基于紅藻多糖的生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

周 鳳，譚黃虹，孫慧敏，鄭兆娟，歐陽(yáng)嘉

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

生物質(zhì)是指通過(guò)光合作用而產(chǎn)生的各種有機(jī)體，廣泛分布于陸地和海洋。其中，以木質(zhì)纖維素為代表的陸生生物質(zhì)是研究最多的生物質(zhì)資源。但木質(zhì)纖維生物質(zhì)結(jié)構(gòu)致密、化學(xué)組成復(fù)雜多樣[1]，對(duì)環(huán)境中化學(xué)或生物降解都具有較強(qiáng)的抵抗能力，導(dǎo)致對(duì)其所含的碳水化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用較為困難。與陸生木質(zhì)纖維生物質(zhì)相比，以藻類(lèi)為代表的海洋生物質(zhì)具有以下4 個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：1）碳水化合物含量高，木質(zhì)素含量非常低，易于解聚；2）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，半乳聚糖是其碳水化合物主要組成成分，易于提?。?）對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求簡(jiǎn)單，不占用耕地，節(jié)約淡水資源，不需要農(nóng)藥和化肥；4）光合作用效率高，生長(zhǎng)周期短，海藻對(duì)CO2的固定能力高于陸地植物，可以更有效地減少溫室氣體；因此，藻類(lèi)也被稱(chēng)為第3代生物質(zhì)[2]。由于藻類(lèi)生物質(zhì)的上述優(yōu)點(diǎn)，以藻類(lèi)生物質(zhì)為原料制備食品添加劑、燃料乙醇、大宗化學(xué)品具有顯著優(yōu)勢(shì)。

紅藻是一種常見(jiàn)的大型海藻，根據(jù)其所含碳水化合物組成的差異，可以將其分為瓊膠類(lèi)和卡拉膠類(lèi)[3]。紅藻多糖的含量因生長(zhǎng)和環(huán)境條件而異，至少占其干質(zhì)量的40%～50%[4]。通過(guò)酶法或化學(xué)法選擇性水解紅藻多糖可以制備具有多種生物功能的高價(jià)值低聚糖，其中以酶法制備的瓊膠寡糖在保健品、食品和飼料添加劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景。而紅藻多糖多糖的完全水解則可以得到以D-半乳糖為主的混合糖溶液，不僅能用于制備生物乙醇、有機(jī)酸等發(fā)酵產(chǎn)品，也可用于制備具有益生元作用的稀有單糖，例如D-塔格糖等[5]。

本文圍繞紅藻生物質(zhì)，在介紹其分布和組成基礎(chǔ)上，重點(diǎn)圍繞其生物轉(zhuǎn)化方法和產(chǎn)品進(jìn)行了綜述，尤其是酶法制備瓊膠寡糖和3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖以及微生物發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品方面的研究進(jìn)展。

1 紅藻的分布和組成

1.1 分布

大型海藻是海洋中光合自養(yǎng)的低等植物，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，主要包括紅藻（Rhodophyta）、褐藻（Phaeophyta）、綠藻（Chlorophyta）3 種門(mén)類(lèi)。海藻的分布與海水溫度、光在海水中的穿透性及海藻所含色素的比例有關(guān)。紅藻在我國(guó)黃海、東海和南海均廣泛分布，它們絕大部分生活在近海岸的潮下帶和潮間帶區(qū)域[6]。由于紅藻具有藻紅素和藻藍(lán)素，其呈現(xiàn)特有的紅色或粉紅色，且可以吸收葉綠素?zé)o法吸收的青綠光，相較于綠藻和褐藻，紅藻可以在相對(duì)較深的海域生長(zhǎng)[7]。紅藻分兩個(gè)綱，即紅菜綱（Bangiophyceae）和真紅藻綱（Florideophyceae），大約有558 個(gè)屬、3 740 個(gè)種[8]。絕大多數(shù)紅藻分布在海水中，淡水中僅分布10多個(gè)屬、50多個(gè)種。石花菜屬（Gelidium）和江蘺屬（Gracilaria）是最主要的產(chǎn)瓊膠紅藻[6]。角叉菜屬（Chondrus）、卡帕藻屬（Kappaphycus）和麒麟菜屬（Eucheuma）是最主要的產(chǎn)卡拉膠紅藻[9]。由于紅藻含有用途廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的海藻多糖，我國(guó)沿岸各省份都已開(kāi)展了紅藻的規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖[6]。

