育成期高能飼喂下開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞肝臟miRNA表達(dá)譜差異分析

王星果　王克華　盧建　馬猛　竇套存　郭軍　胡玉萍　曲亮

王星果（1984-），博士，副研究員，入選江蘇省第六期“333高層次人才培養(yǎng)工程”第三層次培養(yǎng)對(duì)象、揚(yáng)州市第五期“英才培育計(jì)劃”優(yōu)秀鄉(xiāng)村振興人才培育對(duì)象，主要從事蛋雞遺傳育種及脂質(zhì)代謝研究工作。先后主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目及揚(yáng)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目各1項(xiàng)，作為主要成員參與國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、江蘇省自然科學(xué)基金、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)、江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制等科研項(xiàng)目20余項(xiàng)。獲神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，申請(qǐng)或授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利10余件，培育國(guó)家級(jí)畜禽新品種（配套系）1個(gè)，制訂行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)各1項(xiàng);在《Poultry Science》《Animal》《PLoS One》《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《中國(guó)家禽》等期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。

摘要：【目的】對(duì)育成期高能飼喂下開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞的肝臟進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序分析，探明高能飲食狀態(tài)下蛋雞肝臟中影響其開(kāi)產(chǎn)的miRNA，為提高產(chǎn)蛋性能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳源x能水平為12.14 MJ/kg的高能飼糧飼喂育成期蛋雞，通過(guò)Illumina NextSeq500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞肝臟進(jìn)行small RNA測(cè)序，使用DESeq分析miRNA表達(dá)量，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證;采用miRanda對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因和靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，同時(shí)以超幾何分布對(duì)差異表達(dá)的靶基因進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析?！窘Y(jié)果】6個(gè)樣本（3個(gè)開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本，3個(gè)未開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本）能注釋到的miRNA均超過(guò)300個(gè)，約占miRBase中已鑒定雞miRNA的30.00%，且前體鑒定結(jié)果顯示各樣本注釋到的miRNA有部分定位在同一前體上。與未開(kāi)產(chǎn)組樣本相比，開(kāi)產(chǎn)組樣本有9個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)、3個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。其中，gga-miR-132c-5p、gga-miR-132b-5p、gga-miR-2184a-5p、gga-miR-132c-3p、gga-miR-132b-3p及gga-miR-2184a-3p屬于同一miRNA基因簇，且gga-miR-1682、gga-miR-132b-3p和gga-miR-2184a-3p等3個(gè)上調(diào)miRNA在未開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本中不表達(dá)。通過(guò)miRanda共預(yù)測(cè)得到129個(gè)差異表達(dá)潛在靶基因，以miR-203a預(yù)測(cè)得到的靶基因最多，為32個(gè);其次是gga-miR-2184a-5p、gga-miR-148a-5p和gga-miR-12211-5p，分別預(yù)測(cè)到30、25和23個(gè)靶基因;而miR-132c-5p預(yù)測(cè)得到的靶基因最少，僅為9個(gè)。129個(gè)靶基因顯著注釋到8條GO功能條目上，生物學(xué)過(guò)程（Biological process）主要注釋到脂質(zhì)代謝過(guò)程、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程、脂質(zhì)生物合成過(guò)程、磷脂生物合成過(guò)程、磷脂代謝過(guò)程、甘油磷脂生物合成過(guò)程和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)育，分子功能（Molecular funcion）僅注釋到1條GO功能條目，即利鈉肽受體活性，未發(fā)現(xiàn)涉及細(xì)胞組分（Cellular component）的GO功能條目;在注釋到的8條GO功能條目中有6條與脂質(zhì)代謝相關(guān)，涉及的靶基因有22個(gè)，占總潛在靶基因的17.10%。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示共顯著富集到7條KEGG信號(hào)通路，其中脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、酮體合成與降解及PPAR信號(hào)通路等4條信號(hào)通路與脂質(zhì)代謝相關(guān)?！窘Y(jié)論】育成期高能飼喂下開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞中共存在12個(gè)差異表達(dá)miRNA，涉及129個(gè)差異表達(dá)潛在靶基因，且主要富集在肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程和信號(hào)通路，說(shuō)明miRNA是通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝及其相關(guān)基因表達(dá)而影響蛋雞開(kāi)產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 蛋雞;肝臟;miRNA;育成期;高能飼糧;開(kāi)產(chǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)： S831.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0277-10

