缺氧誘導(dǎo)因子-1α通過調(diào)控蛋白激酶B/核因子-κB信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)

趙金金，崔非非，莫清江，汪 磊，林志強(qiáng)，張海光，焦路陽

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤[1]，作為實體瘤其內(nèi)部通常存在缺氧，而腫瘤組織缺氧時可表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子；缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是一種主要的缺氧誘導(dǎo)因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療中起到關(guān)鍵作用[2-5]。近期有研究報道，HIF-1α在多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)干細(xì)胞的產(chǎn)生[6-7]；本課題組先前研究證實，HIF-1α可促進(jìn)肝癌細(xì)胞干細(xì)胞增多，從而使肝癌細(xì)胞對化學(xué)治療藥物表阿霉素耐藥[8]。但是HIF-1α在肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)干細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制仍不清楚。

蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路活化在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，該信號通路與其他通路相互作用共同參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程[9]。NF-κB 家族成員能兩兩結(jié)合成同源性或異源性二聚體，最為常見的是 p50/p65 異源二聚體，其能迅速被多種刺激激活[10]。Akt為NF-κB的上游信號，其活化后誘導(dǎo)NF-κB活化，使p65蛋白磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期素(cycling D1)、原癌基因c-myc、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲[11]。目前，Akt/NF-κB信號通路在肝癌干細(xì)胞中是否發(fā)揮作用研究報道較少。基于此，本研究通過比較HIF-1α高表達(dá)與低表達(dá)肝癌細(xì)胞內(nèi)Akt及p65的磷酸化水平，探討Akt/NF-κB信號通路在HIF-1α誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞中發(fā)揮的作用，并用Akt和p65抑制劑進(jìn)行驗證，以期為基于HIF-1α的肝癌治療提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，HIF-1α高表達(dá)慢病毒pHBLV-HIF1A-3flag-ZsGreen-Puro和對照空載體慢病毒pHBLV-ZsGreen-Puro購自上海漢恒生物科技有限公司，嘌呤霉素、青霉素-鏈霉素雙抗、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Sigma公司，磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation protein kinase B，p-Akt)、p-p65抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Akt、p65、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。CD133-APC流式抗體購自美國Biolegend生物科技公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司，四甲基偶氮唑鹽(methylthia zolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)、Akt激酶抑制劑及NF-κB信號通路抑制劑芒果苷購自美國MCE公司，其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2恒溫培養(yǎng)箱及全波長掃描酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司，BIO-RAD Mini Trans-Blot垂直電泳系統(tǒng)購自美國伯樂公司，Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡購自德國卡爾蔡司集團(tuán)，BD Calibur流式細(xì)胞儀購自美國碧迪公司，Amersham Imager 6000化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)購自美國General Electric Company公司，Countstar智能細(xì)胞分析儀購自上海睿鈺生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素-鏈霉素雙抗、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合度時用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化并計數(shù)，按每孔1×106個細(xì)胞鋪于6孔板，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、對照組和實驗組。按照漢恒生物慢病毒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，首先從冰箱中取出慢病毒融化，吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，加入1 mL含4 mg·L-1聚凝胺的新鮮培養(yǎng)基；空白對照組不加病毒原液，對照組細(xì)胞中加入20 μL病毒滴度為2×1011TU·L-1的pHBLV-ZsGreen-Puro病毒原液，實驗組細(xì)胞中加入20 μL病毒滴度為2×1011TU·L-1的pHBLV-HIF-1α-3flag-ZsGreen-Puro病毒原液；輕輕混勻，第2天吸去含有病毒的培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。為得到穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α的細(xì)胞株HepG2-HIF-1α，在感染72 h后將細(xì)胞消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔1個細(xì)胞的量接種于96孔板，加入嘌呤霉素，每3 d換液1次，3周后消化細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)取空白對照組、對照組和實驗組生長至60%～80%融合度的細(xì)胞，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，并使用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)采集照片；計數(shù)綠色熒光下細(xì)胞數(shù)量和同一視野白光下細(xì)胞的數(shù)量，計算GFP陽性細(xì)胞比例，GFP陽性細(xì)胞比例=綠色熒光下細(xì)胞的數(shù)量/白光下細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.2.3 Western blot檢測HIF-1α蛋白相對表達(dá)量及Akt/NF-κB信號通路蛋白p-Akt/Akt、p-p65/p65蛋白表達(dá)取空白對照組、對照組和實驗組細(xì)胞貼壁生長過夜，第2天用冷的PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液冰上孵育20 min，12 000×g離心15 min，收集上清得到細(xì)胞裂解液。BCA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將3組細(xì)胞調(diào)至相同濃度；加入上樣緩沖液。每個樣品上樣量為30 μg，采用變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉2 h，加入HIF-1α、p-Akt、p-p65、Akt、p65一抗(滴度均為11 000)和GAPDH一抗(滴度為110 000)，4 ℃孵育過夜，Tris 緩沖生理鹽水( Tris-buffered saline and Tween-20，TBST)洗滌5次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔二抗(滴度為110 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min；用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，應(yīng)用Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析蛋白表達(dá)量，HIF-1α、p-Akt、Akt、p-p65、p65蛋白相對表達(dá)量以HIF-1α、p-Akt、Akt、p-p65、p65蛋白灰度值與GAPDH灰度值比值表示，計算p-Akt/Akt、p-p65/p65的比值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD133的表達(dá)取對照組和實驗組生長至90%融合度的細(xì)胞，PBS沖洗后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶溶液消化細(xì)胞，使用Countstar智能細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取1×106個細(xì)胞PBS洗滌后加入100 μL APC標(biāo)記的CD133抗體(滴度為1100)，避光染色15 min，PBS洗滌，然后加入200 μL PBS混勻，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD133表達(dá)，應(yīng)用Flowjo軟件進(jìn)行分析并計算CD133陽性細(xì)胞率。

