多殺性巴氏桿菌與禽白血病病毒亞群混合感染診斷及相關(guān)基因分析

羅東還　吳強　溫貴蘭　胡璇　張小波　文明　歐德淵　龔新勇

摘要：【目的】明確引起貴州某規(guī)?；?0萬羽）養(yǎng)殖場三黃雞群發(fā)病的病因及科學(xué)用藥，最大限度減輕經(jīng)濟損失，同時為規(guī)?；B(yǎng)殖場防控禽白血病和凈化雞群提供參考依據(jù)?！痉椒ā繜o菌采集送檢病雞的心臟、肝臟和脾臟等組織進行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗、莢膜分型、毒力基因和耐藥基因等分子生物學(xué)檢測，同時對采集病料進行禽白血病病毒（ALV）PCR檢測及gp85基因克隆測序分析?！窘Y(jié)果】成功分離獲得1株多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm），命名為Pm-GZXF2021;Pm-GZXF2021為莢膜A型Pm，具有黏附素（ptfA、hsf-1、hsf-2、pfhA、fimA和tadD）、超氧化物歧化酶（sodA）、外膜蛋白（ompA、ompH、plpB和oma87）和鐵攝?。╡xbB、exbD、tonB、Fur、hgbB和hgbA）相關(guān)的毒力基因，同時攜帶有喹諾酮類的gyrB耐藥基因和內(nèi)酰胺類的tem耐藥基因;藥敏試驗結(jié)果表明，Pm-GZXF2021對米諾環(huán)素、丁胺卡那、哌拉西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星、新霉素、頭孢拉定、麥迪霉素及頭孢哌酮等藥物敏感，而對頭孢他啶、苯唑西林、羧芐西林及頭孢曲松等藥物已產(chǎn)生耐藥性;健康昆明小鼠在接種Pm-GZXF2021純培養(yǎng)菌液（1.7×108 CFU/mL）后12 h內(nèi)全部死亡，剖檢可見昆明小鼠小腸均出現(xiàn)膠凍樣浸潤，肝臟腫大且伴有白色壞死灶。從病雞的組織樣品檢測出ALV，命名為ALV-GZXF2021;由基于gp85基因核苷酸序列相似性構(gòu)建的ALV系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，ALV-GZXF2021與5株ALV-K參考毒株處于同一分支，與A、B、D、E、J亞群處于不同分支，即ALV-GZXF2021屬于K亞群?！窘Y(jié)論】貴州某規(guī)模化養(yǎng)殖場三黃雞群發(fā)病是由Pm與K亞群外源性ALV混合感染所致。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)采取相應(yīng)的防控措施，一般包括加強飼養(yǎng)管理，做好生物安全措施及疫苗接種等，尤其是建立無禽白血病的種雞群。

關(guān)鍵詞： 多殺性巴氏桿菌（Pm）;禽白血病病毒（ALV）;K亞群;混合感染;基因分析

中圖分類號： S858.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0526-12

Diagnosis and gene analysis of mixed infection of Pasteurella multocida and avian leukemia virus-K subgroup

LUO Dong-huan WU Qiang WEN Gui-lan HU Xuan ZHANG Xiao-bo WEN Ming OU De-yuan GONG Xin-yong

（1College of Animal Science， Guizhou University/ Guizhou Animal Biological Products Engineering Technology Research Center， Guiyang? 550025， China; 2Sinan Agriculture and Rural Bureau， Tongren， Guizhou? 565100， China）