1.2 組成成分

紅藻組成與陸生植物有很大不同。紅藻中含量最豐富的成分是多糖，包括纖維素、瓊膠和卡拉膠，另外還含有蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和極微量的木質(zhì)素[10]。表1列舉了不同文獻(xiàn)中石花菜（Gelidium amansii）的化學(xué)組成?？梢钥闯?，石花菜碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)非常高，其中，纖維素（其組成單體是葡萄糖）是質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)低的多糖，而組成單體包括半乳糖和3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖（3,6-anhydro-L-galactose，L-AHG）的瓊膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于纖維素。此外，石花菜中還有部分蛋白質(zhì)、少量的脂類(lèi)和灰分。

表1 石花菜化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of Gelidium amansii

在瓊膠類(lèi)紅藻中，瓊膠是含量最高的碳水化合物。瓊膠也稱(chēng)為瓊脂，是江蘺屬和石花菜屬紅藻細(xì)胞壁的主要成分，主要由瓊脂糖和瓊脂膠組成[15]。其中，瓊脂糖是由D-半乳糖和L-AHG通過(guò)α-1,3-和β-1,4-糖苷鍵交替連接組成的線形鏈狀多糖分子（圖1A）[16]；瓊脂膠主鏈結(jié)構(gòu)與瓊脂糖類(lèi)似，其分子質(zhì)量小于瓊脂糖，C2、C4或C6位置含有大量的酸性修飾基團(tuán)，如硫酸、丙酮酸、糖醛酸等，也存在甲基化修飾，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，在各文獻(xiàn)報(bào)道中不太統(tǒng)一[17]。瓊膠的凝膠化作用主要是因?yàn)榄傊堑拇嬖?，瓊脂膠的凝膠形成能力很差，較高的L-AHG含量和較低的硫酸基含量有助于得到良好的凝膠品質(zhì)[16]。瓊脂糖和瓊脂膠的比例因種屬來(lái)源和收獲季節(jié)而不同。例如石花菜屬和雞毛菜屬（Pterocladia）紅藻的瓊脂糖含量高于江蘺屬，而江蘺屬一般含有較高的硫酸酯，硫酸酯的存在會(huì)減弱凝膠強(qiáng)度，因此瓊脂的凝膠能力及強(qiáng)弱取決于品種來(lái)源及其中硫酸酯含量等18]。

圖1 瓊脂糖（A）和3 種典型卡拉膠（B）的結(jié)構(gòu)[16]Fig. 1 Structures of agarose (A) and three typical carrageenans (B)[16]

在卡拉膠類(lèi)紅藻中，卡拉膠是含量最高的碳水化合物。卡拉膠，又稱(chēng)角叉菜膠、鹿角菜膠，是角叉菜屬和麒麟菜屬紅藻細(xì)胞壁的主要成分[19]?？ɡz是由D-半乳糖和3,6-內(nèi)醚-D-半乳糖通過(guò)α-1,3-和β-1,4-糖苷鍵交替連接組成的含有硫酸酯基團(tuán)的線性高分子多糖，其硫酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為15%～40%。根據(jù)其硫酸基的數(shù)量、連接位置和是否含有3,6-內(nèi)醚鍵，卡拉膠可進(jìn)一步分類(lèi)為λ、κ和ι等類(lèi)型[20]（圖1B）。硫酸酯基團(tuán)和3,6-內(nèi)醚鍵對(duì)卡拉膠的理化性能影響非常大，尤其是硫酸酯基團(tuán)，卡拉膠的凝膠形成、凝膠性能、流變學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用特性都與這兩者相關(guān)[21]。硫酸酯基團(tuán)以共價(jià)鍵與半乳吡喃糖基團(tuán)上的C2、C4或C6相連接，導(dǎo)致卡拉膠帶有較強(qiáng)的負(fù)電性，一般認(rèn)為硫酸酯含量越高越難形成凝膠；3,6-內(nèi)醚醚橋鍵即為硫酸酯基團(tuán)脫除C6與C3位羥基形成的[21]。這3 種不同類(lèi)型的卡拉膠中，κ型卡拉膠含有最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸酯（25%～30%）和最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3,6-內(nèi)醚-D-半乳糖（28%～35%），這使得其能夠在鉀離子環(huán)境中形成最大強(qiáng)度和硬度的凝膠。相反，λ型卡拉膠的硫酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)很高（32%～39%），不含內(nèi)醚鍵，使得其幾乎沒(méi)有凝膠形成能力，只起增稠作用[22]。

