細胞自噬在免疫性血小板減少癥中的作用機制研究進展

羅雅琴，黃 偉

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014；3.齊魯工業(yè)大學/山東省科學院山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

細胞自噬是一種自我消化現(xiàn)象，廣泛參與細胞生命活動，與細胞生存或死亡密不可分。自噬不僅是細胞重要的內(nèi)在保護機制，而且也參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩病等多種自身免疫性疾病[1]。免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種機體自身免疫異常引起的血小板破壞過多的出血性疾病，以外周血小板減少、骨髓巨核細胞正?；蛟龆酁橹饕R床表現(xiàn)，嚴重者可出現(xiàn)顱內(nèi)以及消化道出血等，影響患者生命[2]。目前，導致ITP發(fā)生的主要機制尚未完全闡明，除抗體介導的血小板破壞以外，多種細胞免疫機制的異常也參與了ITP的發(fā)生過程。研究表明，T、B淋巴細胞免疫失衡及巨核細胞功能障礙是ITP發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[3-4]。近年來，越來越多的研究顯示，自噬在ITP疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本文就細胞自噬在ITP中的作用及機制進行綜述，以期為探索ITP的新型自噬靶向治療藥物提供參考。

1 細胞自噬概述

細胞自噬又稱為“自我吞噬”，是細胞內(nèi)細胞器與生物大分子被降解和回收利用的過程。細胞自噬主要分為3類：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。細胞自噬的過程分為起始、延伸、成熟和結(jié)束4個階段[5]。起始：細胞受到自噬刺激后，細胞內(nèi)會形成雙層膜結(jié)構；延伸：雙層膜的結(jié)構不斷延伸并將底物包裹起來形成自噬體；成熟：在自噬的成熟階段，閉合的雙層膜結(jié)構與溶酶體融合；結(jié)束：自噬小體在溶酶體內(nèi)多種酶的作用下被降解掉。細胞自噬廣泛參與細胞多種重要生命活動，包括細胞凋亡、細胞更新、細胞死亡等，是細胞的一種重要內(nèi)在保護機制；同時，細胞自噬也參與機體多種疾病的發(fā)病過程，自噬不足或過度都會導致機體發(fā)生病變。

2 細胞自噬調(diào)控機制

在細胞內(nèi)，自噬被嚴格調(diào)節(jié)以維持細胞穩(wěn)態(tài)。研究表明，細胞自噬通過響應細胞外或細胞內(nèi)的應激和信號如饑餓、生長因子剝奪、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應激、未折疊蛋白積聚和病原體感染等上調(diào)自噬體的表達。自噬體可由不同來源的膜形成，包括ER、高爾基體、線粒體和質(zhì)膜[6]。自噬體的形成需要自噬相關蛋白(autophagy-related protein，Atg)的參與，目前已鑒定出至少35個Atg基因，大多數(shù)Atg基因有助于自噬體的形成，從酵母菌到人類進化過程Atg基因保持高度保守。酵母菌的Atg僅有一種形式，而哺乳動物所含Atg均有多種亞基，如Atg1、Atg4、Atg5、Atg8和Atg18，每個Atg在自噬過程中發(fā)揮特定功能[7]。目前研究證實，至少4種復合物涉及調(diào)控細胞自噬[8]，包括Atg1/Unc-51樣自噬激活激酶1復合物、Atg6/Beclin1/Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶復合物、跨膜Atg 9/空泡膜蛋白1復合物和泛素樣蛋白復合物[如Atg12和Atg8/微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)]，其中LC3分子由LC3Ⅰ 轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ參與自噬體膜的形成，LC3Ⅱ常被作為評價細胞內(nèi)自噬發(fā)生及自噬活性的主要標志物之一[9]。細胞自噬調(diào)控信號通路主要分為2大類：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依賴途徑和mTOR非依賴途徑，目前研究主要集中在mTOR依賴途徑。mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)家族的重要成員，是細胞代謝的關鍵參與者之一，在維持營養(yǎng)有效性、能量以及機體代謝平衡中發(fā)揮重要作用[10]。mTOR作為自噬調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，主要包括mTOR復合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTORC2等2種形式。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在細胞內(nèi)受多條信號通路的調(diào)控，包括PI3K/蛋白激酶B (protein kinase B,PKB/AKT)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-actived proteinkinase,p38 MAPK)、腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/結(jié)節(jié)性硬化癥復合體(tuberous sclerosiscomplex,TSC)等[11]。mTOR非依賴途徑主要受Class III-PI3K、RAS-MAPK、Ca-AMPK、p53、磷酸酶及張力蛋白同源物、ER應激等信號通路的調(diào)控[12]。目前，小分子自噬抑制劑如氯喹、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1、毒胡蘿卜素、(±)BayK8644等已廣泛用于臨床和實驗研究中，為研究細胞自噬與疾病的相關性提供了新的思路和工具。