Liver miRNA profiles of laying hens before and after reaching sexual maturity with a high energy feed during

the maturation period

WANG Xing-guo， WANG Ke-hua， LU Jian， MA Meng， DOU Tao-cun，

GUO Jun， HU Yu-ping， QU Liang

（Jiangsu Institute of Poultry Science， Yangzhou， Jiangsu? 225125， China）

Abstract：【Objective】In the current study， the liver miRNA profiles of sexually immature and sexually mature la-ying hens fed with a high energy feed during the maturation period were compared to clarify which liver miRNAs in liver influenced sexual maturity with high energy feed. The study laid a foundation for improving egg production. 【Method】High-energy feed with 12.14 MJ/kg metabolic energy was used to feed laying hens during the maturation period. Liver miRNAs were detected by small RNA sequencing with the Illumina NextSeq500 platform in sexually mature（R） and sexual-ly immature （N） laying hens. miRNA expression was analyzed using the bioinformatics software DESeq and validated using qRT-PCR. Target genes and target sites of differentially expressed miRNAs were predicted by miRanda and the differentially targeted genes were analyzed for GO and KEGG enrichment using a hypergeometric distribution. 【Result】More than 300 miRNAs could be annotated in each of the 6 samples （3 R and 3 N）， accounting for about 30.00% of the identified chicken miRNAs in miRBase. The results from precursor identification showed that some annotated miRNAs in each sample were located on the same precursor. Compared with the N group， the expression levels of 9 miRNAs in the R group were up-regulated and 3 miRNAs were down-regulated， among which gga-miR-132c-5p， gga-miR-132b-5p，gga-miR-2184a-5p， gga-miR-132c-3p， gga-miR-132b-3p and gga-miR-2184a-3p were in a miRNA cluster. In addition， 3 upregulated miRNAs in the R group， including gga-miR-1682， gga-miR-132b-3p and gga-miR-2184a-3p， were not expressed in the N group. A total of 129 target genes of the differentially expressed genes were predicted by miRanda. The number of target genes predicted for gga-miR-203a was the highest（32），gga-miR-2184a-5p， gga-miR-148a-5p and gga-miR-12211-5p showed a smaller number（30， 25 and 23， respectively） and miR-132c-5p the lowest（only 9）. GO analysis of the 129 differentially targeted genes showed that there were 8 significantly enriched GO terms， including 7 biological processes： lipid metabolism， cellular lipid metabolism， lipid biosynthesis， phospholipid biosynthesis， phospholipid metabolism， glycerophospholipid biosynthesis and anatomical structure development. No cellular component terms were found and only 1 molecular function term was detected： natriuretic peptide receptor activity. In the 8 enriched GO items， 6 were related to lipid metabolism， and 22 target genes were involved， accounting for 17.10% of the 129 genes. KEGG analysis showed that there were 7 significant enriched KEGG terms， of which fatty acid degradation， fatty acid biosynthesis， synthesis and degradation of ketone bodies and PPAR signaling pathway were related to lipid metabolism. 【Conclusion】A total of 12 miRNAs are differentially expressed between sexually immature and sexually mature laying hens under a high energy feeding regime during the maturation period， involving 129 potential differentially expressed genes， which are mainly enriched in processes and pathways related to lipid metabolism in the liver. The data suggests that miRNAs affect sexual maturity of laying hens by regulating lipid metabolism and related genes.