2 利用紅藻多糖制備具有生理活性的瓊膠寡糖和L-AHG

2.1 瓊膠寡糖

從紅藻中提取的瓊膠黏度高、水溶性低、不易被吸收，因此在應(yīng)用方面受到較大限制[23]。為了拓寬瓊膠的應(yīng)用范圍，可利用化學(xué)法或酶法將其降解，得到不同聚合度的瓊膠寡糖[24]。瓊膠寡糖水溶性好、利于人體吸收、功能多樣，是一種新型的海洋功能性低聚糖[23]。

瓊膠寡糖又稱(chēng)瓊膠低聚糖，是瓊膠多糖經(jīng)水解后聚合度為2～10的低聚糖。瓊膠寡糖分為瓊寡糖（agarooligosaccharides，AOSs）和新瓊寡糖（neoagarooligosaccharides，NAOSs）兩個(gè)系列[25]，其中AOSs以L-AHG為還原端，D-半乳糖為非還原端，以瓊二糖為重復(fù)單位，通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成；而NAOSs以D-半乳糖為還原端，L-AHG為非還原端，以新瓊二糖為重復(fù)單位，通過(guò)α-1,3-糖苷鍵連接而成（圖2）。這些瓊膠寡糖不僅具有功能性低聚糖的一般特征，還具有許多普通寡糖無(wú)法替代的生理活性，是極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的功能性低聚糖。例如瓊膠寡糖具有抗癌、抗氧化、保肝、抗腫瘤、抗炎癥、增強(qiáng)免疫、預(yù)防糖尿病、美白保濕[26-27]和α-葡萄糖苷酶抑制活性[28-29]等，因此可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、化妝、食品和飼料添加劑等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的化學(xué)降解法制備瓊膠寡糖存在反應(yīng)條件難以控制、產(chǎn)物分析和純化復(fù)雜、化學(xué)試劑回收困難、對(duì)環(huán)境污染大等問(wèn)題。而酶法利用瓊膠酶降解瓊膠多糖制備各種瓊膠寡糖，反應(yīng)條件溫和、催化效率高、無(wú)污染、底物專(zhuān)一性好，可以選擇性地切斷瓊膠糖鏈上的糖苷鍵，具有更好的應(yīng)用前景。

瓊膠酶是可以將瓊膠多糖降解為瓊膠寡糖的一組糖苷水解酶[30]，依據(jù)水解糖苷鍵位點(diǎn)的不同，瓊膠酶分為α-瓊膠酶（EC 3.2.1.158）和β-瓊膠酶（EC 3.2.1.81）[31]。α-瓊膠酶斷裂α-1,3糖苷鍵產(chǎn)生以瓊二糖為基本單位的AOSs；β-瓊膠酶斷裂β-1,4糖苷鍵產(chǎn)生以新瓊二糖為基本單位的NAOSs[31]。α-瓊膠酶水解瓊膠的終產(chǎn)物為瓊四糖；β-瓊膠酶水解瓊膠的終產(chǎn)物大多為新瓊二糖[32-33]、新瓊四糖[34]和新瓊六糖等[35]。由于可利用的α-瓊膠酶種類(lèi)少，目前使用的瓊膠酶多為β-瓊膠酶。海洋細(xì)菌（如Pseudoalteromon asatlantica和Saccharophagus degradans2-40）的主要酶系是β-瓊膠酶系，含有內(nèi)切型β-瓊膠酶和外切型β-瓊膠酶，其酶切產(chǎn)物分別為NAOSs和新瓊二糖[36-37]。瓊脂糖水解具體過(guò)程如圖2所示，α-瓊膠酶或酸預(yù)處理可在L-AHG殘基和D-半乳糖殘基之間切割瓊脂糖的α-1,3糖苷鍵，生成還原端帶有L-AHG殘基的AOSs，例如瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖。β-瓊膠酶切割D-半乳糖殘基和L-AHG殘基之間的β-1,4糖苷鍵，從而產(chǎn)生在其還原端帶有半乳糖殘基的NAOSs，例如新瓊二糖、新瓊四糖和新瓊六糖。