Abstract：【Objective】To clarify the etiology of Sanhuang chickens in a large-scale （200000 feather） breeding farm in Guizhou， scientifically used medicine to minimize economic loss， and provide reference for prevention and control of avian leukemia and purification of chickens in large-scale breeding farms. 【Method】The heart， liver and spleen tissues of chickens were collected aseptically for bacterial isolation and identification， biochemical test， capsule typing， virulence gene and drug resistance gene detection， avian leukemia virus（ALV） PCR detection， gp85 gene cloning and sequencing analysis， etc. 【Result】A Pasteurella multocida（Pm） strain was isolated and named as Pm-GZXF2021. Pm-GZXF2021 was type A capsulatus of Pm with the associated virulence genes of adhesin（ptfA， hsf-1， hsf-2， pfhA， fimA and tadD）， superoxide dismutase（sodA）， outer membrane protein（ompA， ompH， plpB and oma87） and iron uptake（exbB， exbD， tonB， Fur， hgbB and hgbA）. Meanwhile， the isolate strain carried a gyrB resistance gene for quinolones and a tem resistance gene for lactamides. Drug sensitivity test showed that Pm-GZXF2021 was sensitive to minocycline， mikacin， pipe-racillin， gentamicin， doxycycline， levofloxacin， neomycin， cefradine， medicin and cefoperazone， but resistant to ceftazidime， oxacillin， carbenicillin and ceftriaxone sodium. In addition， all healthy Kunming mice died within 12 h after inoculation with Pm-GZXF2021 pure culture broth （1.7×108 CFU/mL）. By necropsy， the small intestine of Kunming mice showed jelly infiltration， and the liver was enlarged with white necrosis. ALV was detected from tissue samples of sick chickens and named ALV-GZXF2021. The ALV phylogenetic tree constructed based on the nucleotide sequence similarity of the gp85 gene showed that ALV-GZXF2021 was in the same branch as the five ALV-K reference strains and was in different branches with subgroups A， B， D， E， and J. In other words， ALV-GZXF2021 belonged to ALV-K. 【Conclusion】The incidence of Sanhuang chicken group in a large-scale farm in Guizhou is caused by exogenous ALV infection of Pm and K subgroups. Therefore， the farm should take corresponding prevention and control measures， generally including strengthening feeding management， biosafety measures and vaccination， especially the establishment of breeding chickens without avian leukemia.

Key words： Pasteurella multocida（Pm）; avian leucosis virus（ALV）; K subgroup; mixed infection; genetic analysis

Foundation items： Guizhou Science and Technology Support Project （QKHZC〔2021〕General 164）; Guizhou Provincial Agricultural Science and Technology Support Project（QKHZC〔2019〕2286）; Reform Project of Teaching Content and Curriculum System in Higher Education Institutions of Guizhou （GZJG20200035）