Key words： laying hen; liver; miRNA; growing period; high energy feed; reaching sexual maturity

Foundation items： Agricultural Major New Breed Creation of Jiangsu Province （PZCZ201729）; Recruit of Seed Industry Revitalization of Jiangsu Province （JBGS〔2021〕104）; Special Construction of China Agriculture Research System （CARS-40-K01）; Science and Technology Project of Yangzhou （YZ2021030）

0 引言

【研究意義】我國(guó)蛋雞業(yè)正在從數(shù)量增長(zhǎng)模式向質(zhì)量提升模式轉(zhuǎn)變，亟待對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能進(jìn)一步改善，而開(kāi)展育成期蛋雞高能飼喂是提高其生產(chǎn)性能的有效措施（李永峰，2017;李娜等，2019）。肝臟是重要的能量代謝器官，且與產(chǎn)蛋性能有密切關(guān)系（李紅，2016）。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的一種小分子調(diào)控物質(zhì)，長(zhǎng)度18～24 nt，無(wú)蛋白編碼潛能，但可通過(guò)靶向調(diào)控功能基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控各種生物過(guò)程（李崇奇等，2014;謝冬微和孫健，2020;閆尊強(qiáng)等，2020），包括肌肉細(xì)胞的增殖與分化、骨骼肌發(fā)育階段肌纖維增殖及轉(zhuǎn)換等（孫瑞萍等，2020）。因此，對(duì)育成期高能飼喂的開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞肝臟進(jìn)行miRNA及其靶基因分析，可為了解影響蛋雞開(kāi)產(chǎn)的miRNA及通過(guò)調(diào)控開(kāi)產(chǎn)相關(guān)miRNA靶向調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋相關(guān)功能基因的表達(dá)打下基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】在影響蛋雞生產(chǎn)性能的因素中以營(yíng)養(yǎng)水平最重要，直接與養(yǎng)殖效益掛鉤（李飛翔等，2017），可從蛋白（Schutte and van Weerden，1978）、維生素（趙振福和曲長(zhǎng)海，2009）、能量水平（費(fèi)強(qiáng)，2013）及礦物質(zhì)（姚俊峰等，2016）等方面進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，其中能量水平調(diào)控越來(lái)越受到人們的重視（張利敏等，2012;張曉怡等，2019;方書(shū)寶等，2020;于小飛，2020）。育成期蛋雞能量調(diào)控是進(jìn)行產(chǎn)蛋性能研究的主要方向，但基本都是對(duì)調(diào)控后蛋雞的表觀特征進(jìn)行闡述，在使用不同能量飼料飼喂育成蛋雞的研究中發(fā)現(xiàn)高能飼喂能顯著提高其體重、體尺、產(chǎn)蛋率和屠宰性能（張李俊等，2005;袁超等，2013;鄭瑞等，2017）。肝臟在雞、鴨等家禽中是物質(zhì)代謝特別是脂質(zhì)代謝的主要器官，對(duì)育成期的能量調(diào)控起關(guān)鍵作用（劉振，2016）;此外，由于雞蛋中30%的卵黃由脂質(zhì)構(gòu)成，而這些脂質(zhì)均來(lái)源于肝臟（張金偉，2009），因此肝臟脂質(zhì)代謝的快慢直接影響雞蛋卵黃形成的速度，進(jìn)而影響產(chǎn)蛋率，即產(chǎn)蛋性能與肝臟存在十分密切的關(guān)系。miRNA是一類(lèi)廣泛的生物調(diào)控分子，有關(guān)雞肝臟miRNA表達(dá)譜已有較多研究報(bào)道，包括生長(zhǎng)激素處理雞肝臟miRNA表達(dá)譜（Wang et al.，2014）、雞產(chǎn)蛋高峰前后肝臟miRNA表達(dá)譜（Li et al.，2016）、育成期高能飼喂蛋雞肝臟miRNA表達(dá)譜（王星果等，2021）等，且這些研究均發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)miRNA參與代謝過(guò)程，可能具有重要的生物功能。至今，關(guān)于雞肝臟miRNA的生物功能也有部分研究報(bào)道，如miR-122、miR-33、miR-223等對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝起調(diào)控作用，且均通過(guò)對(duì)FABP5、P4HA1、FTO和DAGLA等靶基因表達(dá)的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)（Wang et al.，2015，2019，2021;Shao et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在育成期高能飼喂蛋雞肝臟miRNA表達(dá)譜研究中已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)參與能量調(diào)控的miRNA，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組信息聯(lián)合分析，證實(shí)這些miRNA是通過(guò)調(diào)控免疫和脂質(zhì)代謝過(guò)程而影響蛋雞后期產(chǎn)蛋性能（王星果等，2020，2021）。然而，在高能飼喂情況下蛋雞只仍然有開(kāi)產(chǎn)早晚之分，因此有必要對(duì)其肝臟miRNA進(jìn)行全面比較分析，進(jìn)一步挖掘影響蛋雞開(kāi)產(chǎn)的miRNA。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取高能飼喂育成期蛋雞，并對(duì)開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞的肝臟進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序分析，旨在探明高能飲食狀態(tài)下蛋雞肝臟中影響其開(kāi)產(chǎn)的miRNA，為提高產(chǎn)蛋性能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

