陳曦　楊金先　李英英　陳強　黃小紅　宋鐵英　葛均青

摘要：【目的】克隆鰻鱺皰疹病毒（Anguillid herpesvirus，AngHV）ORF87基因，分析其序列特征并制備多克隆抗體，為揭示ORF87基因在AngHV侵染過程中的作用機制提供技術(shù)支持?！痉椒ā扛鶕?jù)GenBank已公布AngHV參考株（NC_013668）的ORF87基因序列設(shè)計引物，從AngHV-FJ株基因組中擴增出ORF87基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-ORF87經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后，采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在線軟件進行生物信息學分析;將ORF87基因克隆至pET-32a表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE檢測及Western blotting鑒定;以純化的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備ORF87多克隆抗體?！窘Y(jié)果】克隆獲得的AngHV-FJ株ORF87基因為2127 bp，與GenBank已發(fā)布的參考序列高度同源（相似性為99.72%），僅存在4個堿基突變;其編碼蛋白分子量為80.1 kD，理論等電點（pI）為7.62，不穩(wěn)定系數(shù)為42.38，總平均親水性為-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族（PKC-like Superfamily）的保守結(jié)構(gòu)域，但不具信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域;其亞細胞定位可能位于細胞核和細胞質(zhì)膜，存在19個潛在B細胞抗原表位，即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大腸桿菌中高效表達，表達獲得的融合蛋白約100.0 kD，主要以包涵體形式存在;以融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備獲得的ORF87多克隆抗體效價達1∶16000，能特異性識別AngHV的ORF87蛋白。【結(jié)論】AngHV-FJ株源ORF87基因經(jīng)原核表達載體誘導(dǎo)表達獲得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性，以其免疫新西蘭大白兔制備獲得的ORF87多克隆抗體具有高效價，能特異性識別AngHV感染，可作為亞細胞定位及表達時相分析等蛋白特性研究的工具，用于解析ORF87基因在AngHV侵染過程中的作用。

關(guān)鍵詞： 鰻鱺皰疹病毒（AngHV）;ORF87基因;原核表達;多克隆抗體;免疫原性

中圖分類號： S941.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0538-08

Cloning， prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of Anguillid herpesvirus ORF87

CHEN Xi YANG Jin-xian LI Ying-ying CHEN Qiang HUANG Xiao-hong SONG Tie-ying GE Jun-qing

（1Institute of Biotechnology，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science， Fuzhou? 350003， China; 2 College of Animal Science （College of Bee Science）， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou? 350028， China）

Abstract：【Objective】Anguillid herpesvirus （AngHV） ORF87 was cloned， analyzed on sequence features， and prepared for polyclonal antibody， so as to provide technical support for revealing the role of ORF87 gene on the AngHV infection.【Method】The ORF87 sequence was amplified from the genome of AngHV-FJ strain by PCR with primers based on the AngHV reference strain （NC_013668） in GenBank to construct recombinant plasmid pMD19-ORF87. The gene was verified by restriction enzyme digestion and sequencing. The bioinformatics information was analyzed by online softwares such as Softberry， ProtParam， CDD， TMHMM， SignalP 5.0， PSORT and BepiPred. Then， ORF87 was cloned into the expression vector pET-32a and transformed into Escherichia coli BL21 （DE3） competent cells The transformed E. coli was induced by IPTG， and the protein expression of ORF87 gene was validated by SDS-PAGE and Western blotting analysis. The expressed fusion protein was purified， and used to immunize New Zealand rabbits to prepare anti-ORF87 polyclonal antibody. 【Result】The AngHV-FJ ORF87 was 2127 bp with only four base mutations， which shared high similarity （99.72%） with the reference sequence in GenBank. The molecular weight of its encoded protein was 80.1 KD， the theoretical isoelectric point （PI） was 7.62， the instability coefficient was 42.38， and the total average hydrophilicity was -0.271. ORF87 contained a conserved domain of PKC-like Superfamily， but the protein had no signal peptide and transmembrane domain. The subcellular localization of the protein was predicted to localize on the nucleus and cytoplasmic membrane with good immunogenicity due to 19 potential B-cell antigen epitopes. It was indicated that the AngHV-FJ ORF87 could be highly expressed in E. coli. The fusion protein was? expressed at the size of 100 kD and mainly in the form of inclusion body. The prepared rabbit anti-ORF87 polyclonal antibody by fusion protein could specifically recognize AngHV ORF87 with serum titer of 1∶16000. 【Conclusion】The fusion protein ORF87 of AngHV-FJ induced by prokaryotic expression vector has Serine/threonine protein kinase activity. The anti-ORF87 polyclonal antibody obtained by immunizing the rabbits has high titer and specific recognition with AngHV infection. The antibody can be used as a tool to study protein characteristics such as subcellular localization and expression profile， which is helpful to reveal the role of ORF87 gene on the AngHV infection.