圖2 生物法制備瓊膠寡糖和L-AHG的反應(yīng)途徑[26]Fig. 2 Reaction path for the conversion of agarose into agarose-derived oligosaccharides and L-AHG[26]

除了篩選自然界中各種天然微生物生產(chǎn)瓊膠酶外，研究者也利用基因工程手段將瓊膠酶編碼基因克隆至大腸桿菌等常見(jiàn)產(chǎn)酶菌株，用于異源生產(chǎn)各種水解活性不同的瓊膠酶。例如于文功等[38-39]將來(lái)源于海洋細(xì)菌Pseudoalteromonassp. CY24的瓊膠酶基因agaA和agaB分別在大腸桿菌中表達(dá)，其中，瓊膠酶AgaA的水解產(chǎn)物主要為聚合度4或6的NAOSs，而瓊膠酶AgaB則可將瓊膠水解為37%的新瓊八糖、32%的新瓊十糖和17%的新瓊十二糖；學(xué)者們從海洋細(xì)菌Agarivorans gilvusWH0801中克隆得到agWH50A[40]、agWH50B[41]、agWH50C[42]等數(shù)個(gè)編碼瓊膠酶的基因，將其分別在大腸桿菌中表達(dá)，這些瓊膠酶能夠降解瓊膠獲得新瓊二糖、新瓊四糖等不同聚合度的瓊膠寡糖。

2.2 3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖

L-AHG具有消炎、美白、保濕以及預(yù)防和治療色素沉著等性能，可應(yīng)用于醫(yī)療、制藥和食品行業(yè)。推測(cè)瓊膠寡糖的多種生物活性主要是由于L-AHG的存在[43]。

酶法或化學(xué)法結(jié)合酶法都可用于L-AHG的制備。對(duì)于酶法而言，該過(guò)程涉及外切型β-瓊膠酶I、外切型β-瓊膠酶II以及新瓊二糖水解酶（neoagarobiose hydrolase，NABH）（EC 3.2.1.159）等多種類(lèi)型的水解酶類(lèi)[44]。首先，經(jīng)由外切型β-瓊膠酶I斷裂瓊脂的β-1,4-糖苷鍵生成NAOSs，后者進(jìn)一步被外切型β-瓊膠酶II降解為新瓊二糖[45]，最后，NAOSs水解酶或NABH將新瓊二糖水解成D-半乳糖和L-AHG[46-47]。

化學(xué)法結(jié)合酶法制備L-AHG時(shí)，主要分為兩個(gè)階段，先用稀酸或有機(jī)弱酸等化學(xué)試劑水解瓊膠，瓊膠的α-1,3-糖苷鍵更易斷裂，得到AOSs，之后必須結(jié)合酶法制備L-AHG，因?yàn)長(zhǎng)-AHG在酸性環(huán)境下極易被降解為5-羥甲基糠醛（5-(hydroxymethyl) furan-2-carbaldehyde，HMF）[48-49]。當(dāng)外切型β-瓊膠酶II作用于AOSs時(shí)，其能夠特異性切割A(yù)OSs的β-1,4-糖苷鍵，最終生成瓊?cè)呛托颅偠荹48]。新瓊二糖可進(jìn)一步被NABH水解成L-AHG和D-半乳糖[46-47]。

