抑制馬鈴薯干腐病菌的活性酒糟菌篩選、鑒定及抑菌活性測定

郝玉凡　沈碩

摘要：【目的】明確來源于青稞酒糟的菌株對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌活性，為馬鈴薯保鮮菌劑及生防制劑的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。【方法】采用平板對峙法對分離自青稞酒糟的40株菌株進行抑制馬鈴薯干腐病病原菌（青9A-7-5、青9A-8-8、青9A-5-3和青9A-6-2）活性測定，從中篩選活性菌株并進行活性菌株穩(wěn)定性評價;采用牛津杯法對活性菌株發(fā)酵液萃取物進行抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性測定及穩(wěn)定性評價;通過形態(tài)學、生理生化特征及分子生物學方法對活性菌株進行鑒定。【結(jié)果】通過平板對峙法從40株青稞酒糟菌株中篩選出8株（菌株JZ2c24、JZ3d09、JZ3c08、JZ2b13、JZ1-4-10、JZ1-1-1、JZ1-1-9和JZ1-4-1）對馬鈴薯干腐病病原菌具有較高抑菌活性的菌株，其中，菌株JZ1-1-1對病原菌青9A-7-5的抑菌活性穩(wěn)定，其抑菌帶縮小率為25.42%，菌株JZ1-1-9對病原菌青9A-6-2的抑菌活性穩(wěn)定，其抑菌帶縮小率為26.20%;在濃度為50.00 mg/mL時，菌株JZ1-1-1的發(fā)酵液水相萃取物溶液對馬鈴薯干腐病病原菌青9A-7-5的抑菌活性較高，其抑制中濃度（EC₅₀）為19.16 mg/mL，菌株JZ1-1-9的發(fā)酵液水相萃取物溶液對馬鈴薯干腐病病原菌青9A-6-2的抑菌活性較高，其EC₅₀為20.80 mg/mL，且菌株JZ1-1-1的發(fā)酵液水相萃取物溶液最穩(wěn)定。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征及分子生物學鑒定結(jié)果，將菌株JZ1-1-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）?！窘Y(jié)論】來源于青稞酒糟的貝萊斯芽孢桿菌菌株JZ1-1-1具有作為馬鈴薯保鮮菌劑及生防菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞： 馬鈴薯干腐病;抑菌活性;發(fā)酵液萃取物溶液;生物防治

中圖分類號： S435.32? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0486-11

Screening， identification and anti-microbial activity of antagonistic strains against potato dry rot

HAO Yu-fan， SHEN Shuo

（Qinghai University/Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Science/Key Laboratory of Potato Breeding of Qinghai Province/The Tibet Plateau Biotechnology Key Lab of Ministry of Education/Northwest Potato Engineering Research Center， Ministry of Education， Xining? 810016， China）

Abstract：【Objective】To find out the antibacterial activity of strains from distillers grain of highland barley against potato dry rot pathogen， so as to provide scientific basis for developing new biocontrol bacteria resources for biological control of potato dry rot. 【Method】The activity of 40 strains of distiller's grains against the pathogen of potato dry rot （Qing 9A-7-5， Qing 9A-8-8， Qing 9A-5-3 and Qing 9A-6-2） was determined by plate confrontation method and the stability of the active strains was evaluated. The antibacterial activity and stability of active strains against potato dry rot pathogens were determined and evaluated through Oxford cup method. The active strain JZ1-1-1 was identified by morphological， physiological and biochemical and molecular biological methods. 【Result】Eight strains with high antibacterial activity against potato dry rot pathogens， JZ2c24， JZ3d09， JZ3c08， JZ2b13， JZ1-4-10， JZ1-1-1. JZ1-1-9 and JZ1-4-1， were screened by the plate confrontation method from 40 strains of distillers grains. Strain JZ1-1-1 had stable antibacterial activity against the pathogen Qing 9A-7-5， and the reduction rate of antibacterial band was 25.42 %. Strain JZ1-1-9 had stable antibacterial activity against the pathogen Qing 9A-6-2， and its reduction rate of antibacterial band was 26.20%. When the concentration was 50 mg/mL， the fermentation liquid water phase extract solution of strain JZ1-1-1 had high antibacterial activity against the potato dry rot pathogen cyanobacteria 9A-7-5， and its moderate inhibitory concentration （EC₅₀） value was 19.16 mg/mL. The fermentation liquid water phase extract solution of strain JZ1-1-9 had higher antibacterial activity against potato dry rot pathogen cyanobacteria 9A-6-2， and its EC₅₀value was 20.80 mg/mL. And the aqueous phase extract of the fermentation liquid of strain JZ1-1-1 was the most stable. According to results of colony morphological， physiological and molecular biochemical experiments， strain JZ1-1-1 was identified as Bacillus velezensis. 【Conclusion】B. velezensis strain JZ1-1-1 from distillers grain of highland barley has the potential to serve as potato preservation agent and biological antibacterialagent.

