Ⅳ型膠原蛋白基因α1對胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡的調(diào)控作用與機制

李怡君，楊振威，陳曉露，司望利

(西安市中心醫(yī)院消化科，陜西 西安 710003)

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的常見惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康[1]。胃癌的發(fā)病率和致死率在全球范圍內(nèi)均處于較高水平[2-3]。Ⅳ型膠原蛋白基因α1(type Ⅳ collagen gene α1，COL4A1)是一種特殊的膠原蛋白，參與了基底膜的構(gòu)成，與多種血管疾病相關(guān)[4-5]。有研究表明，COL4A1在多種腫瘤組織中存在異常表達，且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[6-7]。通過調(diào)控COL4A1的表達能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、增殖以及凋亡能力[8]。此外，微陣列分析發(fā)現(xiàn),COL4A1在胃癌組織中異常表達，且與胃癌的術(shù)后復(fù)發(fā)和不良預(yù)后有關(guān)[9]。但COL4A1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制仍不清晰。本研究旨在探討COL4A1在胃癌的病理發(fā)展中的調(diào)控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 病理組織樣本來源本研究中所用到的胃癌組織以及匹配的癌旁組織(取自距離腫瘤組織5 cm外的正常組織)樣本來自2015年9月至2017年5月于西安市中心醫(yī)院接受胃癌切除手術(shù)的52例患者的標本?；颊咝g(shù)前均未接受過化學(xué)治療、放射治療，患者均無其他部位腫瘤，所有患者及其家屬同意樣本采集和應(yīng)用并簽署了知情同意書，本研究得到西安市中心醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 細胞、試劑與儀器人正常胃黏膜上皮細胞GES-1及胃癌細胞系(SGC-7901、MKN-28、BGC-803、MGC-823、MKN-45和AGS)均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、胎牛血清、青霉素G、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、細胞裂解液購自加拿大Gibio公司，LipofectarmineTM3000和TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting Kit-8，CCK-8)購自日本Dojindo公司，EcoDryTMPremix(Oligo dT)和SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自大連Takara公司，二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，COL4A1 小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的合成由生工生物工程(上海)股份公司完成，磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路激活劑740 Y-P購自美國Med Chem Express公司；基質(zhì)膠、細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)將所有的胃癌細胞接種于2 mL含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 000 U·L-1青霉素G以及100 g·L-1鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞生長至80%融合度時，使用胰蛋白酶對細胞進行消化，同時使用PBS清洗細胞，然后進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測胃癌組織、癌旁組織、胃癌細胞及正常胃黏膜上皮細胞中COL4A1基因的表達胃癌組織、癌旁組織、胃癌細胞及GES-1細胞經(jīng)過消化、研磨破碎后，使用TRIzol試劑盒提取總RNA，于NanoDrop OD儀上分析RNA濃度。EcoDryTMPremix(Oligo dT)試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄實驗。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行RT-qPCR實驗。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃ 保存。所有實驗操作均按照試劑盒使用說明書進行。以β-actin為內(nèi)參基因。引物序列如下：COL4A1正向引物序列為5′-CTCCAGTATCTCTTTTGT-3′，反向引物序列為5′-TATTTCTATGAGCCACCT-3′；β-actin正向引物序列為5′-CACTCTCGAGATGGCTACTCAAGCTG-3′，反向引物序列為5′-CTGCGGATCCTTACAGGTCAGTATCAAAC-3′。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。根據(jù)6種胃癌細胞中COL4A1基因的表達情況，AGS和SGC-7901細胞被用于進行后續(xù)的細胞功能驗證實驗。

1.3.3 細胞分組及處理將經(jīng)過胰蛋白酶消化并計數(shù)的AGS、SGC-7901細胞接種于6孔板，并于融合度達到90%后，將2種細胞分為對照組、陰性對照(negative control，NC)siRNA組、siCOL4A1-1組、siCOL4A1-2組和siCOL4A1-2+740 Y-P組。對照組細胞正常培養(yǎng)，不進行任何處理；NC siRNA組細胞轉(zhuǎn)染NC siRNA，siCOL4A1-1組細胞轉(zhuǎn)染siCOL4A1-1，siCOL4A1-2組細胞轉(zhuǎn)染siCOL4A1-2，siCOL4A1-2+740 Y-P組細胞轉(zhuǎn)染siCOL4A1-2，然后使用50 mg·L-1的740 Y-P處理90 min。細胞轉(zhuǎn)染實驗的操作步驟依照LipofectarmineTM3000試劑盒說明書進行，siRNA轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol·L-1，轉(zhuǎn)染時長48 h。其中siCOL4A1-1組僅用于RT-qPCR實驗。

