀、照度計(jì)、風(fēng)速儀、聲級計(jì)、塵埃粒子計(jì)數(shù)器、氣溶膠光度計(jì)進(jìn)行6次重復(fù)性測量，取其算術(shù)平均值作為每組的測量結(jié)果，共測量4組，按照公式(2)計(jì)算極差sm，表征其穩(wěn)定性，測量值及計(jì)算結(jié)果分別列于表4、表5、表6。

表5 照度計(jì)穩(wěn)定性測試結(jié)果

表6 風(fēng)速儀、聲級計(jì)、塵埃粒子計(jì)數(shù)器、氣溶膠光度計(jì)穩(wěn)定性測定結(jié)果

式中：xmax——測定結(jié)果中的最大值；xmin——測定結(jié)果中的最小值；dm——極差差數(shù)，dm=2.06。

由表4、表5、表6可知，生物安全柜質(zhì)量檢測儀流量、照度、風(fēng)速、噪聲穩(wěn)定性sm均小于最大允許誤差，塵埃粒子計(jì)數(shù)器、氣溶膠光度計(jì)的粒子濃度示值誤差均小于各自的最大允許誤差，以上各指標(biāo)的穩(wěn)定性均符合要求。

2.3 測量標(biāo)準(zhǔn)的不確定度評定

2.3.1 不確定度來源及計(jì)算方法

不確定度來源包括：

（1）測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA。在實(shí)際測量中，每個(gè)點(diǎn)測量3次，取3次的平均值作為最佳估計(jì)值，按照均勻分布計(jì)算，取包含因子k=，因此重復(fù)性引入的不確定度分量uA=SR/k，其中各指標(biāo)的SR由表2可知。

（2）分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1。由1.1可知各儀器分辨力并計(jì)算分散區(qū)間半寬a，按均勻分布計(jì)算，取包含因子k=，則u1=a/k。

（3）最大允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2。由1.1可知各標(biāo)準(zhǔn)儀器的最大允差b，按均勻分布計(jì)算，取包含因子k=，則u2=b/k。

2.3.1 安全防護(hù)測量標(biāo)準(zhǔn)（生物安全柜質(zhì)量檢測儀）不確定度評定

按照2.3.1分別計(jì)算不同的采樣器在流量為100 L/min時(shí)的不確定度分量，計(jì)算結(jié)果列于表7。

表7 生物安全柜質(zhì)量檢測儀測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定 L/min

2.3.2 氣流流速測量標(biāo)準(zhǔn)（風(fēng)速儀）不確定度評定

按照2.3.1分別計(jì)算風(fēng)速儀在測量點(diǎn)為0.5、1.0 m/s時(shí)的不確定度分量，計(jì)算結(jié)果列于表8。

表8 風(fēng)速儀測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定 m/s

2.3.3 照度測量標(biāo)準(zhǔn)（照度計(jì)）不確定度評定

按照2.3.1分別計(jì)算不同照度測量點(diǎn)的不確定度分量，計(jì)算結(jié)果列于表9。

表9 照度儀測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定 lx

2.3.4 噪聲測量標(biāo)準(zhǔn)（聲級計(jì)）不確定度評定

按照2.3.1分別計(jì)算聲級計(jì)在測量點(diǎn)為94、114 dB測量點(diǎn)的不確定度分量，計(jì)算結(jié)果列于表10。

表10 噪聲測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定 dB

2.3.5 潔凈度測量標(biāo)準(zhǔn)（塵埃粒子計(jì)數(shù)器）不確定度評定

表11 塵埃粒子計(jì)數(shù)器測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定 L1)

2.3.6 高效過濾器檢漏測量標(biāo)準(zhǔn)（氣溶膠光度計(jì)）不確定度評定

按照2.3.1計(jì)算各不確定度分量，其中，在計(jì)算氣溶膠光度計(jì)濃度示值重復(fù)性引入的不確定度分量uA時(shí)，按照2.1方法分別計(jì)算測量點(diǎn)為8～12 μg/L時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)偏差來表征其重復(fù)性，按照均勻分布計(jì)算，取包含因子k=，則重復(fù)性引入的不確定度分量uA=0.011 μg/L。各計(jì)算結(jié)果列于表12。

表12 氣溶膠光度計(jì)測量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定 μg/L

3 測量標(biāo)準(zhǔn)性能的驗(yàn)證

測量標(biāo)準(zhǔn)性能用最大允差表示，采用檢定（校準(zhǔn)）法進(jìn)行驗(yàn)證。各標(biāo)準(zhǔn)器均送高一級測量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)，檢定或校準(zhǔn)結(jié)果均符合測量標(biāo)準(zhǔn)性能要求，具體結(jié)果如表13所示。

