骨科創(chuàng)傷患者傷口分泌物金黃色葡萄球菌毒力基因分析

陳日壽，段俊林，陳 偉，葉林強，馮永洪，黃祖輝，劉亮洪

(1.東莞市中醫(yī)院檢驗科，廣東 東莞 523000；2.東莞市中醫(yī)院骨科，廣東 東莞 523000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SAU)廣泛分布于自然界中，是人類化膿性感染中常見的病原菌，也是創(chuàng)傷患者感染常見的病原菌之一[1]。SAU可攜帶多種毒力基因，不同種的毒力基因具備特定的生物學(xué)特性和致病特征，使菌株在毒力強度上具有明顯不同[2]。SAU相關(guān)毒力基因研究多見于鼻竇[3]及乳腺[4]感染等，而針對骨科創(chuàng)傷患者分離株毒力基因的研究尚少。為了解骨科創(chuàng)傷患者傷口分泌物SAU毒力基因檢出情況，本研究收集了80株骨科創(chuàng)傷患者傷口SAU分離株，檢測其毒力基因種類分布，并分析感染不同深淺位置的毒力基因分布情況，探討毒力基因與感染深淺位置的關(guān)系，旨為防控SAU的醫(yī)院內(nèi)感染提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年10月至2019年12月東莞市中醫(yī)院骨科創(chuàng)傷患者傷口分泌物標本80份，經(jīng)細菌培養(yǎng)分離出80株SAU菌株，根據(jù)感染深淺位置將其分為淺表感染組和深部感染組，每組40株。淺表感染為僅累計皮膚及皮下組織的感染，并具備下述情況之一：(1)傷口淺層有分泌物；(2)傷口淺層分泌物培養(yǎng)出細菌；(3)疼痛或壓痛、腫脹、紅熱，醫(yī)生因此將切口開放。深部感染為累及傷口深部筋膜及肌層的感染，并至少具備下述情況之一：(1)從傷口深部流出膿液；(2)傷口深部自行裂開或有醫(yī)生打開，且體溫>38 ℃、局部疼痛或壓痛；(3)經(jīng)臨床、手術(shù)、病理組織學(xué)或影像學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)切口深部有膿腫[5]。淺表感染組男26例，女14例；年齡32～74(52.4±6.5)歲。深部感染組男29例，女11例；年齡30～77(50.4±7.6)歲。2組患者的性別與年齡的比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準：所有患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理骨科創(chuàng)傷患者使用抗生素前,采用無菌技術(shù)從其創(chuàng)傷處采集分泌物,置于一次性無菌試管內(nèi)送檢，及時接種于血平板、麥康凱平板和沙保氏平板，置于35 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取血平板上菌落，同一患者多次送檢同類標本分離出同種細菌的只采用第1株。質(zhì)控菌株：SAU ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、糞腸球菌ATCC29212均來源于國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心。

1.2.2 試劑與儀器血平板、麥康凱平板和沙保氏平板均購自江門凱林貿(mào)易有限公司；細菌鑒定采用法國梅里埃公司的Vitek2 Compact全自動細菌檢測分析系統(tǒng)及其配套的GP鑒定卡。

