高通量測序技術(shù)分析榨菜腌制過程中表面白膜的微生物群落結(jié)構(gòu)

楊吉霞，曾祥平，李鳳珠，賀稚非*

（1 西南大學食品科學學院 重慶 400716 2 重慶市計量質(zhì)量檢測研究院第一分院 重慶 402260）

涪陵榨菜是世界三大腌菜之一，采用莖瘤芥（Brassica juncea，俗稱青菜頭）作為原料，經(jīng)過獨特的“三腌三榨”工藝腌制而成[1]。第1 次腌制采用菜塊質(zhì)量2%～4%的食鹽腌制約7 d，第2 次加入4%～8%的食鹽腌制20～30 d，第3 次用11%～16%的食鹽腌制4～6 個月，每次腌制結(jié)束時都將榨菜起池、壓榨去水[1-2]。由于腌制過程包含多個階段，其間有轉(zhuǎn)池、壓榨等操作，涉及的微生物種類繁多，容易因環(huán)境、器具等因素偶然引入微生物，故影響榨菜的腌制過程以及品質(zhì)。榨菜表面形成白膜是腌制過程中比較常見的現(xiàn)象，一般認為是由微生物形成的生物膜，然而，目前對白膜的微生物種類構(gòu)成及其對榨菜品質(zhì)的影響缺少系統(tǒng)性研究。深入分析白膜所含有的微生物，將有助于識別并防控微生物污染，從而提高榨菜的安全性。

本課題組曾采用培養(yǎng)法鑒定榨菜產(chǎn)膜相關(guān)的微生物，主要為芽孢桿菌（Bacillus）屬的菌種[3]。培養(yǎng)法有一定的局限性，只能鑒定出在培養(yǎng)條件下生長的微生物種類，而某些微生物是不可培養(yǎng)的，因此該方法不能全面反映微生物的多樣性[4]。高通量測序技術(shù)不需要培養(yǎng)，直接對樣品中所有微生物的16S rRNA 或者ITS 基因測序，能夠全面、真實地反映微生物群落中所有的種類和相對豐度，明確微生物的群落結(jié)構(gòu)，目前已廣泛運用于各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究[5]。

第三代測序平臺PacBio SMRT （單分子實時測序技術(shù)，Single molecule real time） 已較多應(yīng)用于微生物多樣性的研究中，它可以實現(xiàn)對細菌16S rRNA 基因（1 400 bp）的全長測序，準確率達到99%[6-8]。目前真菌的分析主要運用Illumina MiSeq 測序技術(shù)對ITS 基因進行測序。本研究分別采用PacBio SMRT 和Illumina MiSeq 測序技術(shù)對榨菜白膜的細菌16S rRNA 基因和真菌的ITS 基因進行測序，解析細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料 用無菌操作從某農(nóng)戶的腌制池中采集有膜的榨菜樣品5 個，用無菌采樣拭子采集白膜于無菌離心管中，編號為M1～M5。

1.1.2 試驗試劑 DNeasy mericon Food Kit 食品DNA 提取試劑盒Qiagen 69514，德國Qiagen 公司；1×TE 緩沖液 （B548106-0500）、50×TAE 緩沖液（B548101）、PBS 緩沖液（pH 7.3～7.5，B640435），生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖G-10，西班牙BIOWEST；Premix Taq、RNase-free water、DL2 000 DNA ladder marker，寶生物工程（大連）有限公司。引物：27F（5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGYTTACCTTG T TACGACTT-3'）[8]、ITS1F （5'-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA-3'）、ITS2R （5'-GCTGCGTTCT TCATCGATGC-3'）[9]。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 腌制期間表面有白膜的榨菜樣品Fig.1 The Zhacai samples with white biofilm on the surface during the pickling process

1.1.3 儀器與設(shè)備 PowerPac Basic 基礎(chǔ)電源、T100 梯度PCR 儀，美國伯樂Bio-Rad 公司；SWCJ-2F 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；G∶BOX EF 型凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene 公司；Milli-Q Biocel 超純水機，美國密理博公司；P100+超微量分光光度計，美國Pultton 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 宏基因組DNA 的提取 用食品DNA 提取試劑盒（DNeasy mericon Food Kit）提取白膜樣品的宏基因組DNA，用P100+超微量分光光度計、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量，貯存于-80℃?zhèn)溆肹8-9]。

1.2.2 PCR 擴增 用27F 和1492R 引物擴增細菌的16S rRNA 基因。20 μL PCR 反應(yīng)體系包括：10 μL 2×Premix Taq 緩沖液，0.5 μL 10 μmol/L 引物，10 ng DNA 模板。擴增程序為：先在95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s循環(huán)30 次，最后72 ℃10 min[3，8]。真菌擴增采用引物ITS1F 和ITS2R，55 ℃褪火，其余條件相同[9-10]。

