膠質(zhì)瘤大鼠膠質(zhì)瘤組織中果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物2的表達(dá)及意義

張玉松，孫玉學(xué)，韓亞迪

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450008)

果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是表觀遺傳調(diào)控因子，屬于多梳抑制蛋白復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)家族成員，在細(xì)胞的分化和生長過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，其持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖與惡性轉(zhuǎn)化,被視為癌基因[1-3]。研究顯示，EZH2可調(diào)控信號通路相關(guān)基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，逐漸成為腫瘤靶向治療的新型標(biāo)志物[1,4]。有研究表明，EZH2參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生，靶向EZH2可以抑制膠質(zhì)瘤發(fā)展進(jìn)程[5]。本研究構(gòu)建了大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤組織中EZH2的表達(dá)，旨在為臨床治療膠質(zhì)瘤提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague Dawley大鼠48只，體質(zhì)量200～230 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠在無特定病原體級動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)和制備動(dòng)物荷瘤模型。動(dòng)物房室內(nèi)恒溫24 ℃，相對濕度60%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，大鼠可以自由攝食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所(由鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存)，EZH2一抗購自美國Abcam公司(編號：ab191080)，內(nèi)參基因β-actin單克隆抗體購自美國Abmart公司(編號：M20009)。體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清購自美國Gibco公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司，EZH2引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR基因擴(kuò)增儀購自美國Thermo Fisher科技公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換1次液，每天觀察并記錄細(xì)胞生長情況。

1.3.2 大鼠膠質(zhì)瘤模型的構(gòu)建將48只大鼠隨機(jī)分為對照組(n=24)和模型組(n=24)。模型組大鼠參考文獻(xiàn)[6]的方法構(gòu)建膠質(zhì)瘤模型，具體方法如下：將對數(shù)生長期C6細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，濃度1×109L-1。用100 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠，然后固定于立體定向儀上，在內(nèi)眥連線與頭部矢狀線正中交匯處向后平行于正中矢狀線向后做一1 cm 長切口，分離皮膚顯露前囟門，以前囟門為標(biāo)志向右旁開3 mm，冠狀縫前0.5 mm定位，磨鉆鉆1個(gè)直徑1 mm 骨孔。用微量注射器抽吸10 μL C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液(1×109L-1)，硬膜下進(jìn)針5 mm、退1 mm，緩慢注射入模型組大鼠顱內(nèi)(2 μL·min-1)，注射完畢后留置注射器5 min，緩慢拔出微量注射器，骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚。對照組大鼠注射等量的磷酸鹽緩沖液。術(shù)后每天測腫瘤體積，造模后14 d處死大鼠取腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。腫瘤體積隨著時(shí)間逐漸增加，14 d時(shí)腫瘤直徑達(dá)3～5 mm，腫瘤呈圓形或橢圓形，占位顯著，瘤周水腫；HE染色可見到腫瘤細(xì)胞浸潤性生長為造模成功。結(jié)合腫瘤體積和HE染色結(jié)果共22只大鼠造模成功。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測對照組大鼠腦組織及模型組大鼠腫瘤組織中EZH2蛋白表達(dá)造模成功后用水合氯醛麻醉大鼠并處死，冰上收集對照組大鼠腦組織標(biāo)本和模型組大鼠腫瘤組織標(biāo)本，加入1 mL含有1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟的RIPA(強(qiáng))裂解液，冰上裂解10 min。用玻璃勻漿器研碎組織，4 ℃、5 000 ×g離心10 min，去除碎片，轉(zhuǎn)至新的1.5 mL離心管中。超聲處理30 s。保留20 μL蛋白樣品進(jìn)行BCA定量操作。制備含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，加入稀釋后12 000目的單克隆抗體EZH2以及110 000內(nèi)參基因β-actin單克隆抗體4 ℃過夜孵育，接著加入稀釋的二抗孵育2 h，醫(yī)用X光膠片曝光，自動(dòng)洗片機(jī)顯影、定影和烘干。用 Image J軟件分析目的條帶和內(nèi)參基因條帶的灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測對照組大鼠腦組織及模型組大鼠腫瘤組織中EZH2 mRNA表達(dá)水平取0.1 g對照組大鼠腦組織和模型組大鼠腫瘤組織標(biāo)本RNA后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，全程加樣操作在冰上進(jìn)行，加樣后混勻離心。PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 25 s,40個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育10 min終止反應(yīng)。EZH2正義鏈引物序列為5′-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3′，反義鏈引物序列為5′-TCACTGGTCACTGAACACTCC-3′；以β-actin作為內(nèi)參基因，正義鏈引物序列為5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，反義鏈引物序列為5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線鑒定為單一產(chǎn)物，采用2-ΔΔCt法計(jì)算EZH2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.5 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)法檢測對照組大鼠腦組織及模型組大鼠腫瘤組織中EZH2蛋白表達(dá)采用IHC鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法進(jìn)行檢測。將對照組大鼠腦組織及模型組大鼠腫瘤組織置于體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定24～48 h；石蠟包埋，切片(厚4 μm)。冰箱內(nèi)過夜孵育稀釋(11 000)后的EZH2抗體，將玻片從冰箱內(nèi)取出，磷酸鹽緩沖液洗后擦干組織周圍的液體，之后滴加二抗淹沒組織，室溫條件下避光孵育60 min。使用IHC試劑盒進(jìn)行染色。EZH2定位于細(xì)胞核，陽性染色呈淡黃色至棕色。應(yīng)用 Image J 圖像分析軟件進(jìn)行EZH2蛋白半定量分析，結(jié)果用光密度值表示。