表13 各標(biāo)準(zhǔn)器校準(zhǔn)結(jié)果

4 測量結(jié)果的測量不確定度評定

Ⅱ級生物安全柜測量過程中涉及的參數(shù)主要有下降氣流流速、流入氣流流速、潔凈度、照度和噪聲等，這5個(gè)參數(shù)均使用標(biāo)準(zhǔn)器進(jìn)行直接測量，且測量結(jié)果受溫度、濕度、氣壓等環(huán)境因素的影響，可以忽略。因此，筆者主要分析在測量過程中對測量結(jié)果影響較大的不確定度分量來源，對其進(jìn)行不確定評定。

4.1 計(jì)算模型

式中：i——第i個(gè)測量點(diǎn)；

j——某測量點(diǎn)的測量次序；

n——測量點(diǎn)的數(shù)量；

Xij——每個(gè)測量點(diǎn)測量值。

合并樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差sR計(jì)算方法：

Xij——第i個(gè)測量點(diǎn)第j次的測量值；

m——測量點(diǎn)的數(shù)量；

n——每個(gè)測量點(diǎn)包含的測量次數(shù)。

不確定度來源及計(jì)算方法同2.3.1。

4.2 下降氣流流速不確定度評定

按照1.3.1方法測量風(fēng)速，結(jié)果列于表14。

表14 風(fēng)速測量值 m/s

按照公式(2)、(3)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中m=21，n=3，計(jì)算得到單次測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差sR=0.005 m/s，代入2.3.1（1）方法，計(jì)算得到重復(fù)性引入的不確定度分量uA=0.003 m/s；分辨力引入的不確定度分量u1=0.002 9 m/s；最大允差引入的不確定度u2=0.008 7 m/s。

4.3 流入氣流流速不確定度評定

按照1.3.2方法測量風(fēng)速，結(jié)果列于表15。

表15 風(fēng)速測量值 m/s

按照公式(2)、(3)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中m=14，n=3，計(jì)算得到單次測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差sR=0.005 m/s，代入2.3.1（1）方法，計(jì)算得到重復(fù)性引入的不確定度分量uA=0.006 m/s；分辨力引入的不確定度分量u1=0.002 9 m/s；最大允差引入的不確定度u2=0.011 5 m/s。

4.4 照度測量結(jié)果不確定度評定

按照1.3.3方法計(jì)算照度，結(jié)果列于表16。

表16 照度測量結(jié)果 lx

按照公式(2)、(3)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中m=6，n=10，計(jì)算得到單次測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差sR=2 lx，代入2.3.1（1）方法，計(jì)算得到重復(fù)性引入的不確定度分量uA=1.15 lx；分辨力引入的不確定度分量u1=0.29 lx；最大允差引入的不確定度u2=49 lx。

4.5 噪聲測量結(jié)果不確定度評定

按照1.3.4方法測量噪聲，按照公式(4)、(5)計(jì)算總噪聲，結(jié)果列于表17。式中：N——實(shí)際噪聲測量值，dB；

表17 噪聲測定結(jié)果 dB

Ni——總噪聲單次測量值，dB；

Ni'——背景噪聲單次測量值，dB。

按照公式(1)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中xi替換成Ni，替換成，n=10，計(jì)算得到單次測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=0.5 dB，代入2.3.1（1）方法，計(jì)算得到重復(fù)性引入的不確定度分量uA=0.29 dB；分辨力引入的不確定度分量u1=0.029 m/s；最大允差引入的不確定度u2=0.6 dB。

4.6 潔凈度測量結(jié)果的不確定度評定

按照1.3.5方法測量噪聲，按照公式(6)、(7)、(8)、(9)計(jì)算潔凈度，結(jié)果列于表18。

表18 潔凈度測量結(jié)果 m-3

Mij——每個(gè)采樣點(diǎn)單次采樣粒子濃度，m-3；

n——采樣點(diǎn)的數(shù)量；

s——采樣點(diǎn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，m-3；

95%UCL——總平均值得95%置信上限，m-3；

t0.95——計(jì)算95%置信上限所用的t分布值。

按照2.3.1（1）方法，計(jì)算得到重復(fù)性引入的不確定度分量uA=0；分辨力引入的不確定度分量u1=0.29 m-3；最大允差引入的不確定度u2=0.12 m-3。

5 結(jié)語

依據(jù)JJF 1815—2020 《Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)規(guī)范》，對風(fēng)速儀、照度計(jì)、聲級計(jì)、塵埃粒子計(jì)數(shù)器、氣溶膠光度計(jì)、氣溶膠發(fā)生器、生物安全柜質(zhì)量檢測儀標(biāo)準(zhǔn)裝置進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性考核和性能驗(yàn)證，并對測量標(biāo)準(zhǔn)和校準(zhǔn)項(xiàng)目的相關(guān)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行不確定度評定及驗(yàn)證，各標(biāo)準(zhǔn)器、校準(zhǔn)裝置及配套設(shè)備，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合計(jì)量要求。另，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件合格，校準(zhǔn)人員具有相應(yīng)資質(zhì)和能力，符合開展Ⅱ級生物安全柜校準(zhǔn)的要求。