Key words： potato dry rot; bacteriostatic activity; fermentation liquid extract solution; biological control

Foundation items： General Project of Qinghai Natural Science Foundation（2019-ZJ-914）; Modern Agriculture Industry Technology System（CARS-09）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是第四大糧食作物（Drewnowski and Rehm，2018;肖熙鷗等，2021），因采收后管理及儲藏不當?shù)葧斐神R鈴薯產(chǎn)量的嚴重損失（趙賽楠等，2019）。近年來，馬鈴薯窖藏期間的病害損失率較高（Bojanowski et al.，2013;他永全和沈碩，2018;賈鵬莉等，2020;胡英杰等，2021）。馬鈴薯干腐病為窖藏期間常見的一種真菌病害，其主要由致病鐮刀菌（Fusarium sp.）引起，在馬鈴薯優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生（Gerbore et al.，2014;王文重等，2020a，2020b）。我國對馬鈴薯干腐病的研究和報道較多，但目前針對該病害的防治方法主要為化學防治（Caba?as et al.，2010;高云飛等，2020;梁聰?shù)龋?020），生物防治方面的相關(guān)研究較少（劉治會等，2019）。生物防治近年來成為植物病害防治的研究熱點和目標（Messing and Brodeur，2018），因此，開展馬鈴薯干腐病生防菌株的篩選，對馬鈴薯窖藏病害防控具有重要意義。【前人研究進展】在化學藥劑防治馬鈴薯干腐病方面，何國勤等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，2.5%咯菌腈懸浮種衣劑和25%嘧菌酯懸浮液對馬鈴薯干腐病及枯萎病具有一定的防治效果;寧楠楠等（2021）發(fā)現(xiàn)戊唑醇對馬鈴薯干腐病菌三線鐮刀菌（F. tricinctum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和木賊鐮刀菌（F. equiseti）具有較強的抑制作用，且能控制貯藏期間馬鈴薯干腐病的發(fā)生（孫清華等，2019），藥劑拌種也可有效防治馬鈴薯干腐?。ü设?，2020）。有關(guān)拮抗菌防治馬鈴薯干腐病方面，有學者研究發(fā)現(xiàn)宛氏擬青霉（Paecilomyces varioti）、淡紫擬青霉（P. lilacinus）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt LTS290和生物農(nóng)藥枯草芽孢桿菌（B. subtilis）B2對馬鈴薯干腐病病原菌有較高的抑菌活性（周國旺等，2015;陳書珍等，2017;Jawed et al.，2019），假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）菌株YL11的無菌發(fā)酵液對馬鈴薯干腐病病原菌有抑制作用，并能降低病原菌產(chǎn)生的毒素活性（張紊瑋等，2018）;Ramlawi等（2021）發(fā)現(xiàn)多種拮抗細菌能抑制馬鈴薯干腐病病原菌的生長，且4種拮抗細菌韓國假單胞菌（P. koreensis）、莫拉維假單胞菌（P. moraviensis）、枯草芽孢桿菌和格氏假單胞菌（P. gessardii）的萃取物具有顯著的抑菌活性。近年來，運用拮抗菌防治馬鈴薯病害的研究較多，使用較廣泛的生防菌主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）和假單胞菌屬。因芽孢桿菌能影響鐮刀菌在植物上的定殖（朱玥妍等，2012;樊繼強，2016），具有生長繁殖快、耐熱等優(yōu)點，具有發(fā)展成生防菌劑的潛力（陳志誼，2015;蔣晶晶等，2020;臺蓮梅等，2021）。國內(nèi)有學者通過定殖等研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）對馬鈴薯黑痣病具有防治作用（彭振紅，2012;關(guān)小敏等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c】青稞酒糟來源于青稞白酒，是生產(chǎn)青稞白酒的產(chǎn)物。目前青稞酒糟在植物飲料、動物飼料和農(nóng)用肥等方面的研究較多（黃迪宇等，2017），在生物防治方面的應用研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過平板對峙法對分離自青稞酒糟的40株菌株進行抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性測定，采用牛津杯法對活性菌株發(fā)酵液萃取物溶液進行抑菌活性測定及穩(wěn)定性評價，以期為馬鈴薯保鮮菌劑及生防制劑的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 40株供試菌株由本課題組前期分離自青稞酒糟，其中真菌菌株和細菌菌株各20株;供試馬鈴薯干腐病病原菌：變紅鐮刀菌（F. incarnatum）青9A-5-3、銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）青9A-8-8、三線鐮刀菌青9A-7-5和茄鐮孢菌（F. solani）青9A-6-2，均由本課題組分離自青薯9號病薯薯塊，4 ℃保存于青海大學農(nóng)林科學院微生物實驗室。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）（武志華，2018），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）（沈碩和王艦，2013）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株的活化 從4 ℃冰箱中取出20株供試真菌，分別挑取部分菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中心，置于27 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5 d，備用。從4 ℃冰箱中取出20株供試細菌，分別劃線接種于NA培養(yǎng)基中心，置于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d，備用。