1.3.4 RT-qPCR法檢測對照組、NC siRNA組、siCOL4A1-1組和siCOL4A1-2組AGS SGC-7901細胞中COL4A1基因的表達采用“1.4”項中方法檢測4組細胞中COL4A1基因的表達。根據(jù)檢測結(jié)果選擇siCOL4A1-2組細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.5 CCK-8實驗測定AGS、SGC-7901細胞增殖能力取對照組、NC siRNA組、siCOL4A1-2組和siCOL4A1-2+740 Y-P組的AGS和SGC-7901細胞100 μL(5 × 107L-1)分別接種于96孔板中,預(yù)培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)基后，將各組細胞均分為4個亞組，分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4 d，隨后分別加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃下避光孵育2 h，使用酶標儀測定樣本在450 nm波長下的吸光度(absorbance,A450)，實驗重復(fù)3次，取均值。吸光度越大代表細胞增殖能力越強。

1.3.6 膜聯(lián)蛋白-V/異硫氰酸熒光素(annexin Ⅴ/fluorescein isothiocyanate,Annexin Ⅴ/FITC)實驗檢測AGS、SGC-7901細胞凋亡情況取對照組、NC siRNA組、siCOL4A1-2組和siCOL4A1-2+740 Y-P組的AGS和SGC-7901細胞，1 200 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)基上清液后，使用預(yù)冷的PBS清洗，隨后加入500 μL Annexin Ⅴ 結(jié)合緩沖液，混勻后避光孵育25 min。使用5 μL Annexin Ⅴ/FITC以及 5 μL 碘化丙啶對各組細胞進行染色。最后使用流式細胞儀及Cell Quest軟件對實驗結(jié)果(熒光染色)進行分析并計算細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.7 Transwell實驗檢測AGS、SGC-7901細胞遷移和侵襲能力取對照組、NC siRNA組、siCOL4A1-2組和siCOL4A1-2+740 Y-P組的AGS和SGC-7901細胞，在進行Transwell實驗前轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。細胞遷移實驗：取各組細胞200 μL(1 × 106L-1)接種于Transwell小室(濾膜孔徑為8 μm)的上層，下層孔板中補入800 μL含有體積分數(shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后用棉簽輕輕刮拭掉上層未穿膜的細胞，PBS清洗后，光學(xué)倒置顯微鏡下隨機計數(shù)5個不同視野范圍內(nèi)的細胞數(shù)量，取均值。在使用Transwell測定細胞侵襲的實驗中，需在Transwell的上層小室提前鋪入50 μL的Matrigel膠，其余操作步驟與細胞遷移實驗相同。

1.3.8 Western blot法檢測AGS和SGC-7901細胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達分別使用細胞裂解液和二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒裂解對照組、NC siRNA組、siCOL4A1-2組和siCOL4A1-2+740 Y-P組的AGS和SGC-7901并提取總蛋白。提取物經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至含體積分數(shù)5%的脫脂牛奶封閉液的聚偏二氟乙烯膜上，并分別在anti-p-PI3K、anti-PI3K、anti-p-Akt以及anti-Akt抗體(稀釋比11 000)作用下4 ℃過夜孵育。然后三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗薄膜，加入辣根過氧化物酶抗體(稀釋比14 000)室溫孵育2 h。增強化學(xué)發(fā)光顯色液曝光蛋白條帶，以目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參條帶的灰度值代表目的蛋白相對表達量。以p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt比值表示PI3K/Akt通路的激活水平。此部分實驗以β-actin為內(nèi)參蛋白，用于均一化蛋白測定條件。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、癌旁組織、胃癌細胞及正常胃黏膜上皮細胞中COL4A1基因的表達情況胃癌組織及癌旁組織中COL4A1基因的相對表達量分別為1.978±0.061、0.979±0.043，胃癌組織中COL4A1基因的相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

AGS、BGC-823、MGC-803、MKN-28、MKN-45、SGC-7901細胞中COL4A1基因的相對表達量均顯著高于GES-1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AGS、SGC-7901細胞中COL4A1基因的相對表達量顯著高于BGC-823、MGC-803、MKN-28、MKN-45細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BGC-823、MGC-803、MKN-28、MKN-45細胞中COL4A1基因的相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。選擇AGS和SGC-7901細胞用于后續(xù)細胞功能驗證實驗(細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等)。

表1 COL4A1基因在正常胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞中的表達比較

2.2 siRNAs對AGS和SGC-7901細胞中COL4A1基因表達的影響結(jié)果見表2。siCOL4A1-1和siCOL4A1-2組AGS、SGC-7901細胞中COL4A1基因相對表達量均顯著低于NC siRNA組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siCOL4A1-2組AGS、SGC-7901細胞中COL4A1基因的相對表達量顯著低于siCOL4A1-1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。選擇siCOL4A1-2組細胞進行后續(xù)實驗。

