miR-27a在原發(fā)性痛風關(guān)節(jié)炎患者中的表達水平及生物信息學分析*

茍海梅，陳 瑩，徐 磊，李九龍，郭曉蘭，，鐘曉武，△

1．川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川南充 637000；2． 川北醫(yī)學院檢驗系，四川南充 637000； 3．川北醫(yī)學院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，四川南充 637000；4．南充市第五人民醫(yī)院檢驗科，四川南充 637100

痛風是機體嘌呤代謝紊亂、血尿酸水平持續(xù)升高而導(dǎo)致單鈉尿酸鹽(MSU)晶體析出并沉積于組織或器官而引起反復(fù)發(fā)作性炎性疾病[1]。近年來，隨著生活水平不斷提高，痛風的發(fā)病率逐年呈上升趨勢，已成為臨床常見病、多發(fā)病，且痛風發(fā)病年齡有向低齡化發(fā)展趨勢[2]。MSU晶體的沉積是痛風發(fā)生的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但痛風發(fā)病機制及炎癥自限的確切分子機制尚未完全闡明，仍是目前亟待解決的問題。

微小RNA(miRNA)是一類由22～24 個核苷酸組成的高度保守性內(nèi)源性非編碼小RNA，它通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)特異性結(jié)合降解靶mRNA和(或)抑制靶mRNA的表達及翻譯，進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。多項研究表明，miRNA在痛風發(fā)病機制中有關(guān)鍵性調(diào)控作用[4-6]。miR-27a在骨性關(guān)節(jié)炎[7]及系統(tǒng)性紅斑狼瘡[8]中均表達異常呈下調(diào)趨勢，提示miR-27a與炎性反應(yīng)負調(diào)控相關(guān)。已有研究表明，miR-27a在痛風患者中存在異常表達，其可能作為炎癥負性調(diào)控因子參與痛風的炎癥免疫反應(yīng)[9]，但其與痛風發(fā)生相關(guān)的確切靶分子機制尚不清楚。本研究運用生物信息學分析方法預(yù)測miR-27a作用的靶基因，對其靶基因進行GO富集分析、KEGG信號通路富集分析，為痛風炎癥免疫反應(yīng)研究提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 將川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕免疫科就診的20例男性原發(fā)性痛風性關(guān)節(jié)炎(PGA)患者納入PGA組，將20例體檢健康男性納入健康對照組。其中，PGA組平均年齡(44.30±13.27)歲，健康對照組平均年齡(47.70±12.65)歲，兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1miRNA檢測 采用人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)對人外周血單個核細胞(PBMC)進行分離，并用Trizol試劑盒(美國 Invitrogen公司)一步法提取人外周血單個核細胞總RNA，同時用紫外分光光度儀進行濃度測定。采用TaqMan MicroRNA Assays 試劑盒(美國Life Technologies公司)將miR-27a逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并采用實時熒光定量PCR進行擴增及熒光檢測，以 U6為內(nèi)參，嚴格按照說明書指示完成檢測操作。采用2-ΔΔCt法分析miRNA的相對表達量。

1.2.2miR-27a在人類基因組中的位置及保守性分析 應(yīng)用UCSC基因組在線軟件工具(http://genome.ucsc.edu/)分析miR-27a在人類基因組中的位置，查找不同物種間的成熟序列并分析其保守性。

1.2.3miR-27a靶基因篩選 應(yīng)用TargetScan (http://www.targetscanorg/)數(shù)據(jù)庫，miRDB(http://mirdb.org/)數(shù)據(jù)庫和RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/precomputed/)數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測 miR-27a 靶基因，同時運用GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)查詢與痛風發(fā)病相關(guān)的疾病基因。為了增加預(yù)測結(jié)果的可靠性，將4種數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集作為與痛風發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因。

1.2.4miR-27a靶基因的功能注釋 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對miR-27a預(yù)測靶基因集合進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能。