0 引言

【研究意義】多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）兩端鈍圓、中央微突，呈短桿狀或球桿狀，有莢膜、無鞭毛、不形成芽孢，可導(dǎo)致多種動物發(fā)病，發(fā)生在雞、鴨等禽類上又稱為禽霍亂（唐沙等，2017;陶婭等，2019;陳國權(quán)等，2020）。該病傳染性強，發(fā)病率和死亡率極高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的常見疾病之一（李繼成，2018;黃萃等，2019;劉杰等，2019）。禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一種腫瘤性疾病，ALV感染時會顯著降低疫苗的免疫效果，造成雞群無法有效抵抗其他病毒感染而繼發(fā)相關(guān)疾病，對家禽養(yǎng)殖危害極大（張民秀等，2021）。Pm和ALV是家禽養(yǎng)殖業(yè)中常見的病原微生物，二者發(fā)生混合感染的危害遠(yuǎn)比單一病原體導(dǎo)致的危害更嚴(yán)重。此外，引起雞群發(fā)病的病原微生物眾多，彼此間常發(fā)生混合感染，導(dǎo)致雞群大批量死亡或蛋雞產(chǎn)蛋量下降等，給養(yǎng)殖場帶來重大的經(jīng)濟損失。因此，開展相應(yīng)的病原學(xué)檢查及相關(guān)基因分析，對確保養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Pm屬于條件性致病菌，可在某些健康家禽的呼吸道中常年存在，在應(yīng)激反應(yīng)、營養(yǎng)不良及其他疾病等因素的作用下，導(dǎo)致機體抵抗力下降而發(fā)?。ǔ鸸鹆岬龋?021）。ALV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)病毒囊膜糖蛋白抗原特異性、病毒干擾模式及宿主范圍的不同將其分為A～K等11個亞群，從雞群中分離獲得的有A～E、J、K亞群，其中E亞群為內(nèi)源性病毒，致病性弱或無致病性，其余亞群則為外源性病毒（葛成等，2020）。K亞群是近年新發(fā)現(xiàn)的一種外源性ALV亞群，主要存在于我國地方雞群中，具有病毒增殖慢、感染范圍廣的特點，是我國地方雞群的主要防控對象之一（王呈呈，2021）。禽霍亂發(fā)病急，死亡率高，且在全球大部分地區(qū)呈地方性流行（蔡芳華，2021;尹廣，2021;尹家珍和于泓，2021），一旦暴發(fā)即導(dǎo)致雞群大批量死亡。禽白血病潛伏期較長，以免疫抑制、生長遲緩和多器官組織出現(xiàn)腫瘤為主要臨床特征，也可引起蛋雞的產(chǎn)蛋率和孵化率下降;同時禽白血病的臨床診斷較困難，目前尚無特效治療藥物，且易與其他細(xì)菌病或病毒病發(fā)生混合感染，對養(yǎng)雞業(yè)危害極大（蔡景明，2020;馮嶺等，2020;楊榮坤等，2020;鄒敏妮等，2020）。若禽霍亂與禽白血病發(fā)生混合感染，會導(dǎo)致雞群極高的死亡率（李迎曉等，2015）。因此，快速診斷和科學(xué)防療這2種疾病對確保我國禽類養(yǎng)殖的健康發(fā)展至關(guān)重要。近年來，關(guān)于細(xì)菌與病毒混合感染的病例時有報道，如常見商品肉雞中的J亞群ALV與科氏葡萄球菌及腸炎沙門氏菌混合感染，雞法氏囊病毒與沙門氏菌混合感染等（范志為等，2021）;以及國外報道的副雞嗜血桿菌和禽腺病毒在蛋雞中并發(fā)感染、雞沙門氏菌與禽流感病毒的共感染等（Arafat et al.，2020;Mei et al.，2020）。細(xì)菌與病毒混合感染會極大提高雞群的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展?！颈狙芯壳腥朦c】貴州某規(guī)模化（20萬羽）養(yǎng)殖場于2021年7月5日開始出現(xiàn)雞群發(fā)病，之后每天死亡200羽左右，截止7月9日已累計死亡800羽，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟質(zhì)地變脆，且表面有針尖狀的灰白色壞死點。發(fā)病期間曾使用新霉素和卡那霉素進行治療，但用藥后病情又反復(fù)發(fā)作，因此亟待明確引起該養(yǎng)殖場雞群發(fā)病的病因，并科學(xué)用藥以減輕經(jīng)濟損失?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對送檢的死亡蛋雞進行細(xì)菌分離鑒定，以確定該養(yǎng)殖場是否達到國家規(guī)定的禽白血病凈化要求，同時對采集病料進行ALV核酸檢測及gp85基因克隆測序分析，為規(guī)模化養(yǎng)殖場防控禽白血病和凈化雞群提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 病料及試驗動物

78日齡的患病三黃雞來源于貴州某規(guī)?；B(yǎng)殖場。該養(yǎng)殖場于2021年7月5日開始出現(xiàn)雞群發(fā)病，每天死亡200羽左右，至7月9日已累計死亡800羽，發(fā)病期間養(yǎng)殖場曾使用新霉素和卡那霉素進行治療，但用藥后雞群病情又反復(fù)發(fā)作;臨床觀察雞群存在發(fā)熱、咳嗽及精神萎靡等癥狀;同時該養(yǎng)殖場已免疫禽流感H5、禽流感H7和新城疫等。致病性試驗所用昆明小鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)。

1. 2 主要試劑及培養(yǎng)基

2×Taq PCR Master Mix、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T載體及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;細(xì)菌微量生化鑒定管、抗生素藥敏紙片及革蘭氏染液購自杭州微生物試劑有限公司;瑞氏染液、DL2000 DNA Marker及配制培養(yǎng)基所需的胰蛋白胨和瓊脂等購自北京索萊寶科技有限公司。

1. 3 病理剖檢

剖檢患病雞，觀察其病理變化，無菌采集心臟、肝臟和脾臟等組織。

1. 4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌挑取送檢病雞的心臟、肝臟和脾臟，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)8～16 h后無菌挑取單個菌落劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)8～16 h。對純化后的分離菌株進行革蘭染色和瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的染色特性及形態(tài)特征;同時從LB固體培養(yǎng)基上再次挑取單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37 ℃下?lián)u床（170 r/min）培養(yǎng)16 h。