Key words： Anguillid herpesvirus（AngHV）; ORF87 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; immunogenicity

Foundation items：Fujian Natural Science Foundation （2019J01109）; Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund of Fujian Province （2018R1019-4）; “5511”Collaborative Innovation Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences （XTCXGC2021013）

0 引言

【研究意義】鰻鱺皰疹病毒（Anguillid herpesvirus，AngHV）隸屬于魚蛙皰疹病毒亞科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus），是鰻鱺養(yǎng)殖過程中的主要病原之一，能給其養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失（楊金先等，2020）。AngHV可造成養(yǎng)殖的歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）和美洲鰻鱺（A. rostrata）暴發(fā)脫黏敗血綜合征，是黑仔和幼鰻階段的主要傳染性病原，其典型臨床癥狀為脫黏、紅頭和敗血等，具發(fā)病率高、傳染性強及死亡率高等特點（陳強等，2021）。因此，開展AngHV的功能基因研究對快速診斷及科學防控AngHV感染具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M展】AngHV為線性雙鏈DNA病毒，其基因組全長248.5 kb，包括136個開放閱讀框（ORF）（van Beurden et al.，2010，2011）。自首次發(fā)現(xiàn)AngHV以來，已有諸多學者針對其基因組（van Beurden et al.，2010;Donohoe et al.，2021）、結(jié)構(gòu)蛋白（van Beurden et al.，2011，2013）及轉(zhuǎn)錄組（van Beurden et al.，2012）等進行大量研究，不僅明確了該病毒與鯉科皰疹病毒（Cyprinid herpesviruses）的近源性，還分析了病毒基因的特征、轉(zhuǎn)錄剪切方式、病毒結(jié)構(gòu)蛋白及預(yù)測部分蛋白在病毒侵染中的潛在作用，為建立免疫學診斷方法、防控策略研究及疫苗開發(fā)等奠定了理論基礎(chǔ)。流行病學調(diào)查研究顯示，AngHV在全球多個地區(qū)的養(yǎng)殖鰻鱺和野生鰻鱺中廣泛存在，且可能是造成野生鰻鱺資源銳減的主要因素（Haenen et al.，2002;Jakob et al.，2009;Bandín et al.，2014;Kempter et al.，2014）。在我國，已從養(yǎng)殖鰻鱺病料中成功分離鑒定出AngHV福建株（AngHV-FJ）（葛均青等，2014），并建立PCR及實時熒光定量PCR等檢測方法（葛均青等，2012;李英英等，2021）;此外，通過分析AngHV-FJ株的致病性、生物學和理化特性等基本特征（楊金先等，2020;陳強等，2021），為后續(xù)開展AngHV的入侵機制研究奠定了基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】病毒基因組功能預(yù)測顯示AngHV的ORF87可能具有磷酸蛋白激酶活性（van Beurden et al.，2010），而轉(zhuǎn)錄時相分析證實ORF87基因為病毒的早期基因（van Beurden et al.，2013），其編碼的激酶可能在調(diào)控病毒入侵、復(fù)制及釋放等過程中發(fā)揮重要作用（Schang et al.，2006），但至今未見AngHV ORF87基因克隆及其多克隆抗體制備的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆AngHV-FJ株ORF87基因，通過構(gòu)建高效表達的原核表達載體以獲得高純度融合蛋白，并制備特異性O(shè)RF87多克隆抗體，為揭示ORF87基因在AngHV侵染過程中的作用機制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

