食品環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成、轉(zhuǎn)移及防控措施研究進(jìn)展

孫琳珺，張紅芝，方太松，王 園,3，劉陽泰，王 翔，李紅梅，李代禧，董慶利,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336；3.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué)，上海 201514）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種革蘭氏陽性桿菌，常見于生鮮或加工食品、家養(yǎng)或野生動物中，它能夠引起李斯特菌病，導(dǎo)致幼兒、老年人以及易感人群患敗血癥、腦膜炎等疾病以及孕婦流產(chǎn)[1]。歐洲食品安全局和歐洲疾病預(yù)防控制中心報道了歐洲2018年由單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的食源性疾病2 549 例，其中死亡病例229 例[2]。美國疾病預(yù)防控制中心在2019年報道了24 例李斯特菌病例，其中22 例住院病例，2 例死亡病例[3]。2013—2017年，中國也報道了211 例李斯特菌病病例，致死率達(dá)26.1%[4]。因此，單核細(xì)胞增生李斯特菌對食品環(huán)境的污染值得加強(qiáng)關(guān)注。

單核細(xì)胞增生李斯特菌能夠在極端環(huán)境如低溫、高鹽和低pH值條件下存活，其菌膜形成可能是其耐受極端環(huán)境的原因之一[5-6]。菌膜是鑲嵌在自身產(chǎn)生且能夠黏附于生物或非生物表面的胞外物質(zhì)中相同或不同屬的微生物群落[7]。在食品環(huán)境中，細(xì)菌可以在傳送帶、切割物表面、管道、墻壁等食品接觸表面形成菌膜[5]，相比于游離細(xì)胞，菌膜對消毒劑具有更好的抗性，并且能夠在不同條件的極端環(huán)境下適應(yīng)和生存[8]，甚至可以提高單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒性。單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成后就難以完全去除，從而成為交叉污染的傳播中心，并成為食品安全隱患，進(jìn)而導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)以及經(jīng)濟(jì)損失[9]。當(dāng)前關(guān)于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的研究主要分為兩個方向：1）關(guān)注單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜在不同條件下的形成及轉(zhuǎn)移情況；2）針對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的預(yù)防及控制措施研究。

本文首先總結(jié)了食品環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成能力的研究，其次綜述了單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成和轉(zhuǎn)移影響因素的研究進(jìn)展，最后著重對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜從預(yù)防和控制兩個方面進(jìn)行較為全面的概述，以期為研究單核細(xì)胞增生李斯特菌在食品環(huán)境中的菌膜污染因素及途徑提供參考，同時也為食源性致病菌的風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1 食品環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成能力

目前單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的測定方式主要有微孔板結(jié)晶紫染色法以及菌膜菌量計數(shù)法兩種。結(jié)晶紫染色法是將培養(yǎng)一定時間后的菌膜通過結(jié)晶紫進(jìn)行染色，進(jìn)而測定菌膜的OD值并與對照組OD值進(jìn)行比較來判斷菌膜形成能力的強(qiáng)弱。獲得的菌膜OD值將與陰性對照組OD值（ODc）的1、2、4 倍進(jìn)行比較從而判定菌膜的形成能力[10-11]。結(jié)晶紫染色法可以在篩菌的過程中加清晰地了解到每株菌的菌膜形成能力，但是由于這一過程中一并測定了胞外物質(zhì)的OD值并且結(jié)果相對不穩(wěn)定，因此并不適用于觀察菌膜中細(xì)菌的生長與轉(zhuǎn)移過程。另外，隨著研究的深入，以O(shè)D值對菌膜形成能力強(qiáng)弱進(jìn)行評判的標(biāo)準(zhǔn)也發(fā)生了一些改變。Osman等[12]將OD值為0.1和1作為菌膜形成能力弱、強(qiáng)和非常強(qiáng)的分界線。Stoller等[13]則使用一株菌膜形成能力強(qiáng)的菌株與一株菌膜形成能力弱的菌株作為對照組，將其OD值與其余菌株的菌膜OD值進(jìn)行比較，進(jìn)而判斷菌膜形成能力的強(qiáng)弱。因此就結(jié)晶紫染色法而言，菌膜形成能力的強(qiáng)弱判定標(biāo)準(zhǔn)需一致。