1. 2. 2 拮抗菌篩選

1. 2. 2. 1 供試真菌篩選 采用平板對峙法（龔明福等，2011），將活化后的20株供試真菌和4株馬鈴薯干腐病病原菌用打孔器打孔，在距PDA培養(yǎng)基中心兩側(cè)1.5 cm處分別接種供試真菌和病原真菌菌餅，以培養(yǎng)基中心只接病原菌菌餅為對照，每處理3次重復，置于27 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5 d。根據(jù)抑菌率的大小確定20株供試真菌的抑菌活性。

抑菌率（%）=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑]×100

1. 2. 2. 2 供試細菌篩選 采用平板對峙法（千慧敏等，2019），將活化后的病原菌用打孔器打孔，在距PDA培養(yǎng)基中心兩側(cè)1.5 cm處一側(cè)劃線接種供試細菌，一側(cè)接種病原菌菌餅，以培養(yǎng)基中心只接病原菌菌餅為對照，每處理3次重復，置于27 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5 d。根據(jù)抑菌率大小確定20株供試細菌的抑菌活性，計算公式同1.2.2.1。

1. 2. 3 活性菌株的穩(wěn)定性評價 穩(wěn)定性評價試驗設置方法同1.2.2。將初篩所得拮抗菌株（菌株JZ3d09、JZ2b13、JZ3c08、JZ2c24、JZ1-1-1、JZ1-4-1、JZ1-4-10和JZ1-1-9）和供試馬鈴薯干腐病病原菌分別對峙培養(yǎng)7和14 d，計算14 d的抑菌帶寬度縮小率（VF）。菌株穩(wěn)定性評價標準：VF≥70.00%，不穩(wěn)定，用--表示;50.00%≤VF<70.00%，較不穩(wěn)定，用-表示;20.00%≤VF<50.00%，較穩(wěn)定，用+表示;VF<20.00%，穩(wěn)定，用++表示。