1. 5 細(xì)菌鑒定

1. 5. 1 細(xì)菌16S rRNA序列分析 以純化的菌液為模板進行PCR擴增，16S rRNA通用引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反應(yīng)體系40.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 20.0 μL，DNA模板（菌液）4.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，ddH2O 12.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，預(yù)擴增片段大小1450 bp。PCR擴增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中的已有序列進行BLAST比對。

1. 5. 2 細(xì)菌生化鑒定 按照細(xì)菌微量生化鑒定管使用說明，將純化的菌株分別接種至各細(xì)菌微量生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)14～20 h，觀察并根據(jù)使用說明判定反應(yīng)結(jié)果。

1. 5. 3 莢膜分型鑒定 根據(jù)李偉杰等（2020）的方法，合成鑒定莢膜血清型分型的引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及擴增程序同1.5.1，退火溫度參考表1。PCR擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 6 毒力基因和耐藥基因檢測

根據(jù)文獻（Khamesipour et al.，2014;Shirzad Aski and Tabatabaei，2016）合成鑒定巴氏桿菌毒力基因的引物（表2）;并依據(jù)金彪等（2013）、楊慧君等（2018）、曹冶等（2020）、馮濤等（2020）、張召興等（2019）、李海利等（2020，2021）的方法設(shè)計引物（表3）進行耐藥基因檢測。PCR反應(yīng)體系及擴增程序同1.5.1，退火溫度分別參考表2和表3。PCR擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 7 藥敏試驗

選取常用藥敏紙片通過K-B法測定分離菌株的藥物敏感性，取100.0 μL純化培養(yǎng)菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，再貼入細(xì)菌藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18～20 h后測量抑菌圈直徑并做好記錄，參照WS/T 125—1999《紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)》進行判定。

1. 8 致病性試驗

將試驗昆明小鼠分為2組，每組5只。試驗組每只昆明小鼠腹腔注射0.3 mL純培養(yǎng)菌液（1.7×108 CFU/mL），對照組注射0.3 mL滅菌PBS，注射后觀察昆明小鼠狀態(tài)。若試驗組昆明小鼠出現(xiàn)死亡，則進行剖檢并從肝臟中再次分離細(xì)菌。

1. 9 ALV檢測及亞群鑒定

1. 9. 1 病毒核酸提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNA提取試劑盒說明，從采集的組織樣品中提取總RNA，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。

1. 9. 2 PCR檢測 根據(jù)梁雄燕（2018）的方法合成檢測ALV的env基因引物（F：5'-GACTAAGAAAG ATGAGGCGAGCC-3'，R：5'-CAACCCAGGTGCA CACCAATG-3'），預(yù)擴增片段大小為2.2～2.5 kb。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系及擴增程序同1.5.1，退火溫度為56 ℃。PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中的已有序列進行BLAST比對。

1. 9. 3 ALV亞群鑒定 根據(jù)袁麗霞等（2017）的方法合成鑒定ALV亞群的gp85基因引物。上游引物為5'-CGGGATCCATGCACTTACTCGAGCAGCCA GG-3'，下游引物為5'-ACGCGTCGACTTAGGTGC TTCGTTTACGTCTCATACC-3'，預(yù)擴增片段約1005 bp。PCR反應(yīng)體系及擴增程序同1.5.1，退火溫度為59 ℃。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行膠回收;然后與pMD19-T載體連接，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后涂布接種于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落進行增菌培養(yǎng)，12 h后通過菌液PCR篩選出克隆成功的陽性菌液。將陽性克隆質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據(jù)分離毒株的gp85基因序列確定其亞群類型。

1. 9. 4 gp85基因遺傳進化分析 將克隆獲得的基因序列拼接后進行BLAST比對，運用DNAStar將分離毒株的gp85基因序列分別與GenBank中已有的不同亞群ALV代表株進行相似性比對，并以MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病理剖檢結(jié)果