菌膜菌量計數(shù)法是將菌膜通過拍打或者漩渦的方式將菌膜脫落，進(jìn)而測定菌膜中所含的菌量，通過菌膜中菌量來判定菌膜形成能力。Piercey等[14]發(fā)現(xiàn)在肉品工廠與海鮮工廠中采樣的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜量都大于7（lg（CFU/cm2））。另外，標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)常作為參考菌株來判定其他菌株的形成能力[15-17]。菌膜菌量計數(shù)法能夠較為直觀地看出菌膜中的菌量，從而可以更好地判斷在形成以及轉(zhuǎn)移過程中細(xì)菌數(shù)量的變化。然而，目前標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇并沒有一個統(tǒng)一的參考，因此，菌膜菌量法只能比較菌膜菌量的高低，但是對于菌膜的形成能力強(qiáng)弱無法確定。

近5 年來，食品生產(chǎn)中養(yǎng)殖、屠宰、加工以及零售等階段的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成能力如表1所示。單核細(xì)胞增生李斯特菌具有良好的菌膜形成能力且不同菌株的菌膜形成能力有所差異，因此，更多具有代表性的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，從而更加深入了解單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌膜形成過程。其次，對于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的判斷標(biāo)準(zhǔn)也各有不同，并且不同測定方法獲得的數(shù)據(jù)也不具有可比性。此外，就1 種單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜測定方法來說，不同研究對菌膜的強(qiáng)弱判斷標(biāo)準(zhǔn)也有所不同。以上兩個問題導(dǎo)致數(shù)據(jù)之間缺乏可比性，從而對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成強(qiáng)弱的判斷缺乏依據(jù)。所以，統(tǒng)一菌膜強(qiáng)弱評判標(biāo)準(zhǔn)以及建立菌膜測定方法之間的聯(lián)系是目前亟待解決的問題。

表1 食品環(huán)境中不同階段檢出的單核細(xì)胞增生李斯特菌形成能力Table 1 Biofilm formation ability of L. monocytogenes in food environment at the stages of farming, slaughter, processing and retail

2 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成與轉(zhuǎn)移影響因素

2.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成影響因素

2.1.1 內(nèi)部形成影響因素

單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成受多種內(nèi)部因素的影響。首先，菌株表面特性例如疏水性、黏液產(chǎn)生能力以及自聚能力等對菌膜形成可能產(chǎn)生影響，Choi等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)菌膜形成與自聚能力無關(guān)聯(lián)，而與細(xì)菌的黏液產(chǎn)生能力以及疏水性呈正相關(guān)。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)菌膜形成與細(xì)胞表面疏水性并無顯著性關(guān)聯(lián)[22]。

其次，不同采樣來源的單核細(xì)胞增生李斯特菌形成菌膜的能力也有所差異。Rodríguez-Campos等[23]發(fā)現(xiàn)分別取樣自不銹鋼材質(zhì)以及聚苯乙烯材質(zhì)上的單核細(xì)胞增生李斯特菌在原材質(zhì)上的菌膜形成能力更強(qiáng)。同時，其還探討了采樣后單核細(xì)胞增生李斯特菌的持續(xù)性或偶發(fā)性對菌膜形成的影響。有研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成與菌株的偶發(fā)性或持續(xù)性均無關(guān)聯(lián)[24-25]。然而，Nowak等[24]通過對比采樣自禽類加工工廠中的持續(xù)性和偶發(fā)性單核細(xì)胞增生李斯特菌發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性菌株的菌膜形成能力高于偶發(fā)性菌株。

除此之外，單核細(xì)胞增生李斯特菌中的胞外核糖核酸和質(zhì)粒對菌膜的形成也具有顯著影響。Zetzmann等[26]對脫氧核糖核酸酶敏感或抵抗單核細(xì)胞增生李斯特菌的胞外核糖核酸進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)了胞外核糖核酸在低滲透活性物質(zhì)濃度的介質(zhì)中對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成具有重要作用。pLMSZ08質(zhì)粒也被發(fā)現(xiàn)對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成產(chǎn)生顯著影響，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒的缺失對細(xì)菌黏附前期并無顯著影響，然而在30 ℃下培養(yǎng)48 h后的正常菌株有能力形成更加致密的菌膜[27]。