2 結(jié)果

模型組大鼠膠質(zhì)瘤組織中EZH2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組大鼠腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1和圖1、圖2。

表1 對照組大鼠腦組織和模型組腫瘤組織中EZH2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

圖1 對照組大鼠腦組織和模型組腫瘤組織中EZH2蛋白表達(dá)(Western blot)

A：對照組；B：模型組。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤源于神經(jīng)外胚層，故稱為神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮性腫瘤，是顱內(nèi)常見的腫瘤，可引起神經(jīng)系統(tǒng)的不可逆性損傷，甚至發(fā)生腦疝，嚴(yán)重影響患者的身心健康。EZH2是PRC2的主要組成蛋白，其可以催化下游組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(trimethylated histone H3 at lysine 27,H3K27me3)，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7-8]。研究顯示，EZH2與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)[9-12]。因此，EZH2逐漸成為預(yù)防和治療腫瘤的新靶標(biāo)。

研究表明，在結(jié)腸癌發(fā)生中，抑制EZH2能夠增強(qiáng)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制劑效果并顯著降低癌細(xì)胞數(shù)量，表明抑制EZH2是增強(qiáng)EGFR抑制劑拮抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的有效方法[4]。此外，EZH2還可以靶向整合素a2基因調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，EZH2可以調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的自我更新和分化之間的平衡[13]。在腫瘤微環(huán)境中，EZH2可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤向M1型轉(zhuǎn)化[9]。EZH2低表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制c-myc和蛋白激酶B信號通路有關(guān)[14]。此外，通過美國癌癥基因圖譜數(shù)據(jù)庫分析膠質(zhì)瘤臨床樣本EZH2的表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中EZH2的表達(dá)隨腫瘤病理分級的升高而增加。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中EZH2的表達(dá)量顯著高于對照組，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[15-16]；有研究發(fā)現(xiàn)，α地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X連鎖基因/EZH2復(fù)合物通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)控Fas相關(guān)死亡蛋白/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤化學(xué)治療抵抗效應(yīng)，有助于膠質(zhì)瘤的治療[17]。但EZH2是否催化下游H3K27me3進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)變化，從而影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，尚需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究初步探討EZH2在膠質(zhì)瘤大鼠模型中的表達(dá)及意義，發(fā)現(xiàn)EZH2在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平顯著升高，預(yù)示其有可能是評估膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的新型分子標(biāo)志物。