1.2.3 高通量測序 制備的白膜宏基因組DNA樣品1 份送諾禾致源公司運用PacBio SMRT 平臺對細菌16S rRNA 基因測序，引物為27F 和1492R，長度為1 400 bp[8]，同時另一份送上海美吉生物醫(yī)藥公司，運用Illumina MiSeq PE300 平臺和ITS1F、ITS2R 引物對真菌的ITS1 區(qū)測序，長度為300 bp[10]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 參照本實驗室已建立的方法做序列數(shù)據(jù)分析[11-12]。簡述如下：使用Trimmomatic、FLASH 軟件做序列的質(zhì)控、拼接，去除低質(zhì)量的序列。然后將序列用QIIME 包（定量研究微生物群落，Quantitative insights into microbial ecology，version 1.7）做生物信息分析，獲得分類操作單元（Operational taxonomic units，OTUs）和物種信息，計算α 多樣性指數(shù)，用R 語言繪圖。

1.2.5 NCBI 序列號 本研究中的序列已被存入NCBI 的Sequence Read Archive （SRA） 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），細菌16S rRNA序列的注冊號為BioProject ID PRJNA756136，真菌ITS1 序列的注冊號為PRJNA756159。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序的基本數(shù)據(jù)和α 多樣性指數(shù)

分別用PacBio SMRT 和Illumina MiSeq 對細菌的16S rRNA 基因和真菌的ITS1 基因測序，表1列出了測序的基本數(shù)據(jù)和α 多樣性指數(shù)。細菌的16S rRNA 基因測序長度達到1 400 bp，覆蓋全長。細菌的Coverage 大于0.99，真菌達到1.000，說明測序深度覆蓋到樣品中的所有物種。由表1數(shù)據(jù)可知細菌的α 多樣性指數(shù)大于真菌，說明其多樣性高于真菌。

表1 榨菜表面白膜樣品細菌和真菌多樣性測序的基本數(shù)據(jù)和α 多樣性指數(shù)Table 1 The general data of high throughput sequencing in the analysis of bacterial and fungal diversity in Zhacai surface white biofilm samples and their alpha diversity indices

圖2為細菌和真菌的Shannon 曲線圖，隨著reads 數(shù)的增加，OTU 水平的Shannon 指數(shù)也增加，說明獲得的物種多樣性信息增加，當細菌和真菌的reads 數(shù)分別達到871 和12 000 之后，Shannon 指數(shù)進入了平臺期，說明物種多樣性信息不再增加，本研究所用的測序深度足夠充分。

圖2 榨菜表面白膜樣品細菌和真菌的Shannon 指數(shù)圖（OTU 水平）Fig.2 The Shannon's diversity index curves （OTU level） of bacteria and fungi present in Zhacai surface white biofilm samples

2.2 細菌和真菌的多樣性統(tǒng)計

表2列出了榨菜表面白膜樣品中細菌和真菌在不同分類水平下的種類數(shù)量。每個樣品中細菌屬的數(shù)量均大于10，真菌屬的數(shù)量大于9，說明細菌和真菌群落中都存在比較豐富的種類多樣性。

表2 榨菜表面白膜樣品的細菌和真菌在不同分類水平下的數(shù)量統(tǒng)計Table 2 The statistical table of the distribution of bacteria and fungi at different taxonomic levels in Zhacai surface white biofilm samples

（續(xù)表2）

2.3 細菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)

榨菜表面白膜樣品中的細菌在門、屬水平上種類構(gòu)成如表3所示。

表3 榨菜表面白膜樣品中的細菌在門、屬水平上的種類構(gòu)成Table 3 The composition of bacteria at the level of phylum and genus in Zhacai surface white biofilm samples

在5 個榨菜白膜樣品的細菌群落中，最優(yōu)勢的門都是變形菌門，相對豐度均大于90%，其次是厚壁菌門。菌膜M1 中鑒定出的優(yōu)勢屬（豐度大于1%）包括：短波單胞菌（6.45%）、寡養(yǎng)單胞菌（1.67%）、瘤胃梭菌（1.32%）、粘土彎菌（1.09%）。菌膜M2 中主要的屬有：代爾夫特菌（53.83%）、寡養(yǎng)單胞菌（19.86%）、短波單胞菌（18.42%）、葉桿菌屬（1.27%）。菌膜M3 中主要的屬有：代爾夫特菌（44.27%）、己酸菌（4.89%）。菌膜M4 中主要的屬有：代爾夫特菌（48.93%）、寡養(yǎng)單胞菌（1.27%）。菌膜M5 中主要的屬有：叢毛單胞菌（69.08%）、寡養(yǎng)單胞菌（12.26%）。

2.4 真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)

榨菜白膜樣品中的真菌在門、屬水平上種類構(gòu)成如表4所示。

表4 榨菜表面白膜樣品中的真菌在門、屬水平上的種類構(gòu)成Table 4 The composition of fungi at the level of phylum and genus in Zhacai surface white biofilm samples