最后，大量研究表明基因的調(diào)控與單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成也具有顯著聯(lián)系。當(dāng)一些毒力基因或者脅迫基因（表2）缺失后，單核細(xì)胞增生李斯特菌的初步黏附以及菌膜形成量呈現(xiàn)下降趨勢并在極端環(huán)境下的存活能力降低。

表2 影響單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成的基因Table 2 Genes related to biofilm formation of Listeria monocytogenes

單核細(xì)胞增生李斯特菌自身特性對菌膜的形成具有影響，每株菌的特性不同導(dǎo)致了菌膜形成的變異性，因此內(nèi)部影響因素導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成的不同需要更多具有代表性菌株去驗證。此外，許多內(nèi)部形成因素對菌膜形成的機(jī)理并未了解清楚，需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。

2.1.2 外部形成影響因素

溫度和培養(yǎng)成分是研究最多的兩個外邊形成因素。當(dāng)溫度上升時，通常會促進(jìn)單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成[39-41]。然而，Zetzmann等[42]發(fā)現(xiàn)在稀釋的培養(yǎng)基中，較37 ℃下培養(yǎng)，25 ℃下培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成量更多。Nowak等[39]也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，分析可能原因為過少的營養(yǎng)雖然使大部分細(xì)菌處于初步黏附狀態(tài)無法形成菌膜[43]，但也迫使單核細(xì)胞增生李斯特菌在適宜的溫度下形成菌膜從而對抗極端環(huán)境。

綜上，單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成與培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)成分也有重要的聯(lián)系。在普通培養(yǎng)基中，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯中形成的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜具有顯著性差異[44]；在實(shí)際食品培養(yǎng)介質(zhì)中，豬肉汁、牛肉汁與雞肉汁中的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成量也有所不同，其中在豬肉汁中的形成量最多[45]。除此之外，碳源的研究也是重要的考量指標(biāo)之一。Ibusquiza[40]、Kyoui[46]等發(fā)現(xiàn)僅加入葡萄糖的培養(yǎng)基中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成量顯著下降，而其余培養(yǎng)基中菌膜形成量并無顯著差異，然而葡萄糖能夠促進(jìn)菌膜胞外物質(zhì)的產(chǎn)生。另外，乳糖的加入使對抗逆境條件的sigB基因上調(diào)[47]，從而使單核細(xì)胞增生李斯特菌形成更多菌膜，因此乳糖的利用會觸發(fā)強(qiáng)烈的SigB因子依賴性應(yīng)激反應(yīng)，這可能對食品接觸表面單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成有益。同樣的，殼寡糖在研究中也顯示出具有相同的促進(jìn)效果[48]。

另外，菌膜的濕度、培養(yǎng)時間和黏附材質(zhì)也影響了單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成量。Piercey等[14]發(fā)現(xiàn)在濕度較低的環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜量隨時間的延長而降低。Ripolles-Avila等[49]將單核細(xì)胞增生李斯特菌培養(yǎng)24、48、72 h后的菌膜量進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)48 h是最適宜的培養(yǎng)時間。有研究表明，當(dāng)粗糙度越大時，單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜越容易形成[50]。另外，在不同材質(zhì)上單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的黏附也具有顯著性差異[51]。

在復(fù)雜的微生物環(huán)境中，兩菌和多菌之間的相互作用也影響了單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成，當(dāng)單核細(xì)胞增生李斯特菌與其他菌株混合培養(yǎng)時，其菌膜形成量將低于單菌培養(yǎng)時菌膜形成量。例如植物乳桿菌的增加會導(dǎo)致環(huán)境pH值下降，從而使單核細(xì)胞增生李斯特菌在酸環(huán)境中被殺滅[8]，或者如枯草芽孢桿菌可以改變單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形態(tài)從而降低其酶活性、黏附能力、毒力、溶血活性以及細(xì)胞運(yùn)動，最后導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的減少[52]。另外，當(dāng)兩菌生長過程中存在競爭關(guān)系時，優(yōu)勢菌群例如假單胞菌屬[53-55]等在生長的過程中使單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長緩慢，從而在兩菌菌膜中促進(jìn)優(yōu)勢菌群的菌膜形成，而單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成沒有變化。兩菌或多菌對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成的影響（表3）說明外部形成因素往往可以激發(fā)單核細(xì)胞增生李斯特菌內(nèi)部形成因素的改變，從而使單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成發(fā)生改變，因此，了解外部形成因素與內(nèi)部形成因素的關(guān)系能夠更好地了解菌膜形成的機(jī)理。