抑菌帶寬度縮小率（%）=[（7 d抑菌帶寬度值-

14 d抑菌帶寬度值）/7 d

抑菌帶寬度值]×100

1. 2. 4 菌株發(fā)酵液萃取物溶液制備及抑菌活性測定 參照陳妙妙等（2020）的方法，用接種針分別挑取1環(huán)活性菌株（菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9）分別接種于裝有NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)5 d，獲得菌株發(fā)酵液，經(jīng)布氏漏斗過濾處理，去除菌體后可得去菌體發(fā)酵液，備用。取制備的去菌體發(fā)酵液各600 mL，分別置于分液漏斗中。依次用等量的正己烷、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇進行萃取，待萃取完成后，可獲得有機相萃取液及剩下的水相萃取液，萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到萃取物浸膏，將其預溶于二甲基亞砜（≤0.1%）后，用無菌水分別配制成質(zhì)量濃度為10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 mg/mL的萃取物溶液，將萃取物溶液用直徑為0.22 μm的微孔濾膜抽濾后，保存?zhèn)溆?。以等體積濃度的二甲基亞砜（≤0.1%）無菌水溶液作為對照，每處理3次重復。

采用牛津杯法（劉冬梅等，2006），通過十字交叉法測定活性菌株發(fā)酵液萃取物溶液對供試馬鈴薯干腐病病原菌的直徑，計算公式同1.2.2.1。

根據(jù)張志祥等（2002）的方法，計算活性菌株（菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9）發(fā)酵液萃取物溶液對馬鈴薯干腐病病原菌的抑制中濃度（EC50）。

1. 2. 5 菌株發(fā)酵液萃取物溶液的穩(wěn)定性評價 根據(jù)施宏梅等（2018）的方法對50.00 mg/mL活性菌株（菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9）發(fā)酵液水相萃取物溶液進行穩(wěn)定性評價。

1. 2. 5. 1 熱穩(wěn)定性 在40、60、80和100 ℃下分別對活性菌株（菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9）發(fā)酵液萃取物溶液進行水浴處理，并在121 ℃下高壓滅菌處理（60 min），以未處理的發(fā)酵液萃取物溶液為對照，根據(jù)抑制率大小及變化確定其發(fā)酵液萃取物溶液的穩(wěn)定性。

1. 2. 5. 2 酸堿穩(wěn)定性 用濃度為1 mol/mL的鹽酸和1 mol/mL的氫氧化鈉溶液對活性菌株（菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9）發(fā)酵液萃取物溶液進行pH調(diào)節(jié)，分別調(diào)節(jié)pH為2、4、6、8和10，以未處理的發(fā)酵液萃取物溶液為對照，根據(jù)抑制率大小及變化確定其發(fā)酵液萃取物溶液的酸堿穩(wěn)定性。

1. 2. 5. 3 光穩(wěn)定性 用245 nm紫外燈在20 cm處分別照射活性菌株（菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9）發(fā)酵液萃取物溶液20、40、60、80和100 min，以未處理的發(fā)酵液萃取物溶液為對照，根據(jù)抑制率大小及變化確定其發(fā)酵液萃取物溶液的光穩(wěn)定性。

1. 2. 6 菌株鑒定

1. 2. 6. 1 形態(tài)學及生理生化鑒定 將活化的活性菌株（菌株JZ1-1-1）接種于NA培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》（英文版）（Buchanan and Gibbons，1999）和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）進行鑒定。