選取江蘇省家禽科學(xué)研究所選育的C3蛋雞品系，1～8周齡常規(guī)飼養(yǎng)，于56日齡時(shí)挑選體重相近的母雞80羽，分成8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10羽;9～18周齡定量飼喂代謝能水平為12.14 MJ/kg的高能飼糧，18周齡后自由采食常規(guī)營(yíng)養(yǎng)水平的飼糧。整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程均參照NRC標(biāo)準(zhǔn)配制試驗(yàn)日糧，分9～18周齡和19周齡后2個(gè)階段配制，粉料飼喂。9～16周齡在育成雞舍四層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)（5羽/籠），17周齡起在產(chǎn)蛋雞舍三層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)（1羽/籠）。試驗(yàn)期間所有蛋雞均自由飲水，并執(zhí)行常規(guī)光照和免疫等管理程序。

1. 2 small RNA高通量測(cè)序

至140日齡每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取開(kāi)產(chǎn)蛋雞和未開(kāi)產(chǎn)蛋雞各1羽，稱(chēng)重后分別選取最接近平均值的3羽蛋雞，屠宰后取其肝臟，放入液氮中保存。TRIzol法提取肝臟總RNA，以Agilent 2100毛細(xì)管電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量;采用Illumina的TruSeq小RNA樣品準(zhǔn)備試劑盒構(gòu)建small RNA文庫(kù)，PCR擴(kuò)增富集，加上測(cè)序接頭和Index部分;經(jīng)凝膠電泳純化后使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)構(gòu)建的small RNA文庫(kù)進(jìn)行定量，然后使用Illumina NextSeq500高通量測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。

1. 3 miRNA序列分析

將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭去除和質(zhì)量過(guò)濾，得到Clean reads，對(duì)序列長(zhǎng)度在18 nt以上的Clean reads進(jìn)行去重處理后得到Unique reads，使用Bowtie程序?qū)lean reads和Unique reads與雞參考基因組進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)上的Reads進(jìn)一步分析。將上一步能比對(duì)上的Reads與miRBase中的已知miRNA成熟序列和前體序列進(jìn)行比對(duì)，再次比對(duì)上的Reads則進(jìn)行注釋?zhuān)宰⑨宮iRNA為單位統(tǒng)計(jì)表達(dá)量。剩余的Reads與雞參考基因組中其余的ncRNA（rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA）進(jìn)行比對(duì)及注釋。

對(duì)注釋到已知miRNA的Reads進(jìn)行表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用DESeq分析差異表達(dá)miRNA，按照表達(dá)量倍數(shù)差異Fold Change>2.0或Fold Change<0.5及表達(dá)差異顯著性P<0.05篩選出差異表達(dá)miRNA?；诒菊n題組前期鑒定高能飼喂?fàn)顟B(tài)下開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞肝臟差異表達(dá)基因，以開(kāi)產(chǎn)組上調(diào)miRNA對(duì)應(yīng)下調(diào)基因、下調(diào)miRNA對(duì)應(yīng)上調(diào)基因，以基因mRNA的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）為目標(biāo)序列，采用miRanda對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因和靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，同時(shí)以超幾何分布對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

1. 4 miRNA表達(dá)量驗(yàn)證

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miRNA表達(dá)量。選取上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA各2個(gè)，設(shè)計(jì)特異性反轉(zhuǎn)錄引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR正向引物（表1），實(shí)時(shí)熒光定量PCR反向引物為通用引物。取500 ng肝臟總RNA用特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再通過(guò)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。以U6 rRNA為內(nèi)參序列，經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄后使用U6 rRNA特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，并繪制熔解曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 small RNA測(cè)序質(zhì)量分析結(jié)果