表2 對照組、NC siRNA組、siCOL4A1-1組、siCOL4A1-2組AGS和SGC-7901細胞中COL4A1基因表達的比較

2.3 4組AGS和SGC-7901細胞增殖和凋亡情況比較結(jié)果見表3和表4。siCOL4A1-2組AGS細胞的增殖能力在培養(yǎng)3 d和4 d時顯著低于對照組和NC siRNA組，SGC-7901細胞的增殖能力在培養(yǎng)1、2、3、4 d時均顯著低于對照組和NC siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siCOL4A1-2+740 Y-P組AGS細胞的增殖能力在培養(yǎng)3 d和4 d時顯著高于siCOL4A1-2組，SGC-7901細胞的增殖能力在培養(yǎng)1、2、3、4 d時均顯著高于siCOL4A1-2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組細胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 4組AGS和SGC-7901細胞增殖能力比較

表4 4組AGS和SGC-7901細胞凋亡率比較

siCOL4A1-2組AGS、SGC-7901細胞的凋亡率均顯著高于對照組和NC siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siCOL4A1-2+740 Y-P組AGS、SGC-7901細胞的凋亡率均顯著低于siCOL4A1-2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組2種細胞凋亡率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 4組AGS和SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的比較結(jié)果見表5。siCOL4A1-2組AGS、SGC-7901細胞遷移能力和侵襲能力均顯著低于對照組和NC siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siCOL4A1-2+740 Y-P組AGS、SGC-7901細胞遷移能力和侵襲能力均顯著高于siCOL4A1-2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組2種細胞遷移能力和侵襲能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 4組AGS和SGC-7901細胞遷移和侵襲能力比較

2.5 4組AGS和SGC-7901細胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的比較結(jié)果見圖1及表6。對照組與NC siRNA組AGS、SGC-7901細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；siCOL4A1-2組AGS、SGC-7901細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值顯著低于對照組和NC siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；siCOL4A1-2+740 Y-P組AGS、SGC-7901細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值顯著高于siCOL4A1-2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A:AGS細胞；B:SGC-7901細胞；1：對照組；2：NC SiRNA組；3：siCOL4A1-2；4：siCOL4A1-2+740 Y-P組。

表6 4組AGS和SGC-7901細胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達的比較

3 討論

研究表明，Ⅳ型膠原蛋白是構(gòu)成基底膜最主要且最重要的成分[6]?；啄づc層粘連蛋白、纖連蛋白和肌動蛋白一并構(gòu)成了特殊形式的細胞外基質(zhì)[10]。此外，基底膜不僅是組織的結(jié)構(gòu)特征、血管的功能成分，同樣也是調(diào)節(jié)腫瘤細胞行為的重要成分[11]。COL4A1是Ⅳ型膠原蛋白家族中的一員，其突變被認為參與了多種血管疾病的病理進程，包括心肌梗死、家族性腎病、腦卒中等[3-4,12]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)COL4A1的異常表達與腫瘤疾病相關(guān)。MIYAKE等[6]研究表明，膀胱尿路上皮癌的腫瘤細胞產(chǎn)生的COL4A1通過誘導(dǎo)腫瘤出芽在腫瘤侵襲中起著關(guān)鍵作用。COL4A1在肝癌中的高表達水平與腫瘤晚期進展以及肝癌患者不良的生存情況密切相關(guān)[13]。此外，沉默COL4A1能夠降低乳腺癌細胞活力，阻滯細胞周期[14]。近來，科學(xué)家通過測序及微陣列分析等生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，COL4A1在胃癌中存在異常表達，并可能與胃癌細胞的生長、耐藥性及術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[9,15-16]。本研究證實，COL4A1在胃癌組織與細胞中表達上調(diào)，這與先前的研究結(jié)論一致[9]。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，沉默COL4A1可顯著抑制胃癌細胞的增殖、遷移與侵襲能力，并促進細胞凋亡。

PI3K/Akt是生物體內(nèi)最重要的參與多種細胞基本進程調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[17]。研究表明，PI3K/Akt信號通路的失調(diào)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的許多疾病相關(guān)[18-20]。HUANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt通路能夠促進胃癌細胞的侵襲能力。阻斷PI3K/Akt通路可以有效地抑制胃癌細胞的增殖[19]。YANG等[22]研究證實，抑制PI3K/Akt通路可促進胃癌細胞的凋亡，進而抑制腫瘤進展。有研究表明，COL4A1可能是通過PI3K/Akt通路激活成纖維細胞來合成膠原蛋白[23]。本研究結(jié)果顯示，PI3K/Akt信號通路在胃癌細胞中被高度激活，而沉默COL4A1顯著抑制了PI3K/Akt通路的激活，使用740 Y-P激活該通路能夠逆轉(zhuǎn)COL4A1沉默對胃癌細胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移能力的影響。

綜上所述，COL4A1在胃癌組織和細胞中的高表達參與了腫瘤病理發(fā)展的調(diào)控。沉默COL4A1能夠抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，同時促進細胞凋亡。此外，本研究還證實了COL4A1可通過PI3K/Akt信號通路對胃癌細胞功能及腫瘤發(fā)展進行調(diào)控。