1. 2. 6. 2 分子生物學鑒定 活性菌株（菌株JZ1-1-1）的DNA提取根據(jù)（生工生物工程（上海）股份有限公司）的柱式細菌DNA提取試劑盒的程序進行操作，用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAGG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系25.0 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應結(jié)束后，取5.0 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據(jù)所得序列，在EZ biocloud上選取并下載同源性大于95%的序列，運用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joi-ning，NJ）（Bootstrap值為1000次）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 3 統(tǒng)計分析

運用Excel 2016和SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性菌株篩選結(jié)果

采用平板對峙法，對分離自青稞酒糟的40株供試菌株進行抑制馬鈴薯干腐病病原菌（青9A-7-5、青9A-8-8、青9A-5-3和青9A-6-2）活性測定。由表1可知，40株供試菌株對馬鈴薯干腐病病原菌均有抑菌活性，其中真菌菌株JZ2c24、JZ3d09、JZ3c08和JZ2b13分別對病原菌青9A-6-2、青9A-7-5、青9A-5-3和青9A-8-8的抑菌活性較高，抑制率分別為49.22%、57.04%、53.76%和65.04%;細菌菌株JZ1-4-10、JZ1-1-1、JZ1-1-9和JZ1-4-1分別對菌株青9A-5-3、青9A-7-5、青9A-6-2和青9A-8-8表現(xiàn)出較高的抑菌活性，抑制率分別為72.73%、83.66%、83.21%和64.06%。

就不同類型拮抗菌而言，供試細菌較真菌的抑菌活性高，其中以細菌菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9對青9A-7-5和青9A-6-2的抑制作用尤為明顯（圖1）。綜上所述，初篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株細菌菌株JZ1-1-9、JZ1-4-1、JZ1-4-10和JZ1-1-1及4株真菌菌株JZ3d09、JZ2b13、JZ3c08和JZ2c24對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌活性較高。

2. 2 菌株抑菌活性的穩(wěn)定性評價

為確定初篩得到的8株活性菌株JZ3d09、JZ2b13、JZ3c08、JZ2c24、JZ1-1-1、JZ1-4-1、JZ1-4-10和JZ1-1-9對馬鈴薯干腐病病原菌抑菌活性的穩(wěn)定性，對其進行抑菌活性的穩(wěn)定性評價，分別為菌株JZ3d09和JZ1-1-1對病原菌青9A-7-5、菌株JZ2b13和JZ1-4-1對病原菌青9A-8-8、菌株JZ3c08和JZ1-4-10對病原菌青9A-5-3及菌株JZ2c24和JZ1-1-9對病原菌青9A-6-2的抑菌活性穩(wěn)定性評價。結(jié)果（表2）顯示，菌株JZ3d09、JZ2b13、JZ3c08、JZ2c24、JZ1-4-1和JZ1-4-10對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌帶縮小率分別為75.36%、79.03%、83.33%、88.87%、69.85%和66.42%，抑制作用不穩(wěn)定，菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9對馬鈴薯干腐病病原菌抑制作用的穩(wěn)定性較好，抑菌帶縮小率分別為25.42%和26.20%。

2. 3 菌株發(fā)酵液萃取物溶液抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性

由表3和表4可知，菌株發(fā)酵液萃取物溶液的抑菌活性均隨著萃取物濃度的上升而升高，其中，50.00 mg/mL的菌株JZ1-1-9發(fā)酵液的乙酸乙酯、氯仿和水相萃取物溶液對青9A-6-2的抑菌活性較高，抑制率分別為70.43%、70.39%和72.56%，正己烷萃取物溶液的抑菌活性最低，為12.42%（表3）;50.00 mg/mL的菌株JZ1-1-1發(fā)酵液的乙酸乙酯、氯仿和水相萃取物溶液對青9A-7-5的抑菌活性較高，抑制率分別為70.31%、67.24%和82.63%，正丁醇萃取物溶液的抑制率最低，為12.14%（表4）。表明菌株JZ1-1-9和JZ1-1-1的乙酸乙酯、氯仿和水相萃取物溶液的抑菌活性較高，且水相發(fā)酵液萃取物溶液的抑菌活性最高。