表3 兩菌或多菌對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成的影響Table 3 Effect of dual- or multi-species on Listeria monocytogenes biofilm formation

2.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜轉(zhuǎn)移影響因素

單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜一旦形成，就難以徹底去除，繼而會導(dǎo)致交叉污染，擴(kuò)大了單核細(xì)胞增生李斯特菌的傳播與污染范圍。目前關(guān)于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜轉(zhuǎn)移的研究主要是模擬不同食品環(huán)境因素對菌膜轉(zhuǎn)移的影響以及對比有無菌膜下單核細(xì)胞增生李斯特菌的轉(zhuǎn)移情況以及消殺狀態(tài)下單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的轉(zhuǎn)移，通過建立模型，可以更直觀地了解在食品環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的轉(zhuǎn)移情況（圖1）。

圖1 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜轉(zhuǎn)移圖解Fig 1 Schematic representation of the transfer of Listeria monocytogenes biofilm

不同環(huán)境因素可以影響單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的轉(zhuǎn)移效果。Midelet等[57]模擬了7 種因素對單核細(xì)胞增生李斯特菌單菌或混菌菌膜在胰蛋白胨大豆瓊脂上的黏附和連續(xù)轉(zhuǎn)移的影響，并且運(yùn)用Veulemans公式和3 種雙相以及單相脫落動力學(xué)進(jìn)行黏附強(qiáng)度和轉(zhuǎn)移能力的測定以及斜率。

單核細(xì)胞增生李斯特菌是否形成菌膜對其轉(zhuǎn)移能力也有一定的影響。Hansen等[58]模擬了三文魚生產(chǎn)環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌在形成或未形成菌膜情況下的轉(zhuǎn)移，并通過轉(zhuǎn)移效率來衡量菌膜中細(xì)菌的轉(zhuǎn)移程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同極端環(huán)境下，菌膜對細(xì)菌具有保護(hù)作用，且對食品加工過程中交叉污染具有潛在風(fēng)險。另外，研究發(fā)現(xiàn)無菌膜情況下的細(xì)菌轉(zhuǎn)移能力要高于有菌膜下的轉(zhuǎn)移能力，但是菌膜的存在大大提高了二次污染的概率。在食品環(huán)境中，消毒殺菌會導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特菌及其菌膜被殺滅，從而導(dǎo)致菌膜的轉(zhuǎn)移。Keskinen等[59]對比了有無冷應(yīng)激與消毒處理情況后單核細(xì)胞增生李斯特菌混菌菌膜的損傷與在肉制品中的轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果表明，冷應(yīng)激對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜存活與轉(zhuǎn)移有一定影響，而消毒情況則隨食品成分、菌膜形成時間的不同有所差異。Pang Xinyi等[54]模擬了不同成膜順序下單核細(xì)胞增生李斯特菌和熒光假單胞菌兩菌菌膜在三文魚工廠中的消毒殺菌效果對菌膜轉(zhuǎn)移的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌先于單核細(xì)胞增生李斯特菌形成菌膜，對干燥環(huán)境和消毒劑處理的抗性更好。

以上諸多研究表明在不同的加工環(huán)境因素下，單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌膜形成能力都有所不同。其次，食品接觸表面形成的菌膜會保護(hù)細(xì)菌免受極端環(huán)境和消毒劑的殺滅，從而提高交叉污染和二次污染的風(fēng)險。然而，當(dāng)前模擬實(shí)際情況中菌膜的轉(zhuǎn)移情況研究較少，這就意味著當(dāng)前的菌膜轉(zhuǎn)移研究并不能更好地貼合工廠實(shí)際情況進(jìn)行菌膜轉(zhuǎn)移的模型建立。因此，模擬真實(shí)食品介質(zhì)以及復(fù)雜微生物環(huán)境下單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的轉(zhuǎn)移研究值得進(jìn)一步深入推進(jìn)。