各樣本經(jīng)small RNA測(cè)序得到的Raw reads見(jiàn)表2。由表2可知，6個(gè)樣本（3個(gè)開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本，3個(gè)未開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本）測(cè)得的Raw reads均在千萬(wàn)級(jí)別，且Clean reads/Raw reads比值較高，均在80.00%以上，說(shuō)明測(cè)序效果較好，序列質(zhì)量較高。開(kāi)產(chǎn)蛋雞組與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞組相比，二者的Raw reads和Clean reads數(shù)量均相當(dāng)，說(shuō)明兩組測(cè)序質(zhì)量相近。

2. 2 miRNA鑒定結(jié)果

各樣本的Clean reads和Unique reads與雞參考基因組及miRBase中的miRNA和前體比對(duì)后，進(jìn)行注釋?zhuān)玫矫總€(gè)樣本注釋到的miRNA及其前體（表3）。6個(gè)樣本能注釋到的miRNA均超過(guò)300個(gè)，約占miRBase中已鑒定雞miRNA的30.00%，且前體鑒定結(jié)果顯示各樣本注釋到的miRNA有部分定位在同一前體上。各樣本注釋到的Clean reads占所有Reads的比例均在50.00%左右。注釋到各非編碼RNA的Clean reads見(jiàn)表4，發(fā)現(xiàn)miRNA比其他幾種主要的非編碼RNA多1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。可見(jiàn)，RNA質(zhì)量較高，且所測(cè)序列以miRNA為主。

2. 3 差異表達(dá)miRNA分析結(jié)果

對(duì)開(kāi)產(chǎn)組樣本與未開(kāi)產(chǎn)組樣本鑒定獲得的miRNA進(jìn)行表達(dá)量比較分析，旨在篩選出差異表達(dá)miRNA，結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)，與未開(kāi)產(chǎn)組樣本相比，開(kāi)產(chǎn)組樣本有9個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)、3個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。其中，gga-miR-132c-5p、gga-miR-132b-5p、gga-miR-2184a-5p、gga-miR-132c-3p、gga-miR-132b-3p及gga-miR-2184a-3p屬于同一miRNA基因簇;gga-miR-132c-5p的表達(dá)差異最明顯，相差近57倍;且gga-miR-1682、gga-miR-132b-3p和gga-miR-2184a-3p在未開(kāi)產(chǎn)組未檢測(cè)出，究其原因可能是在開(kāi)產(chǎn)蛋雞中具有特殊作用。挑選部分差異表達(dá)miRNA（gga-miR-132c-5p、gga-miR-2184a-5p、gga-miR-155和gga-miR-203a）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)這4個(gè)miRNA表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與small RNA高通量測(cè)序結(jié)果基本一致，說(shuō)明差異表達(dá)miRNA分析結(jié)果較可靠。

2. 4 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

本課題組前期鑒定出開(kāi)產(chǎn)組樣本與未開(kāi)產(chǎn)組樣本的差異表達(dá)基因494個(gè)，其中開(kāi)產(chǎn)組樣本有上調(diào)基因285個(gè)、下調(diào)基因209個(gè)。運(yùn)用miRanda對(duì)開(kāi)產(chǎn)組樣本與未開(kāi)產(chǎn)組樣本的12個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果共預(yù)測(cè)得到129個(gè)潛在靶基因（表6）。其中，以miR-203a預(yù)測(cè)得到的靶基因最多，為32個(gè);其次是gga-miR-2184a-5p、gga-miR-148a-5p和gga-miR-12211-5p，分別預(yù)測(cè)到30、25和23個(gè)靶基因;而miR-132c-5p預(yù)測(cè)得到的靶基因最少，僅為9個(gè)。