由顯著性分析結(jié)果可得，菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9萃取物溶液濃度為50.00 mg/mL時對馬鈴薯干腐病病原菌的抑制率與10.00、20.00、30.00和40.00 mg/mL時的抑制率差異顯著（P<0.05，下同）。由毒力回歸方程可得，菌株JZ1-1-9的水相、乙酸乙酯和氯仿萃取物溶液對青9A-6-2抑菌活性的EC50分別為20.80、27.13和29.48 mg/mL，菌株JZ1-1-1的水相、乙酸乙酯和氯仿萃取物溶液對青9A-7-5抑菌活性的EC50分別為19.16、27.74和27.39 mg/mL（表5）。表明菌株JZ1-1-9和JZ1-1-1的水相萃取物溶液分別對病原菌青9A-6-2和青9A-7-5的抑菌活性較高。

2. 4 菌株發(fā)酵液水相萃取物溶液的穩(wěn)定性評價

由圖2可知，菌株JZ1-1-1水相萃取物溶液在40、60、80、100和121 ℃時的抑菌率均在70.00%以上，其中以40 ℃時的抑菌率最高，為82.00%;在pH為8時的抑菌活性最高，為78.00%;在紫外光不同時長照射下均較穩(wěn)定。菌株JZ1-1-9水相萃取物溶液在40、60、80、100和121 ℃時的抑菌率均在60.00%以上，以40 ℃時的抑菌率最高，為70.00%;當pH為8的抑菌活性最高，為71.00%;在紫外光不同時長照射下均較穩(wěn)定。

由圖2-A可知，菌株JZ1-1-1的水相萃取物溶液抑菌率在100 ℃上升至121 ℃時下降了2.00%，菌株JZ1-1-9的水相萃取物溶液抑菌率在100 ℃上升至121 ℃時下降了4.00%，說明在溫度升高時，菌株JZ1-1-1比JZ1-1-9的穩(wěn)定性更好;由圖2-B可知，在強酸、強堿環(huán)境下菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9的水相萃取物溶液抑菌率均在55.00%以上，說明2株菌株對酸堿的適應性較廣，但菌株JZ1-1-9水相萃取物溶液在pH為8～10時抑菌率有明顯的下降趨勢，表明菌株JZ1-1-1在酸堿環(huán)境下的穩(wěn)定性較菌株JZ1-1-9好;由圖2-C可知，菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9在紫外光不同時長照射下的抑菌率均較平穩(wěn)。以上結(jié)果表明，菌株JZ1-1-1的水相萃取物溶液在濃度為50.00 mg/mL時的抑菌活性更穩(wěn)定。

2. 5 菌株JZ1-1-1鑒定

2. 5. 1 形態(tài)學鑒定 菌株JZ1-1-1在NA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，菌落為乳白色，形態(tài)呈規(guī)則的圓形，不透明，表面粗糙（圖3-A）。革蘭氏染色陽性，菌體桿狀，大小約為0.5 μm×1.5～2.5 μm（圖3-B）。

2. 5. 2 生理生化特征鑒定 菌株JZ1-1-1的生理生化特性分析結(jié)果（表6）顯示，接觸酶、淀粉水解和脲酶等試驗呈陽性，甲基紅和吲哚試驗呈陰性，菌株JZ1-1-1能利用淀粉、乳糖和蔗糖等糖類，不能利用半乳糖。

2. 5. 3 分子生物學鑒定 將菌株JZ1-1-1測序得到的16S rDNA序列提交至https：//www.ezbiocloud.net/上，下載同源性大于95%的序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由圖4可知，菌株JZ1-1-1與2株貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）聚為同一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征及分子生物學鑒定結(jié)果，將菌株JZ1-1-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