但是，上述過(guò)程中生成的瓊?cè)遣荒鼙怀Ｒ?jiàn)的β-瓊膠酶或NABH進(jìn)一步水解。Lee等[48-49]發(fā)現(xiàn)了一種由海洋弧菌Vibriosp. EJY3產(chǎn)生的新型瓊膠降解β-半乳糖苷酶（agarolyticβ-galactosidase，ABG），其可以將瓊?cè)撬鉃镈-半乳糖和新瓊二糖，然后利用NABH水解新瓊二糖生成L-AHG和D-半乳糖（圖2）。這種特殊的瓊膠降解β-半乳糖苷酶不能水解乳糖等常見(jiàn)的β-半乳糖苷酶底物，只能水解釋放AOSs非還原端的半乳糖殘基，這與來(lái)源于大腸桿菌等微生物的常見(jiàn)β-半乳糖苷酶明顯不同[48,50]。

3 紅藻多糖制備乙醇和有機(jī)酸

紅藻的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（最高可占其干質(zhì)量的74%左右）高于褐藻和綠藻的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（最高分別占其干質(zhì)量的70%和65%左右）[51]，更適合應(yīng)用于生物乙醇、有機(jī)酸和功能性食品制備等領(lǐng)域。而微生物發(fā)酵只能利用單糖，所以需要對(duì)紅藻進(jìn)行預(yù)處理和糖化。預(yù)處理可破壞紅藻多糖結(jié)構(gòu)，增加底物在水中的溶解度，增加酶對(duì)底物的可及性[52]，之后通過(guò)糖化使紅藻多糖（如瓊膠寡糖）解聚，獲得可發(fā)酵單糖。

3.1 紅藻預(yù)處理和糖化

3.1.1 預(yù)處理

與木質(zhì)纖維素相比，紅藻中木質(zhì)素的含量較低或幾乎沒(méi)有，使得預(yù)處理過(guò)程更簡(jiǎn)單、成本更低。目前，紅藻最常用的預(yù)處理方法包括物理（例如研磨和微波預(yù)處理）、水熱（例如熱水萃?。┖突瘜W(xué)預(yù)處理（例如堿改性）。

3.1.1.1 物理預(yù)處理

物理預(yù)處理被認(rèn)為是最有效的預(yù)處理方法，其通過(guò)破壞紅藻細(xì)胞來(lái)增加酶的接觸表面積，從而增加酶對(duì)底物的可及性。紅藻預(yù)處理的物理方法可分為研磨預(yù)處理和微波預(yù)處理[53]。研磨預(yù)處理使得紅藻細(xì)胞壁中的碳水化合物在水解過(guò)程中與化學(xué)催化劑及酶能夠充分接觸。微波作為替代加熱源，已被廣泛用于生物質(zhì)原料的預(yù)處理過(guò)程中，包括木質(zhì)纖維素、微藻和大型藻類(lèi)[54]。微波預(yù)處理對(duì)紅藻非常有效，因?yàn)榧t藻的含水量相對(duì)較高，這使得微波能量能夠加熱紅藻中的水分[55]，微波輻射產(chǎn)生的內(nèi)部熱量導(dǎo)致紅藻細(xì)胞破裂，碳水化合物暴露于水相中。

3.1.1.2 水熱預(yù)處理

熱水萃取是最常用的水熱預(yù)處理方法，其操作簡(jiǎn)單。由于在85 ℃以上的水中，瓊膠和卡拉膠的溶解度增加，所以該方法可以用來(lái)提取紅藻中的瓊膠及卡拉膠[54]。Lemus等[56]為了從紅藻中提取瓊脂，將3 g干燥和研磨的樣品浸泡在150 mL蒸餾水中，然后在121 ℃下高壓滅菌3 h。提取瓊脂后，提取的混合物用粗棉布過(guò)濾，除去主要由纖維素組成的不溶性纖維。毛細(xì)管藻（P. capillacea）、花毛藻（G. floridanum）和鋸齒藻（G. serrulatum）的瓊脂產(chǎn)量分別占總干生物質(zhì)量的32.1%、31.7%和33.0%。而卡拉膠提取方法比瓊膠更復(fù)雜，因此，最佳提取方法因卡拉膠植物種類(lèi)的不同而不同。通常情況下，卡拉膠通過(guò)熱水萃取、過(guò)濾，然后用乙醇或氯化鉀沉淀。