1.2.5 Akt和p65抑制劑干預(yù)細(xì)胞的細(xì)胞活力和CD133表達(dá)的檢測取實驗組生長至90%融合度的HepG2-HIF-1α細(xì)胞，按照“1.2.4”項方法消化細(xì)胞并計數(shù)，按每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板，隨機(jī)分為HepG2-HIF-1α組、Akt激酶抑制劑組和NF-κB信號通路抑制劑組。第2天，Akt激酶抑制劑組加入終濃度為0.4、0.8、1.6、3.2、6.3、12.5、25.0 μmol·L-1的Akt激酶抑制劑，NF-κB信號通路抑制劑組分別加入終濃度為3.0、6.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol·L-1NF-κB信號通路抑制劑，設(shè)置空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g·L-1的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，吸棄培養(yǎng)液，加入200 μL 二甲基亞砜溶解10 min，于570 nm波長處測定吸光度值，計算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=不同濃度處理組細(xì)胞吸光值/空白對照組細(xì)胞吸光值。實驗重復(fù)3次，取均值。另取HepG2-HIF-1α組、AKT激酶抑制劑組和NF-κB信號通路抑制劑組細(xì)胞，按“1.2.4”項方法檢測細(xì)胞中CD133的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 空白對照組、對照組和實驗組GFP陽性細(xì)胞率及HIF-1α蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見表1和圖1、圖2。對照組和實驗組GFP陽性細(xì)胞率顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與實驗組GFP陽性細(xì)胞率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組細(xì)胞中HIF-1α蛋白相對表達(dá)量顯著高于空白對照組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；空白對照組與對照組細(xì)胞中HIF-1α蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 空白對照組、對照組和實驗組GFP陽性細(xì)胞率及細(xì)胞中HIF-1α蛋白相對表達(dá)量比較

圖1 空白對照組、對照組和實驗組細(xì)胞蛋白GFP蛋白表達(dá)(×200)

1：空白對照組；2：對照組；3：實驗組。

2.2 對照組和實驗組細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-p65/p65比較結(jié)果見表2和圖3。實驗組細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-p65/p65蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 對照組和實驗組細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-p65/p65比較

1：對照組；2：實驗組。

2.3 對照組和實驗組CD133陽性細(xì)胞率比較結(jié)果見圖4。對照組、實驗組CD133陽性細(xì)胞率分別為(4.42±0.29)%、(15.43±0.41)%，實驗組CD133陽性細(xì)胞率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.160，P<0.05)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測對照組和實驗組細(xì)胞中CD133的表達(dá)

2.4 Akt激酶抑制劑和NF-κB信號通路抑制劑干預(yù)細(xì)胞的細(xì)胞活力和CD133表達(dá)的比較0.4、0.8、1.6、3.2、6.3、12.5、25.0 μmol·L-1Akt激酶抑制劑組細(xì)胞活力分別為0.920±0.076、0.833±0.066、0.854±0.082、0.915±0.153、0.913±0.110、0.843±0.039、0.927±0.049，各濃度組間細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.301，P>0.05)；3.0、6.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol·L-1NF-κB信號通路抑制劑組細(xì)胞活力分別為0.978±0.065、0.894±0.050、0.995±0.028、0.987±0.043、0.982±0.067、1.055±0.112、0.901±0.030、0.937±0.056，各濃度組間細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.300，P>0.05)。HepG2-HIF-1α組、Akt激酶抑制劑組和NF-κB信號通路抑制劑組CD133陽性細(xì)胞率分別為(15.43±0.41)%、(8.61±0.53)%、(9.86±0.47)%，3組CD133陽性細(xì)胞率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=171.9，P<0.05)；Akt激酶抑制劑組和NF-κB信號通路抑制劑組CD133陽性細(xì)胞率顯著低于HepG2-HIF-1α組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.170、8.932,P<0.05)；Akt激酶抑制劑組與NF-κB信號通路抑制劑組CD133陽性細(xì)胞率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.745，P>0.05)。