2. 5 差異表達(dá)miRNA靶基因功能分析結(jié)果

2. 5. 1 GO功能注釋分析 對(duì)預(yù)測(cè)得到的129個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行GO功能注釋分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這129個(gè)靶基因顯著注釋到8條GO功能條目上。其中，生物學(xué)過(guò)程（Biological process）主要注釋到脂質(zhì)代謝過(guò)程（Lipid metabolic process）、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程（Cellular lipid metabolic process）、脂質(zhì)生物合成過(guò)程（Lipid biosynthetic process）、磷脂生物合成過(guò)程（Phospholipid biosynthetic process）、磷脂代謝過(guò)程（Phospholipid metabolic process）、甘油磷脂生物合成過(guò)程（Glycerophospholipid biosynthetic process）和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)育（Anatomical structure development）;分子功能（Molecular function）僅注釋到1條GO功能條目，即利鈉肽受體活性（Natriuretic peptide receptor activity）;未發(fā)現(xiàn)涉及細(xì)胞組分（Cellular component）的GO功能條目（圖2）。從表7可看出，在注釋到的8條GO功能條目中有6條與脂質(zhì)代謝相關(guān)，涉及的靶基因有22個(gè)，占總潛在靶基因的17.10%，其中11個(gè)靶基因（PEMT、FAR1、FADS2、MSMO1、ANGPTL3、KDSR，ENPP7、MBOAT2、FDFT1、FGF19和PTDSS1）表達(dá)上調(diào)、11個(gè)靶基因（SLC16A1、BRCA1、INPPL1、BCMO1、ACAA1、APOA1、BPNT1、ACSL1、CYP2AC1、LCAT和KIT）表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明脂質(zhì)代謝是較重要的GO功能。

2. 5. 2 KEGG信號(hào)通路富集分析 對(duì)預(yù)測(cè)得到的129個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示顯著富集得到7條KEGG信號(hào)通路（圖3）。由表8可看出，在7條顯著富集的KEGG信號(hào)通路及其涉及靶基因中，脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）及酮體合成與降解（Synthesis and degradation of ketone bodies）等3條信號(hào)通路與脂質(zhì)代謝相關(guān);PPAR信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)，同時(shí)與脂肪組織分化和脂肪代謝相關(guān)（Siersbaek et al.，2010;王璟等，2016）;視黃醇代謝（Retinol metabolism）信號(hào)通路和維生素代謝相關(guān);過(guò)氧化物酶體（Peroxisome）信號(hào)通路與分解代謝相關(guān);纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）信號(hào)通路與氨基酸代謝相關(guān)，提示差異表達(dá)miRNA可能主要影響這7條KEGG信號(hào)通路，特別是脂質(zhì)代謝相關(guān)通路。

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，其應(yīng)用領(lǐng)域逐漸廣泛，且測(cè)序結(jié)果的容量和質(zhì)量得到有效提高。本研究中small RNA測(cè)序獲得的Raw reads在10000000以上，與目前常用的small RNA測(cè)序數(shù)據(jù)量相當(dāng)（孫瑞萍等，2020;Chen et al.，2021）。從Clean reads數(shù)據(jù)及其能注釋到的miRNA數(shù)據(jù)可看出，本研究的small RNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及置信度均較高，可用于后續(xù)的進(jìn)一步分析;其他非編碼RNA（rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA）的所占比例也證明所測(cè)序列確實(shí)以miRNA為主。6個(gè)樣本（3個(gè)開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本，3個(gè)未開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本）能注釋到的miRNA均超過(guò)300個(gè)，約占miRBase中已鑒定雞miRNA的30.00%，則進(jìn)一步證實(shí)miRNA在雞肝臟中的數(shù)量及含量均較多，也提示其發(fā)揮著重要作用。差異表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與small RNA高通量測(cè)序結(jié)果基本一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較可靠。對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，gga-miR-1682、gga-miR-132b-3p和gga-miR-2184a-3p等3個(gè)上調(diào)miRNA在未開(kāi)產(chǎn)蛋雞樣本中不表達(dá)，提示其在高能飼喂蛋雞的肝臟中對(duì)蛋雞開(kāi)產(chǎn)影響發(fā)揮著重要作用，但至今鮮見(jiàn)針對(duì)這3個(gè)miRNA的功能研究報(bào)道。此外，本研究發(fā)現(xiàn)gga-miR-132c-5p、gga-miR-132b-5p、gga-miR-2184a-5p、gga-miR-132c-3p、gga-miR-132b-3p及gga-miR-2184a-3p屬于同一miRNA基因簇，推測(cè)它們?cè)诒磉_(dá)和功能上具有相關(guān)性，但具體原理有待進(jìn)一步探究。