3 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜防控措施

單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成與轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致污染的傳播，影響食品安全，同時也使食品企業(yè)受到巨大損失，因此針對于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的防控措施研究也是當(dāng)下研究熱點(diǎn)。單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的防控措施可分為物理、化學(xué)、生物措施或者聯(lián)合處理措施。

3.1 物理措施

近年來，物理控制措施不斷改進(jìn)，最初研究發(fā)現(xiàn)通過在設(shè)備表面鍍銅納米粒子膜層可以明顯對單核細(xì)胞增生李斯特菌與銅綠假單胞菌單菌的初期黏附具有顯著抑制效果[60]。隨著研究的深入，目前物理措施主要分為兩種，一種是光動力滅菌技術(shù)，另一種則是冷大氣等離子體滅菌技術(shù)。李紅愛等[61]將質(zhì)量濃度10 μg/mL亞甲基藍(lán)作為光敏劑，通過光動力滅菌技術(shù)，經(jīng)200 mW/cm2的可見光照射30 min后單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的失活率可達(dá)99.99%以上。姜黃素作為介導(dǎo)光動力學(xué)的滅活物質(zhì)也被發(fā)現(xiàn)能夠改變單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形態(tài)以及黏附能力，因此可以有效消除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜[62]。相比于光動力滅菌技術(shù)來說，冷大氣等離子體的研究更為廣泛。Kim等[63]應(yīng)用大氣等離子體噴射裝置對3 種不同材質(zhì)儲藏一段時間后形成的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜進(jìn)行3 種時間的處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 min處理后，單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜在任一材質(zhì)上的菌量都減少3～4（lg（CFU/cm2））。

此后冷大氣等離子體被進(jìn)一步應(yīng)用于單核細(xì)胞增生李斯特菌與其他菌株的混合菌膜處理中。Govaert等[64]對不同培養(yǎng)介質(zhì)、培養(yǎng)溫度、初始接菌量比例以及培養(yǎng)時間下的單核細(xì)胞增生李斯特菌與沙門氏菌兩菌菌膜進(jìn)行冷大氣等離子體處理并分析不同處理時間后的結(jié)果。隨后，該團(tuán)隊進(jìn)一步研究了冷大氣等離子體在不同放電方式、氧氣水平及輸入電壓下對單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌菌膜的滅活作用[65]。最后，他們嘗試運(yùn)用大氣等離子體預(yù)冷液處理單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜，結(jié)果表明該方法也具有很好的處理效能[66]。冷大氣等離子體對單核細(xì)胞增生李斯特菌及與熒光假單胞菌形成的菌膜也被證明具有較好的去除效果[67]。

以上物理防控措施能夠較好地去除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜，然而目前的研究較少，并且在食品加工工廠中的可操作性較差。另外，物理控制措施的機(jī)器成本也較高，并不能完全適應(yīng)商業(yè)化生產(chǎn)，還需要進(jìn)一步優(yōu)化與改進(jìn)。

3.2 化學(xué)措施

食品工廠消毒殺菌劑如季銨鹽消毒劑、氯溶液、次氯酸溶液、過氧乙酸等常用于工廠設(shè)備表面的化學(xué)消毒殺菌劑[68]。Poimenidou等[22]研究了商業(yè)殺菌劑的最小抑菌濃度以及去除菌膜濃度并且觀察各株單核細(xì)胞增生李斯特菌在72 h后菌膜對殺菌劑的抗性后發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成能力與最小抑菌濃度呈正相關(guān)，而菌膜形成能力越好，對殺菌劑的抗性也越大。