臨床觀察發(fā)現(xiàn)雞群存在發(fā)熱、咳嗽等癥狀。剖檢可見肝臟有灰白色壞死點，伴有淺黃色滲出物;心臟黃色偽膜;脾臟腫大，有灰白色壞死點（圖1）。

2. 2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色結(jié)果

挑取純培養(yǎng)菌株進行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢可見革蘭氏染色呈陰性的短小桿菌，單個或成對存在（圖2-A）;瑞氏染色表現(xiàn)為兩極濃染的短小桿菌（圖2-B）。

2. 3 分離菌株16S rRNA序列分析結(jié)果

以通用引物27F/1492R擴增分離菌株16S rRNA序列，結(jié)果在1450 bp附近出現(xiàn)特異性擴增條帶（圖3），擴增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序得知，分離菌株16S rRNA序列長1443 bp，與GenBank中的已有序列進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與Pm的相似性均在99%以上，證實分離得到的菌株為Pm，命名為Pm-GZXF2021。

2. 4 分離菌株生化鑒定結(jié)果

由表4可知，Pm-GZXF2021能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、水楊素、山梨醇和甘露醇，以及分解乳糖、鳥氨酸和氨基酸，符合Pm的基本生化特征。

2. 5 分離菌株莢膜分型鑒定結(jié)果

PCR擴增結(jié)果（圖4）顯示，約在1048 bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶，與引物capA的預(yù)期擴增結(jié)果相符，因此判定Pm-GZXF2021為莢膜A型Pm。

2. 6 分離菌株毒力基因及耐藥基因檢測結(jié)果

毒力基因檢測結(jié)果（圖5）顯示，Pm-GZXF2021具有黏附素（ptfA、hsf-1、hsf-2、pfhA、fimA和tadD）、超氧化物歧化酶（sodA）、外膜蛋白（ompA、ompH、plpB和oma87）和鐵攝取（exbB、exbD、tonB、Fur、hgbB和hgbA）相關(guān)的毒力基因;耐藥基因檢測結(jié)果（圖6）顯示，Pm-GZXF2021攜帶有g(shù)yrB和tem耐藥基因。

2. 7 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果（表5）顯示，Pm-GZXF2021對米諾環(huán)素、丁胺卡那、哌拉西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星、新霉素、頭孢拉定、麥迪霉素及頭孢哌酮等藥物敏感，而對頭孢他啶、苯唑西林、羧芐西林及頭孢曲松等藥物已產(chǎn)生耐藥性。

2. 8 分離菌株致病性試驗結(jié)果

昆明小鼠在接種Pm-GZXF2021純培養(yǎng)菌液后12 h內(nèi)全部死亡，剖檢可見昆明小鼠小腸出現(xiàn)膠凍樣浸潤，肝臟腫大且伴有白色壞死灶（圖7）。用接種環(huán)從死亡昆明小鼠的肝臟取樣進行細(xì)菌分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定均回收得到與Pm-GZXF2021一致的菌株。

2. 9 ALV的PCR檢測結(jié)果

以合成的cDNA為模板對ALV的env基因進行PCR擴增，結(jié)果（圖8）獲得約2300 bp的目的條帶。經(jīng)測序得知，PCR擴增獲得的目的條帶長2305 bp，將其與GenBank中的已有序列進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與ALV的相似性均在99%以上，可鑒定分離毒株即為ALV，命名為ALV-GZXF2021。

2. 10 ALV-GZXF2021亞群鑒定及gp85基因克隆結(jié)果

分離毒株的gp85基因PCR擴增電泳結(jié)果顯示，在約1005 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶（圖9），與預(yù)期結(jié)果相符?；厥誔CR擴增產(chǎn)物進行T-A克隆，菌液PCR鑒定結(jié)果也顯示克隆成功;將測序獲得的gp85基因序列與GenBank中的已有序列進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)其與ALV-K亞群代表株的相似性均在99%以上，綜合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖10），證實ALV-GZXF2021即為K亞群ALV。