3 討論

國外研究者在馬鈴薯病害生物防治方面取得了較大進展（Schisler et al.，2016），國內(nèi)在芽孢桿菌為主要生防菌類型的報道較多，但有關(guān)芽孢桿菌萃取物溶液在馬鈴薯病害生物防治上的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)莫海威芽孢桿菌（B. mojavensis）對馬鈴薯干腐病、褐腐病和炭疽病等3種病害病原菌均有較高的抑菌活性（暢濤等，2014），解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）對馬鈴薯干腐病和早疫病等8種病害病原菌具有較高的抑菌活性（楊帆等，2019），貝萊斯芽孢桿菌的提取物對馬鈴薯黑痣病病原菌生長有一定的抑制作用（趙雅，2020），短小芽孢桿菌萃取物對馬鈴薯干腐病病原菌具有較高的抑菌活性（沈碩，2021）。貝萊斯芽孢桿菌最早是在2005年由Ruiz-García等（2005）發(fā)現(xiàn)其對多種病原真菌具有抑制作用，近幾年對該菌的研究逐漸增多（陶永梅等，2019;李永麗等，2021），但在馬鈴薯干腐病的防治研究方面較少。青稞是我國西北、西南等地常年栽種的禾本科作物，酒糟是經(jīng)發(fā)酵后的殘渣，有研究發(fā)現(xiàn)來源于青稞白酒糟醅的多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌具有抑菌活性（李瑋等，2016），青稞白酒糟醅粗提物具有抑草活性（李瑋等，2017），但有關(guān)青稞酒糟在生物防治上的研究報道極少，因此青稞酒糟來源的微生物在生物防治上的應用不僅是對青稞酒糟資源的再利用，也為生物防治的微生物來源提供了新途徑。本研究基于課題組前期自青稞酒糟分離的40株菌株進行抑制馬鈴薯干腐病病原菌（青9A-7-5、青9A-8-8、青9A-5-3和青9A-6-2）活性測定，篩選出抑菌活性較高的4株拮抗真菌（菌株JZ2c24、JZ3d09、JZ3c08和JZ2b13）和4株拮抗細菌（菌株JZ1-4-10、JZ1-1-1、JZ1-1-9和JZ1-4-1）。8株拮抗菌的抑菌活性穩(wěn)定性評價結(jié)果顯示，菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9的抑菌活性穩(wěn)定性較好。菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9的發(fā)酵液萃取物溶液抑制病原菌活性測定結(jié)果顯示，菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9的水相、乙酸乙酯和氯仿發(fā)酵液萃取物溶液對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌活性較高。菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9不同萃取物溶液對馬鈴薯干腐病病原菌的抑制中濃度測定結(jié)果顯示，濃度為50.00 mg/mL的菌株JZ1-1-1和JZ1-1-9水相萃取物溶液的抑菌活性最好，其穩(wěn)定性評價結(jié)果顯示，菌株JZ1-1-1的水相萃取物溶液穩(wěn)定性較菌株JZ1-1-9的好，表明菌株JZ1-1-1的水相萃取物溶液在濃度為50.00 mg/mL時對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌活性較高。經(jīng)鑒定，菌株JZ1-1-1為貝萊斯芽孢桿菌，與賈鵬莉和沈碩（2021）的研究結(jié)果一致，后續(xù)可通過對菌株JZ1-1-1及其發(fā)酵液萃取物進行馬鈴薯活體防效測定，以期為該菌株在馬鈴薯干腐病生防上的應用打下基礎。

4 結(jié)論

從來源于青稞酒糟的菌株中篩選獲得1株對馬鈴薯干腐病病原菌具有抑制活性的貝萊斯芽孢桿菌JZ1-1-1，其發(fā)酵液萃取物溶液在濃度為50.00 mg/mL時對馬鈴薯干腐病病原菌具有較好的抑制活性，具有作為馬鈴薯保鮮菌劑及生防菌劑的潛力。

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（責任編輯 麻小燕）