AngHV-FJ株及鰻鱺卵巢細胞系（EO）、pET-32a表達載體、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞及BL21（DE3）感受態(tài)細胞均由福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所保存提供。DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，pMD19-T載體及T4 DNA連接酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 AngHV-FJ株擴繁及基因組DNA提取 EO細胞以含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基（Hyclone）在26 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當EO細胞鋪滿單層后按感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）為1.0的比例接種AngHV-FJ株，待大部分細胞出現(xiàn)細胞病變（CPE）時收集細胞，利用PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit （Invitrogen）提取病毒基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 ORF87基因克隆 根據(jù)AngHV參考株的基因組序列（NC_013668），設(shè)計擴增ORF87基因的特異引物，并分別引入酶切位點Hind III和Xho I，引物序列為ORF87-F：5'-AAGCTTATGTTGCACATGTT GCTT-3'和ORF87-R：5'-CTCGAGTCAGGCGTCAT AAGAGGC-3'（下劃線處為酶切位點）。以提取的AngHV-FJ株基因組DNA為模板，進行ORF87基因PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物電泳后使用DNA膠回收試劑盒進行回收純化，并克隆至pMD19-T載體上;以質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定后委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，驗證重組質(zhì)粒pMD19-ORF87是否構(gòu)建成功。

1. 2. 3 生物信息學分析 利用NCBI中的BLAST對擴增獲得的ORF87基因序列進行比對分析，采用Softberry進行基因轉(zhuǎn)錄啟動子分析，運用ExPASy中的ProtParam預(yù)測編碼蛋白理化性質(zhì)，使用CDD、TMHMM、SignalP 5.0分別預(yù)測編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽，利用PSORT預(yù)測編碼蛋白亞細胞定位，并以BepiPred預(yù)測編碼蛋白的B細胞抗原表位。

1. 2. 4 原核表達質(zhì)粒構(gòu)建 采用Hind III/Xho I雙酶切重組質(zhì)粒pMD19-ORF87和pET-32a表達載體，利用DNA膠回收試劑盒純化回收目的片段，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，以檢驗原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87是否構(gòu)建成功。

1. 2. 5 融合蛋白誘導(dǎo)表達及Western blotting鑒定

以原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑選單菌落接種至含100 μg/mL氨芐青霉素（Ampicillin）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日按1∶100的比例接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至吸光值（OD）為0.6～0.8時加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集菌體，經(jīng)超聲波破碎后進行SDS-PAGE檢測分析。

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測后，以半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液37 ℃封閉1.0 h;經(jīng)TBST緩沖液洗膜后，與1∶3000倍稀釋的鼠抗His-Tag單克隆抗體在室溫下共孵育1.5 h;TBST緩沖液洗膜，再與1∶5000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG在室溫下共孵育1.0 h;TBST緩沖液洗膜，采用Super ECL Plus化學發(fā)光液（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司）顯色，并以上海勤翔ChemiScope 6000 Touch成像系統(tǒng)進行拍照。

1. 2. 6 融合表達蛋白純化及多克隆血清制備 收集表達菌株以超聲波破碎，經(jīng)SDS-PAGE檢測分離及染色后將含目的條帶的凝膠切下，置于-80 ℃預(yù)冷的研缽中研磨，采用PAGE-膠蛋白微量回收試劑盒進行回收，蛋白樣品-80 ℃保存?zhèn)溆?。選取2只體重約2 kg的健康新西蘭大白兔，耳靜脈采血2.0 mL為陰性對照。以制備的純化融合蛋白為抗原，按1∶1的比例與弗氏完全佐劑（FCA）充分乳化后，在新西蘭大白兔的背部、腋窩及腹股溝進行多點皮下注射（1 mL/只）。在首次免疫后第14和28 d，分別取純化融合蛋白與弗氏不完全佐劑（FIA）按1：1的比例充分乳化后注射新西蘭大白兔，在首次免疫后第42 d取純化融合蛋白進行加強免疫。末次免疫1周后大量采血，離心收集血清，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 7 血清抗體效價測定及特異性分析 采用間接ELISA測定制備的血清抗體效價，具體步驟：以純化融合蛋白ORF87包被96孔酶標板，抗原含量為10 μg/mL，每孔50 μL;包被液為空白對照;以制備獲得的兔抗血清為一抗，以免疫前兔血清為陰性對照，按起始稀釋度為1∶1000進行2倍等比稀釋，每個樣品重復(fù)3次;以HRP標記羊抗兔IgG為二抗，OPD顯色后采用酶標儀測定OD492 nm。取感染AngHV-FJ株的EO細胞，以正常EO細胞為對照，HRP標記羊抗兔IgG為二抗，通過Western blotting對制備獲得的兔抗血清進行特異性檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 AngHV-FJ株ORF87基因克隆結(jié)果