3 討論

肝癌作為一種實體腫瘤，腫瘤內(nèi)通常存在缺氧，此時HIF-1α的降解過程受到抑制，細(xì)胞中大量表達(dá)HIF-1α[11-12]。HIF-1α作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞內(nèi)胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子等多種蛋白的表達(dá)，對細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡及干細(xì)胞特性等發(fā)揮重要調(diào)控作用[13]。研究結(jié)果顯示，在乳腺癌中缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α可通過A2BR/PKCδ通路誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞[14]。目前，關(guān)于HIF-α對肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性影響的相關(guān)研究報道較少。因此，本研究通過構(gòu)建HIF-1α過表達(dá)細(xì)胞HepG2-HIF-1α，觀察HepG2-HIF-1α與HepG2細(xì)胞中CD133的表達(dá)差異，以及細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-p65/p65的表達(dá)變化，分析HIF-α對肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性的影響及機(jī)制。

慢病毒過表達(dá)載體是生命科學(xué)研究中常用的實驗方法[15]，通常用于細(xì)胞或動物內(nèi)基因的表達(dá)與沉默。本研究中將含有GFP標(biāo)簽及嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體經(jīng)HIF-1A基因?qū)胫粮伟┘?xì)胞HepG2中，結(jié)果顯示，對照組和實驗組細(xì)胞中GFP相對表達(dá)量顯著高于空白對照組；對照組與實驗組細(xì)胞中GFP相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組細(xì)胞中HIF-1α蛋白相對表達(dá)量顯著高于空白對照組及對照組；空白對照組與對照組細(xì)胞中HIF-1α蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果證明，含有HIF-1α基因的慢病毒成功轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，并能夠正常表達(dá)，HepG2-HIF-1α細(xì)胞構(gòu)建成功。

腫瘤干細(xì)胞是指在腫瘤組織內(nèi)具有自我更新和分化增殖潛能的細(xì)胞[16]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中發(fā)揮重要作用[17]。國內(nèi)外研究已證實，包括肝癌在內(nèi)的多種實體腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞的存在可能是腫瘤治療失敗的一個主要原因。通常用作肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物有CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、OCT4、EpCAM等[18]。CD133是一種獨特的干細(xì)胞標(biāo)志物[19-22]，相對分子質(zhì)量為120 000，是一個由大約850個氨基酸組成的多肽鏈，具有5個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個巨大的胞外環(huán)，胞外環(huán)上具有4個潛在的糖基化位點，這些位點可與靶分子的結(jié)合位點結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用。CD133在腫瘤細(xì)胞干性及腫瘤耐藥方面發(fā)揮重要作用，日本學(xué)者WAKIZAKA等[18]研究報道，干細(xì)胞標(biāo)志物CD133或EpCAM的高表達(dá)與肝癌患者的生存期縮短相關(guān)。LIU等[21]報道，CD133與肝癌細(xì)胞的化學(xué)治療的抵抗性、放射治療的抵抗性及代謝重編程相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，實驗組CD133陽性細(xì)胞率顯著高于對照組，證實HIF-α蛋白過表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞系HepG2的干細(xì)胞特性。

CD133調(diào)控機(jī)制已成為近年來的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin、Hedgehog及Stat3信號通路均可促進(jìn)CD133表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞持續(xù)自我更新[23-24]。Akt在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號通路與肝癌細(xì)胞的自我更新及干細(xì)胞特性相關(guān)；CDCA8可通過抑制Akt/β-actenin 信號通路抑制肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性[25]；HYD-PEP06可通過抑制Akt 信號通路抑制肝癌干細(xì)胞特性[26]；KAHRAMAN等[27]研究顯示，IL-8可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞特性。細(xì)胞內(nèi)多種蛋白及miRNA的異常表達(dá)可通過活化Akt信號通路使肝癌細(xì)胞具有干細(xì)胞特性[28-29]。HE等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路通常異常活化。HU等[31]研究證實，CD13可通過NF-κB信號通路使肝癌細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。本研究結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-p65/p65顯著高于對照組，說明肝癌細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α后Akt/NF-κB信號通路被激活。此外，本研究結(jié)果顯示，不同濃度的AKT激酶抑制劑組和NF-κB 信號通路抑制劑組HepG2-HIF-1α細(xì)胞活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，Akt激酶抑制劑組和NF-κB信號通路抑制劑組CD133陽性細(xì)胞率均顯著低于HepG2-HIF-1α組；該結(jié)果提示，Akt/NF-κB信號通路異?；罨瘜Ω伟┘?xì)胞活力無顯著影響，而對肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性發(fā)揮重要的調(diào)控作用，HIF-1α 通過促進(jìn)Akt及NF-κB的磷酸化激活A(yù)kt/NF-κB 信號通路來增加肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

綜上所述，HIF-1α可通過促進(jìn)Akt及NF-κB p65的磷酸化誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表面CD133的表達(dá)，增加肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。但是，本研究未檢測AKT/NF-κB信號通路中的其他信號蛋白，而檢測其他信號蛋白將更有利于闡明HIF-1α誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞的特性的機(jī)制，后期需進(jìn)一步研究，以其為以HIF-1α為靶點治療肝癌提供更多理論證據(jù)。