3.1.1.3 化學(xué)預(yù)處理

化學(xué)預(yù)處理（例如堿改性）可減少多糖中的帶電基團(tuán)，使得瓊膠或卡拉膠凝膠強(qiáng)度增加，也可除去木質(zhì)素等非多糖組分。用氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿性試劑進(jìn)行堿改性，并輔以水熱預(yù)處理。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氫氧化鈉溶液在85 ℃水中堿化2 h后，其凝膠強(qiáng)度比115 ℃水熱提取2 h提高6 倍以上[57]。在70 ℃下，每克甘蔗用1 g亞氯酸鈉和0.2 mL乙酸處理30 min后，木質(zhì)素被氧化并溶解在溶液中，同時(shí)沒(méi)有任何碳水化合物顯著損失[58]。

3.1.2 糖化

在瓊膠類(lèi)紅藻中，瓊脂糖具有線性結(jié)構(gòu)，目前大多數(shù)糖化方法都是針對(duì)瓊脂糖開(kāi)發(fā)的。而卡拉膠類(lèi)紅藻的主要多糖成分——卡拉膠具有復(fù)雜的多糖結(jié)構(gòu)，并且作用于卡拉膠的酶種類(lèi)有限，目前有κ-卡拉膠酶和ι-卡拉膠酶等，這些酶是內(nèi)切型水解酶，作用于卡拉膠的β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生新卡拉膠低聚糖和新卡拉二糖[10]。目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠裂解新卡拉二糖α-1,3-糖苷鍵的酶，所以無(wú)法使用卡拉膠生產(chǎn)單糖。

最常見(jiàn)的3 種瓊脂糖糖化方法分別是酸水解、酶糖化以及先酸水解后酶糖化[5]。在高溫下使用稀酸（如硫酸、乙酸）對(duì)紅藻或瓊脂糖進(jìn)行酸水解是一種簡(jiǎn)單而廉價(jià)的糖化方法。然而，在這個(gè)過(guò)程中，單體己糖、D-半乳糖和L-AHG易于進(jìn)一步降解為HMF，尤其是L-AHG，對(duì)酸非常敏感[59]。HMF是一種常見(jiàn)的微生物發(fā)酵抑制劑，能夠嚴(yán)重影響下游微生物發(fā)酵過(guò)程。酸水解的缺陷在于，一方面酸會(huì)腐蝕設(shè)備，且需要在下游微生物加工之前進(jìn)行中和[60]；另一方面，在沒(méi)有任何化學(xué)預(yù)處理的情況下，僅依靠酶糖化，所得單糖含量非常少，這主要是由于在水中作為反應(yīng)底物的瓊脂糖溶解度很低。為了克服單獨(dú)使用酸或酶進(jìn)行瓊脂糖水解的缺陷，研究者開(kāi)發(fā)了先酸水解后酶糖化的組合水解方法。在該過(guò)程中，先通過(guò)弱酸（如醋酸）使瓊脂糖的α-1,3-糖苷鍵被酸催化斷裂，形成AOSs；之后通過(guò)聯(lián)合使用β-瓊膠酶II和NABH催化生成L-AHG和D-半乳糖[49,59]。

3.2 乙醇生產(chǎn)

紅藻的高碳水化合物含量使其具有制備生物乙醇的巨大潛力。Kim等[61]以瓊脂糖為底物，研究了其水解產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)生物乙醇的可行性。首先通過(guò)乙酸液化瓊脂糖，得到聚合度大于12的瓊膠低聚糖，之后在3 種β-瓊膠酶（Aga16B、Aga50D、DagA）和NABH的催化下糖化，得到D-半乳糖用于乙醇發(fā)酵。30 g/L瓊脂糖經(jīng)稀酸液化和同步糖化發(fā)酵后，可產(chǎn)出質(zhì)量濃度為4.4 g/L的乙醇。Park等[10]以石花菜為底物，經(jīng)稀硫酸水解得到D-半乳糖用于乙醇發(fā)酵，其著重考察了分批水解和連續(xù)水解過(guò)程中抑制物（HMF、甲酸、乙酰丙酸）的產(chǎn)生規(guī)律及對(duì)后續(xù)乙醇發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)連續(xù)水解產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物較少，更利于后續(xù)發(fā)酵，含質(zhì)量濃度72.2 g/L可發(fā)酵糖（D-葡萄糖和D-半乳糖）的水解液最終可生產(chǎn)質(zhì)量濃度為27.6 g/L的乙醇。