另外，其他具有殺菌消毒效果的化學(xué)試劑例如乙酸[69]、乳酸、次氯酸鈉以及乙酰丙酸加硫酸鈉混合殺菌劑[70]等對單核細(xì)胞增生李斯特菌混菌的殺菌效果也受到關(guān)注和研究。Lee等[69]運(yùn)用乙酸對單核細(xì)胞增生李斯特菌在兩種不同材質(zhì)表面形成的菌膜進(jìn)行不同時間處理的失活研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理60 s后菌膜菌量幾乎全部失活，而到180 s時細(xì)胞全部破壞。Chen Dong等[71]發(fā)現(xiàn)2%乳酸鈉加3%乳酸對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜滅活效力最好。Liu Fang等[70]對比了3-苯基乳酸、乳酸以及乙酰丙酸-硫酸鈉在不同濃度以及不同處理時間下對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的滅活作用。結(jié)果表明，3-苯基乳酸對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜甚至成熟菌膜都具有良好的滅活作用。然而，此研究中所有方法都不能完全去除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜。

化學(xué)防控措施是目前食品加工工廠中常用的消毒殺菌方法，雖然能夠去除較多的菌膜，但是本身具有一定毒性，這無疑對消費(fèi)者的安全具有一定風(fēng)險隱患。另外，單核細(xì)胞增生李斯特菌對化學(xué)消毒殺菌劑具有一定抗性和敏感性[72-73]，因此并不能完全去除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜。

3.3 生物措施

如表4所示，在當(dāng)前研究中，生物控制措施主要分為植物精油及其提取物、噬菌體、乳桿菌及其細(xì)菌素以及抑菌肽等。大量研究表明植物精油及其提取物對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜具有有效抑制效果。植物精油及其提取物能夠抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長，并且改變單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形狀。

表4 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜生物防控措施Table 4 Biocontrol measures of Listeria monocytogenes biofilm

除了植物精油及其提取物，噬菌體、乳桿菌及其細(xì)菌素以及抑菌肽也受到關(guān)注和研究。噬菌體可以侵襲細(xì)菌從而抑制細(xì)菌生長，同樣地，產(chǎn)細(xì)菌素的菌株也可以抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌生長并且破壞其菌膜的形狀，關(guān)于抑菌肽通過抑制細(xì)菌生長而減少單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的研究也在逐步進(jìn)行中。

生物控制措施作為較為安全且環(huán)保的方法逐漸引起研究者關(guān)注，然而生物防控措施對細(xì)菌控制的普適性以及精油的揮發(fā)氣味及效力、劑量與成本都有待評判。另外，關(guān)于抑菌肽和噬菌體的研究較少，需要進(jìn)一步研究對其抑菌效果以及對食品安全進(jìn)行評估。

3.4 聯(lián)合處理控制措施

冷大氣等離子體、化學(xué)消毒劑以及植物精油都被作為聯(lián)合處理措施之一進(jìn)行更好的菌膜去除。冷大氣等離子體可以結(jié)合其他化學(xué)或者生物控制措施從而提高其殺菌效果。Govaert等[97]發(fā)現(xiàn)對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜進(jìn)行冷大氣等離子體處理后加入過氧化氫可以更好地去除菌膜。而經(jīng)過等離子體處理后的包裝，加入細(xì)菌素衍生肽1018K6后可以有效減少單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜在工廠中形成的風(fēng)險[98]。

化學(xué)消毒劑也常與其他措施混用從而達(dá)到更好的殺菌效果。Ban等[99]將4 種消毒殺菌劑（次氯酸鈉、過氧化氫、碘化物以及氯化苯）與蒸汽加熱方式結(jié)合具有協(xié)同增效作用，其中蒸汽加熱20 s后使用質(zhì)量濃度20 mg/L碘化物消毒30 s可使測定菌量低于可檢測范圍。Rodríguez-López等[100]將鏈霉蛋白酶與氯化苯聯(lián)合可以更有效去除大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌兩菌晚期菌膜。乙二胺四乙酸與乳酸菌細(xì)菌素結(jié)合也具有協(xié)同增效的作用，然而兩者結(jié)合也并不能完全去除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜[101]。

在聯(lián)合處理控制措施中，植物精油常作為其中的措施之一。Smith等[102]將乳酸鏈球菌素（Nisin）或Nisin衍生物M21A與兩種食品級添加劑（檸檬酸與肉桂醛）混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M21A的效果更佳。檸檬醛精油配合納米乳液[103]的組合也可以有效抑制菌膜，其抑制率為83.51%。Vitanza等[104]發(fā)現(xiàn)冬季香薄荷精油和慶大霉素結(jié)合可以有效減少單核細(xì)胞增生李斯特菌形成并改變其菌膜形狀。然而，Tajik等[105]結(jié)合扎塔利亞多花波斯精油和紫外線照射模擬工廠環(huán)境下共同作用時卻發(fā)現(xiàn)，共同作用情況下單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜去除能力更弱，這可能是由于精油本身的強(qiáng)抗氧化性以及具有吸收紫外線的物質(zhì)削弱了紫外線對單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺滅，因此不建議將兩者混合使用。