2 結(jié) 果

2.1miR-27a在人類基因組中的位置及保守性分析 應(yīng)用UCSC基因組在線軟件獲取miR-27a在人類基因組中的位置(圖1)，miR-27a定位于人類19q13.12染色體上chr19:13 836 440-13 836 517位置，長度共78 bp，其核苷酸序列在人、黑猩猩、大猩猩、獼猴、狒狒、小鼠、狗、大象物種中呈高度保守。

圖1 miR-27a 在基因組中的位置和保守性分析

2.2miR-27a 在PGA患者中的表達 應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測PGA組和健康對照組PBMC中miR-27a的相對表達水平，結(jié)果顯示，miR-27a在PGA組患者中的相對表達水平明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-27a 在PGA組和健康對照組中的表達水平

2.3篩選與痛風發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因 應(yīng)用TargetScan、miRDB和RNA22數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測miR-27a的靶基因，然后對miR-27a靶基因結(jié)果取交集，共得到 585個潛在調(diào)控靶基因。此外，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢與痛風發(fā)病相關(guān)基因共980個基因。將GeneCards數(shù)據(jù)庫所得基因與585個潛在調(diào)控靶基因再次取交集，最終得到MAPK14、RFX3、ABCA1、HS2ST1、ENPEP和CACNA2D3等共33個與痛風發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因。見圖3。

2.4預(yù)測靶基因的GO富集分析 對與痛風發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因進一步進行GO富集分析，GO富集分析結(jié)果顯示：miR-27a的靶基因顯著富集到生物過程調(diào)節(jié)、細胞過程調(diào)節(jié)、有機物代謝過程、多細胞生物過程、生物過程正調(diào)控、對外界刺激的反應(yīng)、主要代謝調(diào)節(jié)等多個生物學過程中；富集到質(zhì)膜的外側(cè)、細胞表面、血影蛋白細胞骨架及細胞膜的細胞組分；富集有機環(huán)化合物結(jié)合、蛋白結(jié)合、催化活性、離子結(jié)合等分子功能。見表1。

圖3 miR-27a靶基因預(yù)測

2.5預(yù)測靶基因的KEGG信號通路分析 對與痛風發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因進一步進行KEGG功能富集分析，KEGG信號通路分析顯示，miR-27a的靶基因顯著富集于MAPK信號通路、癌癥相關(guān)通路、Rap1信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、干細胞多能性調(diào)節(jié)信號通路、青少年成人起病型糖尿病通路和醛固酮控制的鈉鹽重吸收通路。見表2。

表1 miR-27a 預(yù)測靶基因 GO 富集分析結(jié)果

續(xù)表1 miR-27a 預(yù)測靶基因 GO 富集分析結(jié)果

表2 miR-27a預(yù)測靶基因 KEGG 信號通路分析

3 討 論

miRNA作為調(diào)控分子，可同時調(diào)節(jié)多個靶基因，參與生物體細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，從而對細胞特定功能和表型進行有效調(diào)控，發(fā)揮生物學功能[3]?，F(xiàn)有研究表明，miRNA與免疫功能失調(diào)、多種慢性炎癥或自身免疫病等相關(guān)[10-11]。通過UCSC基因組在線軟件分析，miR-27a核苷酸序列在多個物種中呈高度保守，提示其發(fā)生突變的概率低，有潛在的重要生物學功能。本研究對PGA組和健康對照組中miR-27a基因表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在PGA組中miR-27a基因表達水平較健康對照組明顯降低，與李寧寧等[9]研究結(jié)果一致，進一步提示miR-27a可能作為炎癥負性調(diào)控因子在痛風的炎癥免疫反應(yīng)過程中起到重要作用。