5 個白膜樣品的真菌群落中，最優(yōu)勢的門都是子囊菌門，其相對豐度均大于80%，其次是擔子菌門。菌膜M1 中最優(yōu)勢的屬為曲霉（相對豐度為40.00%），其次包括枝孢菌、德巴利酵母、青霉、威克漢姆酵母、鏈格孢霉、毛殼菌屬、埃德菌，其豐度均為6.67%。菌膜M2 中最優(yōu)勢屬為曲霉（38.89%），其次為枝孢菌、德巴利酵母、青霉、威克漢姆酵母、哈薩克斯坦酵母、嗜鹽梗孢酵母、Leptospora、嗜熱真菌屬、木霉屬、毛孢子菌屬，豐度均為5.56%。菌膜M3 中優(yōu)勢屬為曲霉（45.00%）和枝孢菌（10.00%），德巴利酵母、青霉、威克漢姆酵母、哈薩克斯坦酵母、嗜鹽梗孢酵母、白色側(cè)齒霉、隱球菌屬、接合酵母屬、鬼傘屬的豐度均為5.00%。菌膜M4 中主要的屬包括：曲霉（35.71%）、枝孢菌（14.29%），以及豐度均為7.14%的德巴利酵母、青霉、威克漢姆酵母、嗜鹽梗孢酵母、鏈格孢霉、白色側(cè)齒霉。菌膜M5 中最優(yōu)勢屬為曲霉（35.29%），其次為枝孢菌、德巴利酵母、青霉、威克漢姆酵母、哈薩克斯坦酵母、隱球菌屬、念珠菌、塞伯林德納氏酵母、鐮刀菌屬、Mastigobasidium，豐度均為5.88%。

3 討論

細菌生物膜的形成過程可分為5 個階段[13-14]：（1）可逆黏附階段。浮游狀態(tài)的細菌細胞黏附于食品或者其它固體表面，細菌的鞭毛、菌毛、胞外聚合物有利于黏附，其作用力包括范德華力、疏水相互作用、靜電力等，這種黏附是可逆的。（2）不可逆黏附階段。細菌細胞增殖達到一定的密度，產(chǎn)生胞外聚合物（Extracellular polymeric substance，EPS），例如：多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)，將菌細胞黏附聚集形成菌落基質(zhì)，啟動群體感應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生更多的胞外聚合物，使菌細胞黏結(jié)固定在固體表面，此黏附是不可逆的。（3）形成早期生物膜。菌細胞生長，進一步分泌產(chǎn)生胞外聚合物，向周轉(zhuǎn)擴散，形成早期生物膜。（4）生物膜成熟階段。菌落聚集形成成熟的生物膜。（5）生物膜脫落分散。菌細胞從生物膜上脫落，成為浮游細胞，擴散后在其它位置形成生物膜。本研究鑒定出主要的細菌屬包括代爾夫特菌、叢毛單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌、短波單胞菌，都有形成菌膜的報道[15-18]。

在真菌群落中，曲霉形成菌膜的特性已被廣泛研究和報道。真菌形成菌膜的過程與細菌略有差別[19]：曲霉能夠產(chǎn)生分生孢子，分生孢子通過一些黏附作用（例如：疏水相互作用、靜電相互作用、粗糙的表面）附著于食品或者其它固體表面，一類稱為疏水蛋白的兩親性蛋白質(zhì)也可以介導絲狀真菌的黏附，分生孢子黏附于固體表面之后，萌發(fā)產(chǎn)生菌絲（Filamentous），菌絲體生長形成最初的單層菌落，真菌也能產(chǎn)生與細菌相似的胞外聚合物使菌落黏附在一起，形成結(jié)構(gòu)復雜的成熟生物膜。

生物膜的形成可能與一些條件相關(guān)，例如：環(huán)境因素（pH 值、溫度、營養(yǎng)成分）、菌細胞密度、細菌種群特征等[13]。微生物形成菌膜后能夠增強對殺菌處理或者惡劣環(huán)境的抵抗能力，例如，野生型的鼠傷寒沙門氏菌 （Salmonella typhimurium） 能夠形成菌膜，與其它不能成膜的突變體相比較對次氯酸鈉的耐受性增強了1 000 倍[20]，有機小麥粉中的腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis），形成生物膜的菌株殺菌工藝值D80℃，0.45aw顯著高于不能成膜的菌株[21]。目前對于形成榨菜白膜的微生物認識不多，它們在哪些條件下容易形成生物膜，形成生物膜之后對殺菌處理的耐受性等，有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究分別用PacBio SMRT 和Illumina MiSeq 對榨菜表面白膜樣品的細菌16S rRNA 基因和真菌ITS1 基因測序，分析闡述了細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。白膜樣品中存在較多細菌和真菌種類，鑒定出細菌主要的屬包括：代爾夫特菌、叢毛單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌、短波單胞菌，真菌主要的屬包括：曲霉、枝孢菌、德巴利酵母屬、青霉、威克漢姆酵母、哈薩克斯坦酵母。