3 ITP

ITP是臨床上一種常見的出血性疾病，以外周血血小板減少為特點，嚴重者可危及生命。ITP患者因出血風險增大、疾病轉(zhuǎn)歸的不可預測性、對疾病的恐懼感、需長時間治療、社會活動減少、影響工作等各種因素導致其生活質(zhì)量嚴重降低，甚至其生活質(zhì)量低于癌癥患者[13]。ITP的發(fā)病機制主要為血小板破壞增多、血小板生成減少及T淋巴細胞免疫失衡。ITP的一線治療方法主要包括：糖皮質(zhì)激素、靜脈注射用免疫球蛋白和抗-D免疫球蛋白；二線治療方法包括：脾臟切除術、利妥昔單抗、促血小板生成素受體激動劑、環(huán)孢素、免疫抑制劑等。臨床中有部分患者因治療效果不佳，發(fā)展成為難治性ITP[14]。ITP患者體內(nèi)血小板破壞增多，主要是因為血小板自身抗體介導的免疫失耐受，產(chǎn)生針對血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)的自身抗體，包括抗血小板GPIb/Ⅸ和GPIIb/Ⅲ a抗體等，該抗體可與血小板表面的GP抗原表位結(jié)合，介導血小板被脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的單核巨噬細胞過度清除[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ITP中細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs) 可通過穿孔素、顆粒酶B直接裂解血小板，造成血小板破壞增多；且CTLs可引起骨髓巨核細胞成熟和凋亡障礙，導致機體血小板生成減少[16]。但ITP的發(fā)病機制復雜，至今尚未完全闡明。

4 細胞自噬與ITP

細胞自噬不僅是一個重要的細胞內(nèi)在保護機制，而且對于微生物細胞反應、主要組織相容性復合體抗原呈遞以及淋巴細胞的分化、生存和增殖也起非常重要的作用。細胞自噬參與細胞的發(fā)育、分化、衰老和免疫。在生理條件下，自噬不僅調(diào)節(jié)免疫細胞存活和內(nèi)源性細胞因子依賴性炎癥等核心細胞過程，且在控制細胞內(nèi)病原體中也起主要作用[17]。許多免疫過程包括病原體識別和破壞、抗原呈遞、淋巴細胞發(fā)育和功能、體液免疫和炎癥調(diào)節(jié)等高度依賴自噬[18-19]。有證據(jù)表明，自噬參與T、B淋巴細胞的激活和增殖以及決定B細胞存活的機制[20]。在病理情況下，自噬因不能對細胞外和細胞內(nèi)的應激有足夠的反應而出現(xiàn)異常[21]。研究表明，T、B淋巴細胞免疫失衡及巨核細胞功能障礙是ITP發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[3-4]。因此，細胞自噬通過對T、B淋巴細胞和巨核細胞功能的調(diào)節(jié)作用對ITP的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

4.1 自噬調(diào)控T淋巴細胞在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用T淋巴細胞是ITP發(fā)病的關鍵成員，了解T細胞的功能缺陷對于闡明ITP的發(fā)病機制至關重要[22]。ITP是一種自身免疫性出血性疾病，通過T細胞和B細胞識別血小板抗原啟動ITP的發(fā)生。健康人具有血小板特異性自身反應T細胞，可對外周刺激產(chǎn)生免疫耐受，而ITP患者存在活化的血小板自身反應性T細胞可增加促炎因子水平[23-24]。這表明ITP可能是由于血小板特異性自身反應性T細胞失去對外周的免疫耐受所導致。T淋巴細胞的發(fā)育、生存和增殖尤其依賴于自噬[25-26]。研究表明，細胞自噬可調(diào)控T細胞的存活、活化、病原體清除和記憶等生物功能，通過促進T細胞增殖和抑制死亡而有利于其存活[27]。王琦等[28]研究顯示，與健康兒童相比，初診自身抗體陽性的ITP患兒Treg數(shù)量顯著降低，并伴隨增殖相關蛋白AKT、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化水平及細胞自噬蛋白Atg5和Atg7水平降低。JIA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Atg7缺失的T細胞導致細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B累積增加，從而抑制T細胞自身增殖。而自噬基因缺失的T細胞由于線粒體活性氧的堆積增加、促凋亡蛋白增加而促進T細胞凋亡[30]。細胞自噬缺陷不僅影響T細胞存活，而且影響其正常活化。研究發(fā)現(xiàn)，從老年小鼠獲得的T細胞以及從健康志愿者獲得的循環(huán)CD8+、CD57+衰老細胞均顯示自噬功能減弱，這與DNA損傷增加有關[31]。因此，由于衰老導致的自噬缺陷可能導致T細胞的免疫低下。自噬還可通過介導T細胞受體(T cell receptor，TCR)下游信號通路的負向調(diào)控分子非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1的降解促進T細胞活化[32]。在活化的T細胞中，CD8+T細胞更容易受到細胞自噬的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Atg5-/-的CD8+T細胞更容易獲得效應記憶表型，并產(chǎn)生更多的干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，這種表型變化伴隨著葡萄糖代謝的增強，導致組蛋白甲基化的改變，以及糖酵解和免疫反應基因的上調(diào)[33]；自噬蛋白Atg7和NIP3樣蛋白(Nip3-like protein X，NIX)介導的線粒體自噬對缺氧誘導因子-1a蛋白及脂肪酸代謝的調(diào)控與CD8+T細胞對特異性抗原的記憶有關[34]。研究表明，輔助型T細胞1(T helper 1 cell，Th1)可通過誘導自噬增強對入侵病菌的清除或促進細胞死亡[35]。巨噬細胞參與許多重要的免疫功能，IFN-γ加強了巨噬細胞在細胞先天性免疫中的作用。CHANG等[36]報道，IFN-γ可以增強刀豆球蛋白A誘導的肝癌細胞株發(fā)生自噬潮和細胞死亡。因此，推測T淋巴細胞自噬可能在ITP發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但具體機制仍需進一步深入研究。