為進一步分析miR-27a參與痛風炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)的靶分子機制，準確預(yù)測其靶基因，本研究運用TargetScan、RNA22和miRDB 3個使用較多的靶基因預(yù)測軟件，取3個軟件共同預(yù)測的靶基因作為結(jié)果，利用不同軟件、不同算法從多角度分析，以增強預(yù)測結(jié)果的可靠性。本研究再將生物信息學方法預(yù)測的靶基因和 GeneCards數(shù)據(jù)庫中與痛風相關(guān)的基因聯(lián)合分析，取交集最終得到MAPK14、RFX3、ABCA1、HS2ST1、ENPEP、CACNA2D3等33個潛在的靶基因。MAPK14(即p38α)是p38MAPK最重要的亞型之一，p38MAPK信號通路與炎性反應(yīng)調(diào)控密切相關(guān)。有研究顯示，p38MAPK信號通路參與調(diào)控MSU誘導(dǎo)的單核細胞IL-8表達，進而參與痛風性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)[12]。在中國人群全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究中發(fā)現(xiàn)，RFX3是中國人群特有的原發(fā)性痛風易感基因[13]。RFX3由胰島β細胞分泌，可結(jié)合到葡萄糖激酶基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控其表達，從而影響胰島β細胞的功能[14]。胰島β細胞主要參與血糖的調(diào)節(jié)，糖代謝的紊亂不僅直接影響嘌呤的代謝及尿酸的合成，而且影響尿酸的排泄[15]。因此，RFX3突變可能引起胰島β細胞功能缺陷，從而直接或間接引起高尿酸血癥和痛風。

GO富集分析表明，miR-27a靶基因存在細胞代謝調(diào)節(jié)及對外界刺激的反應(yīng)等多種生物學功能。痛風屬于代謝性風濕病范疇，與嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥相關(guān)，高尿酸血癥所致的MSU沉積可作為外界刺激反復(fù)引起炎性反應(yīng)。KEGG通路富集分析顯示，miR-27a可能通過調(diào)控MAPK信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和醛固酮控制的鈉鹽重吸收通路等發(fā)揮生物學功能。MAPK信號通路是一類蘇氨酸蛋白激酶，可以被細胞外信號或刺激等激活，包括ERK1/2 MAPK、JNK MAPK、p38MAPK等活化途徑。目前研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2 MAPK、JNK MAPK和p38MAPK通路可誘導(dǎo)前炎癥細胞因子IL-8的產(chǎn)生，且參與調(diào)控MSU誘導(dǎo)的單核細胞IL-8表達[14，16-17]。在體外MSU誘導(dǎo)的單核細胞模型中發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞趨化活性90%來自IL-8，而大量中性粒細胞浸潤到關(guān)節(jié)腔并介導(dǎo)炎性反應(yīng)是痛風性關(guān)節(jié)炎的核心病理機制[14]。MAPK14是miR-27a預(yù)測靶基因，故筆者推測痛風性關(guān)節(jié)炎經(jīng)MSU刺激后，miR-27a基因表達水平降低，且作為炎癥負性調(diào)控因子靶向作用于MAPK14，MAPK14在痛風性關(guān)節(jié)炎呈高表達，MAPK14經(jīng)p38MAPK通路誘導(dǎo)單核細胞IL-8表達，IL-8激活中性粒細胞并浸潤到關(guān)節(jié)腔介導(dǎo)痛風炎性反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IL-1、IL-8、IL-10等細胞因子在痛風性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14]，miR-27a參與細胞因子-細胞因子受體相互作用，因此miR-27a可能通過細胞因子-細胞因子受體相互作用參與痛風性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制。醛固酮控制的鈉鹽重吸收系統(tǒng)失衡會引起腎臟的損傷，進而影響嘌呤的代謝及尿酸的合成，而且影響尿酸的排泄，miR-27a也可能通過參與醛固酮控制的鈉鹽重吸收直接或間接引起高尿酸血癥和痛風。

本研究通過生物信息學分析挖掘miR-27a在痛風炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)的靶分子機制，結(jié)果表明miR-27a可能通過調(diào)控多個與痛風發(fā)病相關(guān)的靶基因，影響多條信號通路的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，從而參與痛風炎癥免疫反應(yīng)機制，進一步為miR-27a調(diào)控痛風炎癥免疫反應(yīng)機制及痛風治療靶點提供了新的依據(jù)。