慢性心力衰竭并發(fā)靜脈血栓患者vWF活性與其基因多態(tài)性及民族的相關(guān)性研究*

宋金萍，馬 晶，黃國虹

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心，新疆烏魯木齊 830001

慢性心力衰竭(CHF)是常見的心血管疾病，血栓栓塞是其嚴重的并發(fā)癥，近年來，CHF發(fā)生率呈明顯升高趨勢，且常被心功能不全的臨床表現(xiàn)所掩蓋，易漏診和誤診。CHF患者血管內(nèi)皮細胞損傷，血管性血友病因子(vWF)水平明顯升高，血液呈高凝狀態(tài)，是靜脈血栓形成的高危人群[1]。vWF 促進血小板的活化和聚集，充當凝血因子 Ⅷ(FⅧ) 載體，延長其半衰期，是血小板血栓和纖維素血栓形成的關(guān)鍵因素之一[2]。近期研究證實，vWF 過表達在心血管事件和動靜脈血栓形成中具有重要意義[3-5]。遺傳變異是靜脈血栓最主要的原發(fā)性危險因素，凝血系統(tǒng)基因多態(tài)性是研究方向之一。目前與血栓性疾病相關(guān)的vWF基因多態(tài)性位點中rs7966230(-1793G/C)多態(tài)性在不同種族之間存在明顯差異，且影響血漿vWF表達水平[6]。vWF 在動脈血栓中具有重要作用，但其在CHF患者并發(fā)靜脈血栓中的研究國內(nèi)外少見報道。鑒于 vWF 在心血管疾病和血栓形成中的重要作用，本研究探討新疆維吾爾自治區(qū)CHF靜脈血栓并發(fā)癥患者vWF活性與其基因多態(tài)性及民族的相關(guān)性，分探討新疆CHF 患者發(fā)生靜脈血栓的機制，為 CHF 抗凝治療提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2020年3月來本院就診的42例CHF并發(fā)下肢靜脈血栓患者作為CHF并發(fā)血栓組，其中男22例，女20例，年齡59～90歲，平均(72.47±12.88)歲，患者均為首次診斷出下肢靜脈血栓。健康對照組來自同期本院104例體檢健康者，男52例，女52例，年齡49～80 歲，平均(68.45±9.72)歲。

1.2儀器與試劑 核酸蛋白定量儀Nano-100(杭州奧康儀器有限公司)；電泳儀電源DYY-6C型(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)Tanon-2500(上海天能科技有限公司)；STAGO全自動凝血分析儀(法國STAGO公司)。ABI3730xl基因測序(美國ABI公司)。DNA提取試劑盒[小量全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型)，北京君諾德試劑公司]；DNA Marker-B(上海生工試劑公司)；vWF和凝血因子Ⅷ活性測定試劑盒(法國STAGO公司)。

1.3方法 采集研究對象乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周全血2～3 mL，提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳評估DNA質(zhì)量，采用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度。vWF基因rs7966230上游引物為5′-AAAGCGGACAGTGCGAGAC-3′，下游引物為5′-GGAGGAAGAGGAGCCTAAATG-3′，擴增產(chǎn)物片段約357 bp。PCR反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次。PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上150 mV電泳25 min，并采用凝膠成像儀拍照。PCR產(chǎn)物使用ABI3730xl測序。使用BioEdit和DNAman軟件分析實驗結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。采集研究對象枸櫞酸鈉抗凝外周全血2～3 mL，分離血漿，檢測vWF和FⅧ活性。

2 結(jié) 果

2.1vWF基因擴增及測序結(jié)果 vWF基因12外顯子rs7966230多態(tài)性位點位于6 126 547位堿基，其擴增產(chǎn)物大小為357 bp，見圖1。測序結(jié)果顯示，本研究檢測到3種基因型GC、GG和CC型。

注：M為DNA Marker-B;泳道1～11為目的基因。

2.2兩組vWF基因rs7966230多態(tài)性位點基因型和等位基因的分布情況 vWF基因rs7966230多態(tài)性位點檢出GG、GC、CC 3種基因型，vWF基因rs7966230多態(tài)性位點基因型的分布符合Hardy-Weinberg定律(P>0.05)。與健康對照組比較，CHF并發(fā)血栓組vWF基因rs7966230多態(tài)性位點的基因型和等位基因的分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組vWF基因rs7966230多態(tài)性位點基因型和等位基因分布情況[n(%)]

2.3不同民族vWF基因rs7966230多態(tài)性位點基因型分布情況 vWF rs7966230不同基因型在漢族和維吾爾族患者中的分布比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同民族vWF基因rs7966230多態(tài)性位點基因型分布情況(n)