1.3 毒力基因檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)進行毒力基因檢測，靶基因引物序列由廣州藍吉生物技術(shù)有限公司合成，靶基因引物序列：bbp上游引物序列為5′-CAACTACTACTGATGCCTCGGGTAA-3′，下游引物序列為5′-TTTAACCGTTGGCGTGTAACC-3′，目的產(chǎn)物長度104 bp；clfA上游引物序列為5′-TTTAGCGGCAGTAGCTGCAG-3′，下游引物序列為5′-TGCGGATACACAGTCGTACCAG-3′，目的產(chǎn)物長度105 bp；clfB上游引物序列為5′-AACGATTTCCAATGCGCAAG-3′，下游引物序列為5′-AGCAGCATTTACTACCGGTTCA-3′，目的產(chǎn)物長度93 bp；cna上游引物序列為5′-ATTAAAGTGGCATGGCCGAC-3′，下游引物序列為5′-CTGCTTGACCCACCTGTTCA-3′，目的產(chǎn)物長度96 bp；ebpS上游引物序列為5′-AAGACGCCGTGATTTAGCAAC-3′，下游引物序列為5′-CGATCATCTATTGTGCCAGCC-3′，目的產(chǎn)物長度102 bp；fnbA上游引物序列為5′-CAAACCCAGGTGGTGGTCAG-3′，下游引物序列為5′-TGTATGATCGCTCACTGCGC-3′，目的產(chǎn)物長度101 bp；hla上游引物序列為5′-AGGAAAAATTGGCGGCCTTA-3′，下游引物序列為5′-AGTTGGGCTCTCTAAAATTGTTTTG-3′，目的產(chǎn)物長度 97 bp；hlb上游引物序列為5′-TGGTGGCGTAGCGATTGTAA-3′，下游引物序列為5′-TCCAGCACCACAACGTGAAT-3′，目的產(chǎn)物長度187 bp；hld上游引物序列為5′-AATTTGTTCACTGTGTCGATAATCCA-3′，下游引物序列為5′-AATTAAGGAAGGAGTGATTTCAATGG-3′，目的產(chǎn)物長度 90 bp；hlg上游引物序列為5′-TTCGCCACTGAATCAGGTCA-3′，下游引物序列為5′-TGTCGCTTGAACCTTTTTCGT-3′，目的產(chǎn)物長度181 bp；icaA上游引物序列為5′-AGACACTTGCTGGCGCAGT-3′，下游引物序列為5′-CCTCCCAATGTTTCTGGAAC-3′，目的產(chǎn)物長度202 bp；lukE上游引物序列為5′-CCAAATGGTCCGTCAGGTTC-3′，下游引物序列為5′-CCAGTTCTAGGGAATAAAGTCGCA-3′，目的產(chǎn)物長度197 bp；lukM上游引物序列為5′-TCCGTCTTTTATCGCGACAGT -3′，下游引物序列為5′-TTCGGACGTTTTCCAATTCAC-3′，目的產(chǎn)物長度199 bp；map上游引物序列為5′-TTGATGTGCCATTTACTGCAATT-3′，下游引物序列為5′-AGTTCATGCGAAAGATGTTAAGAGAAT-3′，目的產(chǎn)物長度107 bp；pvl上游引物序列為5′-TGTGCCAGACAATGAATTACCC-3′，下游引物序列為5′-TCACTTTAGGCTGATCTGCAGTTG-3′，目的產(chǎn)物長度136 bp；sdrC上游引物序列為5′-AAATGAAACGACAGCCCCAAG-3′，下游引物序列為5′-TCACTTTAGGCTGATCTGCAGTTG-3′，目的產(chǎn)物長度104 bp；sdrD上游引物序列為5′-GGTAGATGCCAAAACTGAATCAACT-3′，下游引物序列為5′-TGATGATGGCTGTACTGCTGC-3′，目的產(chǎn)物長度190 bp；sdrE上游引物序列為5′-AGAAAAGCCAATGGCAAACGT-3′，下游引物序列為5′-CAGCTGGCGTTTCGAATTTAAC-3′，目的產(chǎn)物長度146 bp；splB上游引物序列為5′-GAATTTCTTGATCTCGGGTGTGA-3′，下游引物序列為5′-TCACCTCTGGGTCTTTAGCAACA-3′，目的產(chǎn)物長度122 bp；SSP上游引物序列為5′-AAGATTGCAGATCCATCGGC-3′，下游引物序列為5′-TCACCTCTGGGTCTTTAGCAACA-3′，目的產(chǎn)物長度181 bp。PCR擴增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性 3 min，然后95 ℃變性15 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸35 s，共40個循環(huán)，最后1個循環(huán)72 ℃延長至7 min。同時設(shè)置蒸餾水為陰性對照，加入SAU 16 sDNA作為內(nèi)參。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL緩沖液混均，點入瓊脂糖凝膠，120 V電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)成像并記錄。

1.4 毒力基因分析觀察淺表感染組和深部感染組SAU菌株的毒力基因分布情況，比較2組SAU菌株毒力基因檢出率的差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析；計數(shù)資料以株數(shù)和百分率表示，2組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAU毒力基因檢出情況80株SAU共檢出20種毒力基因，分別為黏附素基因bbp、clfA、clfB、cna、ebpS、fnbA、sdrC、sdrD、sdrE、icaA、map,溶血毒素基因hla、hlb、hld、hlg,殺白細胞素基因lukE、lukM、pvl,侵襲毒素基因splB、ssp。其中各種毒力基因的檢出情況分別為：黏附素基因bbp 78株(97.5%)、clfA 74株(92.5%)、clfB 75株(93.8%)、cna 66株(82.5%)、ebpS 75株(93.8%)、fnbA 80株(100.0%)、sdrC 56株(70.0%)、sdrD 40株(50.0%)、sdrE 77株(96.2%)、icaA 78株(97.5%)、map 72株(90.0%),溶血毒素基因hla 80株(100.0%)、hlb 78株(97.5%)、hld 74株(92.5%)、hlg 72株(90.0%),殺白細胞素基因lukE 71株(88.8%)、lukM 6株(7.5%)、pvl 19株(23.8%),侵襲毒素基因splB 14株(17.5%)、ssp 66株(82.5%)。

2.2 淺表感染組與深部感染組SAU毒力基因檢出率比較結(jié)果見表1。淺表感染組及深部感染組fnbA、hla基因檢出率均為100.0%(40/40)；深部感染組SAU的clfA、pvl、ssp基因檢出率高于淺表感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；深部感染組SAU的bbp、clfB、cna、ebpS、sdrC、sdrD、sdrE、icaA、map、hlb、hld、hlg、lukE、lukM及splB基因檢出率與淺表感染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組SAU毒力基因分布及檢出率比較