利用設(shè)計的引物對ORF87-F/ORF87-R從AngHV-FJ株基因組中擴增出約2100 bp的特異性條帶（圖1-A），克隆至pMD19-T載體后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定（圖1-B），經(jīng)測序驗證ORF87基因為2127 bp，即成功克隆獲得AngHV-FJ株的ORF87基因，也說明重組質(zhì)粒pMD19-ORF87構(gòu)建成功。

2. 2 AngHV-FJ株ORF87基因生物信息學分析結(jié)果

BLAST比對分析結(jié)果表明，AngHV-FJ株ORF87基因序列與AngHV-1株ORF87基因序列（NC_013668）的相似性為99.72%，其堿基突變發(fā)生在ORF87基因第43、56、57和84 bp處（圖2），對應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列變化分別為L?I、V?E和C?W。Softberry預(yù)測結(jié)果表明，在ORF87基因起始密碼子上游第61和101 bp處分別存在2個基因轉(zhuǎn)錄啟動子（CATTCA和TTCACA），在終止密碼子TGA下游38 bp處存在轉(zhuǎn)錄因子ihf的潛在結(jié)合位點，其序列為TGTAAGAA;在下游第96 bp處存在poly（A）尾，其序列為AATAA AAA。

ProtParam預(yù)測結(jié)果顯示，AngHV-FJ株ORF87基因編碼蛋白分子量為80.1 kD，理論等電點（pI）為7.62，屬于弱堿性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)為42.38，總平均親水性為-0.271，為非常不穩(wěn)定的親水性蛋白。CDD預(yù)測結(jié)果顯示，ORF87蛋白在氨基酸序列第135～330位和第442～608位存在蛋白激酶C超家族（PKC-like superfamily）的保守結(jié)構(gòu)域，故推測其具有Serine/threonine蛋白激酶活性。ORF87蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽結(jié)構(gòu)，其亞細胞定位可能位于細胞核和細胞質(zhì)膜（圖3）。BepiPred預(yù)測結(jié)果（表1）顯示，ORF87蛋白存在19個潛在B細胞抗原表位，即具有良好的免疫原性。

2. 3 融合蛋白ORF87表達情況

重組質(zhì)粒pMD19-ORF87經(jīng)Hind III/Xho I雙酶切后，與pET-32a表達載體連接，構(gòu)建獲得的原核表達質(zhì)粒以Hind III/Xho I雙酶切進行驗證，結(jié)果獲得約2100 bp的特異性條帶（圖4），表明成功構(gòu)建獲得原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87。以原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果（圖5-A）顯示，與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白相比，含pET-32a表達載體的誘導(dǎo)菌體在20.0 kD處有明顯的蛋白條帶，而含原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87的誘導(dǎo)菌體在約100.0 kD處有明顯的蛋白條帶。Western blotting鑒定結(jié)果（圖5-B）表明，含pET-32a表達載體的誘導(dǎo)菌體可被His-Tag單克隆抗體檢測到20.0 kD的蛋白條帶，而含原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87的誘導(dǎo)菌體可被His-Tag單克隆抗體檢測到約100.0 kD的蛋白條帶，說明誘導(dǎo)表達獲得的融合蛋白ORF87與預(yù)期結(jié)果一致，即成功實現(xiàn)AngHV-FJ株ORF87基因在BL21（DE3）感受態(tài)細胞中的融合表達。