2.4兩組vWF基因rs7966230多態(tài)性位點不同基因型凝血因子差異比較 健康對照組rs7966230位點不同基因型vWF、FⅧ活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CHF并發(fā)血栓組GC基因型vWF活性明顯高于CC型，F(xiàn)Ⅷ活性明顯高于GG型，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 vWF基因rs7966230位點不同基因型FⅧ和vWF活性比較

2.5不同民族vWF基因rs7966230位點不同基因型凝血因子差異比較 健康對照組和CHF并發(fā)血栓組各基因型不同民族vWF和FⅧ活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同民族vWF基因rs7966230位點不同基因型vWF和FⅧ活性比較

2.6CHF并發(fā)血栓患者vWF活性與其基因型及民族的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，vWF活性與rs7966230位點基因型(GC/CC)呈明顯正相關(guān)(r=0.433，P=0.034)，而與民族無明顯相關(guān)性(r=-0.017，P=0.913)。

3 討 論

血漿vWF水平在普通人群中差異很大，并且這種變異與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。有研究表明，vWF水平變異主要是由遺傳變異決定的[7-8]。不同單核苷酸多態(tài)性基因型的人群vWF表達水平也不同，對疾病的易感性也不同[9-11]。本課題組前期的研究已證實，與健康人群相比，CHF患者常存在高凝狀態(tài)，vWF和FⅧ活性均明顯升高，下肢靜脈血栓發(fā)生率高達20%，vWF基因調(diào)節(jié)區(qū)rs7966230(G/C)多態(tài)性位點在不同民族中的分布頻率有明顯差異，并與vWF的活性水平明顯相關(guān)[11]。

維吾爾族是我國新疆維吾爾自治區(qū)主要的少數(shù)民族，具有特殊的遺傳背景。傅玉等[12]有研究發(fā)現(xiàn)，我國裕固族rs7966230多態(tài)性位點基因型GG的分布遠高于漢族。在本研究中，rs7955230多態(tài)性位點GG、GC和CC基因型分布在健康對照組和CHF并發(fā)血栓組中的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，同時在健康對照組和CHF并發(fā)血栓組不同民族中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中，健康對照組漢族中GG、GC和CC基因型分別占46.94%、42.86%、10.20%，維吾爾族中GG、GC和CC基因型分別41.82%、49.09%、9.09%。這一研究結(jié)果與其他研究結(jié)果差異較大，尤其是CC基因型的分布頻率遠低于該研究中我國其他地區(qū)人群中的分布頻率。但是在NCBI數(shù)據(jù)庫中，該位點CC基因型在歐美人群中鮮見檢出，GC基因型占多數(shù)，同時鮮見中國人群的相關(guān)研究數(shù)據(jù)?？紤]可能因為本研究納入人群的年齡和性別與已知文獻報道不完全一致有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，在CHF并發(fā)血栓患者中GC基因型患者vWF活性高于CC型，相應(yīng)GC基因型FⅧ活性高于其他基因型(P<0.05)，但是相同基因型的不同民族患者的vWF和FⅧ活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這一結(jié)果提示CHF并發(fā)血栓患者可能存在影響rs7955230 位點GC基因型表達翻譯的調(diào)控因素，進而影響vWF活性。vWF是FⅧ的載體蛋白，可延長FⅧ的半衰期，因而GC型FⅧ活性也相應(yīng)高于其他基因型。相關(guān)性分析提示，CHF并發(fā)血栓患者血漿vWF活性與其基因多態(tài)性呈明顯正相關(guān)，而與民族無明顯相關(guān)性。

CHF并發(fā)血栓患者嚴重影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量，而在臨床上被及時診斷的僅僅是實際血栓發(fā)生數(shù)量的極小部分。改變血液高凝狀態(tài)、阻斷和逆轉(zhuǎn)血栓形成是治療CHF并發(fā)血栓的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。臨床上對具有高危獲得性危險因素的靜脈血栓患者普遍采用大劑量抗凝療法，但缺乏充分的用藥依據(jù)，并可引起嚴重的不良反應(yīng)[13-14]。積極探索以緩解血管內(nèi)皮損傷為基礎(chǔ)的預(yù)防CHF患者血栓栓塞發(fā)生的有效方法，將有助于揭示CHF患者發(fā)生靜脈血栓的機制，為CHF抗凝治療提供重要依據(jù)。

綜上所述，新疆維吾爾自治區(qū)CHF并發(fā)靜脈血栓患者vWF基因rs7955230多態(tài)性位點GC基因型與其活性密切相關(guān)，其可能受病理因素的調(diào)控，也有可能與其他基因位點存在連鎖反應(yīng)。該位點GC基因型vWF活性升高的具體機制值得進一步研究。由于CHF并發(fā)血栓病例相對難收集，因而樣本量較小，后續(xù)研究還需擴大樣本量進一步研究。