3 討論

Pm是一種宿主廣泛的病原體，能引起多種家畜、野生動物及人類和靈長類動物感染發(fā)?。ㄍ跸驳龋?021）。Pm可引起反芻動物的出血性敗血癥、豬的傳染性萎縮性鼻炎、牛的呼吸道疾病，以及禽類的禽霍亂等（尹媛媛等，2021）。其中，禽霍亂可發(fā)生在各年齡階段的雞群中，且發(fā)病率和死亡率均較高（朱善歡和張麗華，2014;秦曉冰，2019），對養(yǎng)禽業(yè)的危害極大。對于禽霍亂，藥物治療和預(yù)防有明顯效果，良好的飼養(yǎng)管理和嚴(yán)格的衛(wèi)生消毒制度也有助于降低其發(fā)病率，但目前主要依賴于疫苗接種（郝大春，2013）。禽白血病易導(dǎo)致動物機體免疫力下降，引發(fā)多重感染（廖卓鋒等，2019），是養(yǎng)禽業(yè)中的常見疾病之一。ALV可垂直傳播，導(dǎo)致雞群長期處于帶毒感染（崔治中等，2009）。在ALV的各亞群中，以ALV-K亞群的復(fù)制能力較弱，蛋白表達水平較低力，但自2012年被發(fā)現(xiàn)以來，在國內(nèi)雞群中感染的報道逐年增多，且易與其他亞群ALV混合感染（殷方芝等，2011）。目前，針對禽白血病尚缺乏有效的治療方法，其主要防控措施是對雞群進行凈化，培育無外源性ALV感染的雞群（莊長楠等，2019;陳子召和羅海燕，2020;胡璇等，2021）。國內(nèi)關(guān)于禽白血病與細(xì)菌性疾病混合感染的案例時有報道，其中以消化道細(xì)菌的混合感染最常見（黃建強，2013;常超越等，2018;王寶劍等，2018）。

本研究通過對分離菌株耐藥基因的檢測，發(fā)現(xiàn)Pm-GZXF2021攜帶有喹諾酮類的gyrB耐藥基因和內(nèi)酰胺類的tem耐藥基因;其藥敏試驗結(jié)果也顯示對頭孢他啶、苯唑西林、羧芐西林及頭孢曲松等藥物已產(chǎn)生耐藥性;昆明小鼠致病性試驗證實Pm-GZXF2021具有較強的致病性，攜帶有黏附素（ptfA、hsf-1、hsf-2、pfhA、fimA和tadD）、超氧化物歧化酶（sodA）、外膜蛋白（ompA、ompH、plpB和oma87）和鐵攝?。╡xbB、exbD、tonB、Fur、hgbB和hgbA）相關(guān)的毒力基因。此外，莢膜分型鑒定及生化特性鑒定結(jié)果等均對后續(xù)進一步研究Pm具有重要參考價值。本研究的ALV-GZXF2021亞群鑒定結(jié)果表明存在ALV-K亞群感染，通過基于gp85基因核苷酸序列相似性構(gòu)建的ALV系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，ALV可分為以J亞群AHaq02 KF534753.1和K亞群GDFX0603 KP686144.1為代表的兩大分支，ALV-GZXF2021與5株ALV-K參考毒株處于同一分支，與A、B、D、E、J亞群處于不同分支，即ALV-GZXF2021屬于K亞群。綜合上述診斷結(jié)果，可判定貴州某規(guī)?；?0萬羽）養(yǎng)殖場雞群發(fā)病是由Pm與K亞群外源性ALV混合感染所致。禽霍亂會導(dǎo)致雞群大量死亡，而禽白血病造成感染雞群發(fā)生免疫抑制、生長抑制等，二者混合感染給養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟損失。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)采取相應(yīng)的防控措施，一般包括加強飼養(yǎng)管理，做好生物安全措施及疫苗接種等。此外，防控禽白血病最重要的是實現(xiàn)雞群凈化，建立無禽白血病的種雞群。

4 結(jié)論

貴州某規(guī)?；B(yǎng)殖場三黃雞群發(fā)病是由Pm與K亞群外源性ALV混合感染所致。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)采取相應(yīng)的防控措施，一般包括加強飼養(yǎng)管理，做好生物安全措施及疫苗接種等，尤其是建立無禽白血病的種雞群。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）