4.2 自噬調(diào)控B淋巴細胞在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用自噬對B淋巴細胞的生存起著復雜的作用，以確保免疫系統(tǒng)的正常。研究表明，B細胞經(jīng)活化后高度增殖，引起細胞代謝過程加快，從而提供細胞增殖所需能量和物質(zhì)等，而細胞自噬參與該過程并發(fā)揮重要作用[27]。自噬促進體內(nèi)B淋巴細胞亞群的生存，包括發(fā)育中的前B細胞和B1細胞[37]。WATANABE 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，自噬特別容易被凋亡的B細胞受體信號誘導;采用Cre-Lox P技術刪除B淋巴細胞的Atg5，或重新輻照Atg5-/-小鼠胚胎肝臟祖細胞，可導致腹膜B-1B細胞顯著減少。在B細胞發(fā)育中，Atg5-/-的祖細胞在將原B細胞轉(zhuǎn)為前B細胞時表現(xiàn)出顯著的缺陷，而骨髓B細胞的低效發(fā)育與增加的B細胞死亡有關，表明Atg5在發(fā)育過程中對B細胞的生存很重要。此外，B-1a B細胞需要外圍Atg5的維護?？梢?，Atg5在細胞發(fā)育的不同階段所起的作用不一樣，但與細胞系傳代數(shù)密切相關[39]。MARTINEZ-MARTIN等[40]研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染激活初級濾泡B細胞發(fā)育為生發(fā)中心B細胞過程中，在自噬基因WIPI2調(diào)控下，細胞mTORC1表達上調(diào)，LC3-Ⅱ水平升高，線粒體代謝加快，從而促進B細胞分化；脂多糖刺激下漿母細胞的分化和存活主要依賴于Atg5介導的細胞自噬[41]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，B細胞特異性缺失Atg7的小鼠在針對流感疫苗免疫后顯示正常的一抗反應，但在受到流感病毒攻擊時未能產(chǎn)生保護性的二抗反應，從而導致高病毒載量、廣泛肺部損傷和死亡率增加，表明細胞自噬在維持記憶B細胞對特定抗原的保護性抗體中發(fā)揮重要作用[42]。綜上所述，自噬可促進B淋巴細胞的生存和早期B細胞祖細胞的發(fā)育。B淋巴細胞通過抗體偶聯(lián)和抗體非依賴作用的結(jié)合在ITP的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用，自身反應性B細胞針對抗原產(chǎn)生的自身抗體，特別是針對抗GPIIb/IIIa和(或) GPIb/IX產(chǎn)生的免疫球蛋白G抗體，被認為在ITP的發(fā)病機制中起關鍵作用[43-45]。細胞自噬在調(diào)節(jié)B細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，Atg5和Atg7是主要的自噬調(diào)節(jié)蛋白，但該過程中是否涉及新的自噬途徑及關鍵分子有待深入研究。