以本課題組前期鑒定獲得高能飼喂下開(kāi)產(chǎn)組與未開(kāi)產(chǎn)組蛋雞肝臟的差異表達(dá)基因作為候選基因，進(jìn)行差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)，可有效縮小靶基因的預(yù)測(cè)范圍，同時(shí)提高預(yù)測(cè)陽(yáng)性率，并已取得較理想的研究成果（Li et al.，2019;Yu et al.，2019;Nersisyan et al.，2020;Song et al.，2021），對(duì)gga-miR-132c-132b-2184a基因簇的靶基因預(yù)測(cè)同樣值得深入研究。在差異表達(dá)miRNA靶基因的GO功能注釋分析中，注釋到最多的是與脂質(zhì)代謝相關(guān)的GO功能條目，說(shuō)明miRNA通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因進(jìn)而調(diào)控這些生物學(xué)過(guò)程。本課題組前期分析育成期高能飼喂下開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞肝臟中差異表達(dá)基因的GO功能注釋情況，也發(fā)現(xiàn)大部分注釋到的GO功能條目都是與脂質(zhì)代謝相關(guān)，提示蛋雞的脂質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程受miRNA調(diào)控更多，與李紅（2016）的研究結(jié)果相似，即產(chǎn)蛋高峰期與產(chǎn)蛋前期蛋雞肝臟中差異表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)靶基因大部分與脂質(zhì)代謝相關(guān)，表明脂質(zhì)代謝與產(chǎn)蛋有直接或間接的聯(lián)系。

在KEGG信號(hào)通路富集分析中，顯著富集的KEGG信號(hào)通路均與代謝途徑相關(guān)，且以脂質(zhì)代謝相關(guān)通路為主，涉及的差異表達(dá)靶基因包括ACSBG2、FADS2、HMGCLL1、ACAA1、ACSL1、APOA1和BDH1B，且這些基因涉及脂質(zhì)代謝的多個(gè)方面。ACSBG2是一種乙酰輔酶A合成酶，參與雞的脂肪沉積（Guo et al.，2018）;FADS2是一種脂肪酸脫氫酶，參與多種多不飽和脂肪酸的合成（陳興勇等，2017）;HMGCLL1是類(lèi)HMG輔酶A裂解酶，抑制其表達(dá)可升高膽固醇和甘油三酯水平（Perveen et al.，2020）;ACAA1是乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶1，催化β-氧化途徑的關(guān)鍵酶，參與脂肪酸的延伸和降解（王延莉等，2019）;ACSL1是一種長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A合成酶，可提高甘油三酯水平（Li et al.，2020）;APOA1是載脂蛋白A1，調(diào)節(jié)高密度脂蛋白及膽固醇含量（Flores et al.，2019）;BDH1B是一種羥丁酸脫氫酶，是脂肪酸降解過(guò)程中酮體降解的關(guān)鍵酶，有報(bào)道稱(chēng)敲除其同源物BDH1后會(huì)導(dǎo)致脂肪肝形成（Otsuka et al.，2020）。除脂質(zhì)代謝相關(guān)通路，還存在與氨基酸代謝相關(guān)的KEGG信號(hào)通路，與李慧峰等（2017）對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋前后肝臟差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路注釋分析結(jié)果一致。可見(jiàn)，miRNA主要影響脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而影響蛋雞開(kāi)產(chǎn)。

4 結(jié)論

育成期高能飼喂下開(kāi)產(chǎn)與未開(kāi)產(chǎn)蛋雞中共存在12個(gè)差異表達(dá)miRNA，涉及129個(gè)差異表達(dá)潛在靶基因，且主要為肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程和信號(hào)通路，說(shuō)明miRNA是通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝及其相關(guān)基因表達(dá)而影響蛋雞開(kāi)產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）