雖然與木質(zhì)纖維素相比，紅藻糖化相對(duì)簡(jiǎn)單，但紅藻碳水化合物的乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)效率明顯低于木質(zhì)纖維素。這是因?yàn)榧t藻含有大量不可發(fā)酵糖[61-62]。在紅藻水解產(chǎn)物中的3 種主要單糖（L-AHG、D-半乳糖和D-葡萄糖）中，D-葡萄糖最容易被微生物利用，D-葡萄糖快速消耗完全后D-半乳糖才開(kāi)始被利用。盡管L-AHG是紅藻水解液中含量極為豐富的單糖，但其不被任何工業(yè)微生物發(fā)酵，如常見(jiàn)的釀酒酵母、卡斯酒香酵母和產(chǎn)乙醇重組大腸桿菌等[10]。此外，紅藻水解過(guò)程產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物（HMF、甲酸、乙酰丙酸等）也會(huì)導(dǎo)致乙醇產(chǎn)率降低。

3.2.1 代謝工程提高生物乙醇產(chǎn)量

紅藻水解液中D-半乳糖的含量遠(yuǎn)高于D-葡萄糖，雖然釀酒酵母等工業(yè)乙醇發(fā)酵菌株都能利用D-半乳糖，但D-半乳糖發(fā)酵的乙醇得率和產(chǎn)率都低于D-葡萄糖。D-半乳糖的有效利用對(duì)提高乙醇發(fā)酵得率和產(chǎn)率至關(guān)重要[63-65]。常見(jiàn)的乙醇發(fā)酵菌株細(xì)胞內(nèi)的半乳糖代謝途徑均為L(zhǎng)eloir途徑[63]。Bro等[63]通過(guò)代謝工程對(duì)釀酒酵母半乳糖代謝的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行改造，加快了半乳糖的消耗速率。Ostergaard等[65]通過(guò)消除半乳糖代謝系統(tǒng)的3 個(gè)已知負(fù)調(diào)控因子（GAL6、GAL80和MIG1），使半乳糖攝取速率提高了41%，乙醇得率提高了70%。過(guò)表達(dá)磷酸葡萄糖變位酶PGM2能顯著提高Leloir途徑代謝流，從而使得半乳糖吸收速率提高70%，乙醇得率也比未改造原始菌株提高61%[63]。此外，Lee等[66]利用反向代謝工程提高釀酒酵母的乙醇發(fā)酵能力，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)磷酸甘露聚糖突變酶SEC53和轉(zhuǎn)錄抑制因子TUP1可以顯著提高釀酒酵母的半乳糖代謝能力和乙醇產(chǎn)量。此外，過(guò)表達(dá)TUP1還顯著縮短了碳源從D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-半乳糖后的發(fā)酵延滯時(shí)間。

紅藻水解液中同時(shí)存在D-半乳糖和D-葡萄糖，可消除D-葡萄糖抑制作用，從而顯著提高乙醇生產(chǎn)效率。Ha等[67]在釀酒酵母中引入纖維二糖利用途徑，并通過(guò)表達(dá)纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使得半乳糖和纖維二糖同時(shí)進(jìn)入釀酒酵母，然后纖維二糖被胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶水解為D-葡萄糖，從而避免了對(duì)D-半乳糖的代謝抑制。與單糖發(fā)酵或葡萄糖和半乳糖兩段順序發(fā)酵相比，纖維二糖和半乳糖共發(fā)酵的乙醇產(chǎn)率顯著提高，此外，由于反應(yīng)中不需要添加β-葡萄糖苷酶，從而降低了酶成本；不過(guò)，該實(shí)驗(yàn)僅利用上述方法考察了纖維二糖和D-半乳糖的共發(fā)酵情況，并未以紅藻生物質(zhì)為底物進(jìn)行發(fā)酵。