4.3 自噬通過調(diào)控巨核細胞在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用ITP是一種常見的自身免疫介導的出血性疾病，其中血小板膜蛋白變成抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，導致血小板減少[46]。大約50%的ITP患者具有自身抗體，這些抗體不僅會破壞血小板，還會損害骨髓中巨核細胞的成熟和血小板生成[47]。研究發(fā)現(xiàn)，ITP小鼠未成熟巨核細胞/血小板和相應的祖細胞頻率更高，且吞噬作用增加，導致外周血血小板計數(shù)減少[48]。MCMILLAN等[47]研究發(fā)現(xiàn)，慢性ITP患者的巨核細胞存在缺陷，向正常巨核細胞添加抗血小板抗體會導致巨核細胞增殖受損和異常倍性分布。CAO等[49]通過Atg7基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，核心自噬機制對于正常的巨核細胞生成和血小板功能很重要；在ITP患者中，自噬的喪失阻止了巨核細胞的形成和分化，對血小板生成產(chǎn)生了負面影響，導致血小板體積變大、數(shù)量減少，最終嚴重阻礙了血小板的生成。為了評估血小板自噬的生理作用，OUSEPH等[50]通過對具有巨核細胞和血小板特異性刪除Atg7小鼠血小板的體外分析發(fā)現(xiàn)，血小板聚集和顆粒包裝存在缺陷，結(jié)果提示自噬與巨核細胞的成熟有關。細胞自噬對巨核細胞的作用主要表現(xiàn)在2個方面：(1)自噬受損影響造血干細胞向巨核細胞的分化。自噬在維持造血干細胞的干性和微環(huán)境中起重要作用，也是CD34+CD133+細胞自我更新和分化所必需的[51]。盡管自噬在細胞分化中的作用尚不清楚，但有證據(jù)表明其可以控制分化過程[52]。CAO等[49]研究發(fā)現(xiàn)，Atg5-/-小鼠模型表現(xiàn)出異常的巨核細胞分化和增殖以及血小板生成障礙，出現(xiàn)凝血功能降低，最終導致ITP。CD41和CD61是巨核細胞的2個標志物。研究發(fā)現(xiàn)，Atg7-骨髓細胞中CD41+CD61+細胞的百分比降低，并與凋亡增加和壞死有關；當自噬被bafilomycin A1抑制或雷帕霉素誘導時，觀察到高倍性巨核細胞顯著減少，CD41和CD61共表達細胞以及血小板形成減少；而當成熟巨核細胞的自噬發(fā)生改變時，前血小板的形成沒有顯著變化[53]。這一結(jié)果表明，在巨核細胞生成早期，自噬上調(diào)或抑制會影響巨核細胞和血小板生成，自噬是造血干細胞生存和分化為巨核細胞所必需的。(2)自噬異常影響巨核細胞向血小板的分化。造血、巨核細胞生成和分化以及血小板生成是連續(xù)的成熟過程，最后有組織地釋放到血管中，經(jīng)反復脫落產(chǎn)生循環(huán)的血小板[54]。成熟的巨核細胞可通過特定的細胞表面標記來鑒定，包括CD41、CD61、CD42和糖蛋白V。有研究通過Atg7-小鼠模型證明，自噬對正常的巨核細胞生成和血小板功能不可或缺，自噬通量的破壞可導致血小板聚集和黏附的損害[49-55]。另有研究報道，巨核細胞超微結(jié)構異常與骨髓巨核細胞凋亡相關，表明巨核細胞的損傷可能會降低血小板生成[56]。

5 結(jié)語與展望

細胞自噬廣泛存在于真核生物中，通過平衡細胞內(nèi)成分的合成和降解，調(diào)節(jié)細胞的穩(wěn)態(tài)，是一個重要的細胞內(nèi)在保護機制，對于維持細胞穩(wěn)態(tài)、存活、更新至關重要。隨著研究的不斷深入，有關細胞自噬發(fā)生、發(fā)展的認識也不斷加深，尤其是自噬調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn)，使臨床上可以更好地利用自噬治療疾病和規(guī)避風險。

細胞自噬調(diào)控與ITP發(fā)病機制之間存在一定相關性，包括對T、B淋巴細胞以及巨核細胞功能的調(diào)節(jié)作用。ITP患者的自身抗原如GPIIb/IIIa和GPIb/IX，可能通過自噬而導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解形成，從而有助于ITP患者自身免疫的啟動或持續(xù)。但考慮到細胞自噬復雜的生物學作用，自噬途徑成員表達改變和自噬功能受損在ITP中的作用仍需進一步研究。通過對異常自噬途徑的適當調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)機體免疫失衡，可減輕免疫介導的血小板破壞和(或)血小板生成的抑制。因此，有關自噬的未來研究可能會導致發(fā)現(xiàn)新的治療靶標，這些靶標可為研發(fā)ITP治療的個性化藥物提供新的機會。