3 討論

健康人SAU在鼻腔黏膜定植率為7.7%～25.4%[6-7],人體皮膚也是SAU的高定植部位。骨科創(chuàng)傷患者因骨折或手術(shù)等原因?qū)е麦w表屏障受損和創(chuàng)傷部位組織液滲出，增加了原本定植的SAU的感染機會[8]，一旦SAU成功定植在創(chuàng)傷部位，就可以分泌毒素以逃避宿主免疫系統(tǒng)并分解宿主細胞，有助于SAU在創(chuàng)傷部位的侵襲和傳播[9]。

本研究從收集的80例骨科創(chuàng)傷患者的傷口分泌物標本中共分離出80株SAU菌株，采用PCR法對80株SAU進行毒力基因檢測，共檢出黏附素基因、溶血毒素基因、殺白細胞素基因及侵襲毒素基因4類共20種毒力基因。

黏附素基因編碼的黏附素是存在于細胞表面的具有使細菌黏附到宿主靶細胞作用的特殊結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白，是識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面組分之一，與SAU附著于人細胞外基質(zhì)上從而完成定植與感染有關(guān)。研究表明，clfA基因編碼的膜結(jié)合蛋白凝集因子與纖維蛋白原結(jié)合的能力對SAU的致病能力十分重要[10]，其結(jié)合產(chǎn)物可將機體免疫細胞限制在感染灶周圍,使其無法接觸到感染灶中心的細菌。本研究中,黏附素基因clfA、clfB基因檢出率在87.5%以上，低于PARK等[11]報道的100.0%檢出率，而fnbA檢出率高于其報道，其差異究竟是由于菌株來源不同還是納入研究的標本數(shù)不同所導(dǎo)致，尚需進一步研究。

殺白細胞素是由SAU菌株表達的細胞外毒素，是主要的致病因子之一，通過誘導(dǎo)多核白細胞的壞死或凋亡，最終導(dǎo)致白細胞死亡和組織壞死。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶殺白細胞素基因的SAU感染者體溫更高，感染范圍廣，胸腔積液多，炎癥指標水平高，侵襲性感染比例高，且并發(fā)癥嚴重，住院時間長[12]。本研究中80株SAU菌株共有19株檢出pvl基因，檢出率為23.7%，高于叢萌倩[13]的報道；而lukE和lukM基因檢出率分別為88.8%和7.5%，高于蔣斕等[4]的相關(guān)報道；分析其原因，除不同地區(qū)殺白細胞素基因陽性SAU菌株的流行存在差異外，也與本研究菌株來源于骨科創(chuàng)傷患者，而其他研究對象多為鼻竇或乳腺組織感染者有關(guān)。

攜帶侵襲毒素基因的SAU可使炎癥向組織縱深發(fā)展，使感染進一步擴散。本研究中，80株SAU的侵襲毒素基因ssp和splB的檢出率分別為 82.5%和17.5%，與許小敏[14]等報道的燒傷患者ssp和splB的檢出率為0.0%和60.0%有很大差別，這種差異究竟是地區(qū)流行差異還是其他原因所致尚需進一步探討。

溶血毒素是SAU菌株產(chǎn)生的造孔蛋白之一，根據(jù)抗原不同可將溶血毒素分為α、β、γ和δ 4種，分別由hla、hlb、hld、hlg 4種基因編碼。溶血毒素是SAU感染的關(guān)鍵毒力因子，通過損傷紅細胞、血小板引起局部缺血壞死。本研究中，hla、hlb、hld、hlg 4種溶血毒素基因的檢出率分別為100.0%、97.5%、92.5%、90.0%，其中hla基因的檢出率與蔣斕等[4]報道一致，而hlb、hld、hlg 3種溶血毒素基因的檢出率高于蔣斕等[4]的報道，可能與菌株來源及標本數(shù)量不同有關(guān)。

SAU相關(guān)毒力基因研究多見于鼻竇[3]及乳腺[4]感染等，本研究以臨床感染深淺位置將從骨科創(chuàng)傷患者傷口分泌物分離的80株SAU菌株分為淺表感染組和深部感染組，結(jié)果顯示，淺表感染組及深部感染組 SAU的fnbA、hla基因檢出率均為100.0%(40/40)，深部感染組SAU的黏附素基因clfA、殺白細胞素基因pvl、侵襲毒素基因ssp檢出率顯著高于淺表感染組，深部感染組SAU的bbp、clfB、cna、ebpS、sdrC、sdrD、sdrE、icaA、map、hlb、hld、hlg、lukE、lukM及splB基因檢出率與淺表感染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示黏附素基因clfA、殺白細胞素基因pvl、侵襲毒素基因ssp可能在影響SAU的黏附定植并導(dǎo)致定植部位的組織壞死，進而使炎癥向組織縱深擴散，最終導(dǎo)致深部感染的進程中起關(guān)鍵作用。

綜上所述,骨科創(chuàng)傷患者傷口分泌物分離SAU檢出的20種毒力基因在淺部感染和深部感染患者均有檢出，其中clfA基因、pvl基因和ssp基因可能與感染深度有關(guān)。