除此之外，兩種生物措施的聯(lián)合處理也具有更好的抑菌膜效果。Pu Chuanfen等[106]研究了不同溫度下不同濃度的抗菌肽-幾丁質(zhì)膏體組合對單核細(xì)胞增生李斯特菌在冷凍雞肉凍融水中的抑制菌膜效果較好。表面活性劑與鼠李糖脂組成的生物表面活性劑也對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成具有抑制的效果[107]。

聯(lián)合處理的防控措施一定程度上可以有效去除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜，然而并非所有聯(lián)合處理都具有增效作用。因此選擇合適的防控措施組合才能夠更好地去除單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜。

4 結(jié) 語

本文首先對近5 年食品環(huán)境中采樣獲得的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成能力進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)采樣獲得的所有單核細(xì)胞增生李斯特菌都能夠形成菌膜，然而其形成能力有所不同；其次，本文概述了單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成的內(nèi)部因素和外部因素，并且發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相互作用，同時也發(fā)現(xiàn)不同因素下單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的轉(zhuǎn)移也各不相同；最后對單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜防控措施通過預(yù)防和控制兩個方面進(jìn)行闡述，其中控制措施中包括物理控制措施、化學(xué)控制措施、生物控制措施以及聯(lián)合處理控制措施。

單核細(xì)胞增生李斯特菌作為食品中重要的食源性致病菌受到了廣泛的關(guān)注和研究，在食品加工、運(yùn)輸、零售等環(huán)節(jié)中，單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的存在無疑是降低交叉污染的一大挑戰(zhàn)。針對于目前的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜研究展望如下：1）單核細(xì)胞增生李斯特菌各菌株之間的菌膜形成具有變異性，不同菌株形成菌膜的能力各有不同。因此，只研究單一的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株菌膜特性并不能完全概括整體單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌膜形成規(guī)律。所以，在研究中增加單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌株數(shù)量有利于更好地了解單核細(xì)胞增生李斯特菌在不同因素下的菌膜形成和轉(zhuǎn)移情況，由此給菌膜防控措施作理論參考；2）目前針對于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成的測定方法各有不同，且彼此之間并無關(guān)聯(lián)，除此之外，菌膜強(qiáng)弱評判標(biāo)準(zhǔn)也并未有統(tǒng)一的定論，不同的菌膜測定方法得出的數(shù)據(jù)不具有可比性，因此需統(tǒng)一菌膜強(qiáng)弱的評判標(biāo)準(zhǔn)以及建立起菌膜形成測定方法之間的關(guān)聯(lián)；3）針對于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜研究大多都處于實(shí)驗室模擬階段，然而，培養(yǎng)介質(zhì)的不同往往影響單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的形成量與結(jié)構(gòu)特征。同時，在復(fù)雜的食品微生物環(huán)境中，單核細(xì)胞增生李斯特菌常與其他菌株共同存在，產(chǎn)生互相作用。因此模擬真實(shí)食品介質(zhì)中單核細(xì)胞增生李斯特菌兩菌或多菌菌膜的形成與轉(zhuǎn)移更符合實(shí)際意義；4）目前關(guān)于單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的防控措施目前已有較多研究，但是大多研究只能盡可能地抑制菌膜，能夠完全清除菌膜又易于操作的方法鮮見報道。研究出一種更便捷更有效的防控措施是當(dāng)前急需進(jìn)一步探究的內(nèi)容；5）不同因素下單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成量的研究已經(jīng)開展，但是菌膜形成的機(jī)理及相關(guān)影響因素對菌膜作用的機(jī)制等尚不明確，因此，基于其相關(guān)的機(jī)理和機(jī)制的研究，有助于提升后續(xù)菌膜防控的高效性。