2. 4 融合蛋白ORF87純化結(jié)果

SDS-PAGE檢測結(jié)果（圖6-A）顯示，融合蛋白ORF87在BL21（DE3）感受態(tài)細胞中的表達主要以包涵體形式存在。以切膠后純化方式收集誘導(dǎo)表達的融合蛋白條帶，回收的融合蛋白進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果（圖6-B）顯示，回收獲得的融合蛋白與ORF87蛋白大小一致，表明成功獲得高純度的融合蛋白ORF87。

2. 5 兔抗ORF87多克隆抗體制備

以純化融合蛋白ORF87免疫新西蘭大白兔制備ORF87多克隆抗體（兔抗ORF87血清），ELISA檢測結(jié)果顯示其抗體效價為1∶16000。進一步利用制備獲得的ORF87多克隆抗體對AngHV-FJ株感染的EO細胞進行Western blotting鑒定，結(jié)果（圖7）顯示，感染AngHV-FJ株的EO細胞出現(xiàn)約100.0 kD的特異性條帶，而正常EO細胞未出現(xiàn)對應(yīng)的條帶，表明備獲得的ORF87多克隆抗體能特異性識別AngHV的ORF87蛋白。

3 討論

脫黏敗血綜合征是危害我國養(yǎng)殖歐洲鰻鱺和美洲鰻鱺的主要傳染病，自鰻鱺規(guī)?；B(yǎng)殖以來就有發(fā)生，給鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失（楊金先等，2020）。本課題組的前期研究結(jié)果表明，AngHV是脫黏敗血綜合征的致病性病原（陳強等，2021），且具有高度的宿主細胞侵染專一性，僅在鰻鱺源細胞系內(nèi)增殖及穩(wěn)定傳代，非鰻鱺來源的細胞系均不支持AngHV的復(fù)制與增殖（楊金先等，2020），與鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）和錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）相似（Hanson et al.，2011;馬杰等，2016）。由于皰疹病毒的宿主嗜性依賴于病毒與細胞間的相互作用，而病毒編碼的蛋白激酶在此過程中發(fā)揮重要作用（Prichard，2009;Lee and Chen，2010;南星羽等，2021）。因此，闡明AngHV的宿主侵染機理則賴于對AngHV編碼蛋白激酶的深入研究。

本研究通過克隆AngHV-FJ株ORF87基因，并進行生物信息學分析，結(jié)果顯示，AngHV-FJ株ORF87基因與GenBank已發(fā)布的參考序列高度同源（相似性為99.72%），僅存在4個堿基突變，其編碼蛋白不具信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，可能在細胞核或細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，與PSORT的亞細胞定位預(yù)測結(jié)果一致。此外，ORF87蛋白具有PKC-like Superfamily蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，與已發(fā)現(xiàn)的皰疹病毒蛋白激酶結(jié)構(gòu)特征（Marschall et al.，2011;Milbradt et al.，2018）一致。此類磷酸蛋白激酶在皰疹病毒中廣泛存在，其主要功能是對病毒和宿主細胞的底物進行磷酸化，進而影響病毒DNA復(fù)制、病毒粒子組裝及出芽等（Li et al.，2012;Chang et al.，2015）。本研究在成功克隆獲得AngHV-FJ株ORF87基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-32a-ORF87，通過在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達可獲得高純度的融合蛋白ORF87，然后以純化的融合蛋白ORF87免疫新西蘭大白兔制備ORF87多克隆抗體，ELISA檢測顯示其抗體效價為1∶16000，具有高效價，可特異性識別AngHV感染EO細胞，識別蛋白約100.0 kD，遠高于預(yù)期的蛋白分子量（80.0 kD），故推測ORF87基因存在翻譯后修飾，但具體原理有待進一步探究。在后續(xù)研究中，可利用制備獲得的ORF87多克隆抗體，通過亞細胞定位分析及互作蛋白篩選等深入解析ORF87基因在AngHV侵染過程中的作用。

4 結(jié)論

經(jīng)原核表達載體誘導(dǎo)表達獲得的AngHV-FJ株源融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性，以其免疫新西蘭大白兔制備獲得的ORF87多克隆抗體具有高效價，能特異性識別AngHV感染，可作為亞細胞定位及表達時相分析等蛋白特性研究的工具，用于解析ORF87基因在AngHV侵染過程中的作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）