3.2.2L-AHG生產(chǎn)的發(fā)酵途徑改造

L-AHG是紅藻水解后主要單糖組分，但能利用L-AHG的微生物極為少見(jiàn)。以紅藻作為可再生生物質(zhì)制備乙醇的關(guān)鍵問(wèn)題之一就是將不可發(fā)酵糖L-AHG生物轉(zhuǎn)化為常見(jiàn)的糖代謝中間體。研究人員發(fā)現(xiàn)海洋弧菌Vibriosp. EJY3能夠以L-AHG作為唯一碳源生長(zhǎng)代謝，通過(guò)對(duì)Vibriosp. EJY3的代謝物和轉(zhuǎn)錄組分析，首次發(fā)現(xiàn)了L-AHG的關(guān)鍵代謝中間體，即3,6-脫水半乳糖酸（3,6-anhydrogalactonate，AHGA）和2-酮基-3-脫氧-半乳糖酸（2-keto-3-deoxy-galactonate，KDGal）及其相應(yīng)的酶，包括AHG脫氫酶和AHGA環(huán)異構(gòu)酶[68-69]。L-AHG的分解代謝途徑開(kāi)始于AHG脫氫酶將L-AHG的醛基氧化為AHGA；然后，AHGA被AHGA環(huán)異構(gòu)酶異構(gòu)化，形成KDGal，后者是工業(yè)微生物中常見(jiàn)的代謝中間體，可以經(jīng)半乳糖Deley-Doudoroff途徑被進(jìn)一步分解利用（圖3）[68-69]。雖然L-AHG是一種在陸地植物中不存在的稀有糖，但它的分解代謝途徑相對(duì)簡(jiǎn)單，通過(guò)L-AHG脫氫和AHGA環(huán)異構(gòu)化兩步酶反應(yīng)即可匯入常規(guī)碳代謝途徑。Yun等[69]將上述L-AHG代謝途徑導(dǎo)入產(chǎn)乙醇的大腸桿菌KO11中，以富含D-半乳糖和L-AHG的瓊脂糖水解液為底物進(jìn)行發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了24%。

圖3 D-半乳糖的代謝途徑[70-72]Fig. 3 Metabolic pathway of D-galactose[70-72]

3.3 有機(jī)酸生產(chǎn)

紅藻還可用于有機(jī)酸的制備，包括琥珀酸、檸檬酸等[73]，但目前這方面的研究相對(duì)較少。琥珀酸可應(yīng)用于制藥、食品、化工等領(lǐng)域，是一種具有巨大應(yīng)用潛力的平臺(tái)化學(xué)品。Olajuyin等[74]對(duì)紅藻Palmaria palmate進(jìn)行預(yù)處理和酶解，得到質(zhì)量濃度12.6 g/LD-葡萄糖和質(zhì)量濃度18.0 g/LD-半乳糖的混合水解液，利用重組大腸桿菌KLPPP對(duì)其發(fā)酵可獲得較高的琥珀酸質(zhì)量濃度（22.4 g/L）；值得一提的是，該菌株以D-半乳糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的得率約是以葡萄糖為底物時(shí)的3 倍。檸檬酸也是一種重要的工業(yè)有機(jī)酸，在食品、制藥和金屬行業(yè)有廣泛應(yīng)用。Ramesh等[75]考察了以紅藻Gelidiella acerosa作為碳源生產(chǎn)檸檬酸的可行性，發(fā)現(xiàn)利用黑曲霉以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖的粗紅藻粉（無(wú)需水解）生產(chǎn)檸檬酸時(shí)，在pH 3.0時(shí)發(fā)酵所得檸檬酸質(zhì)量濃度為50 g/L。

4 結(jié) 語(yǔ)

長(zhǎng)期以來(lái)，相較于陸生生物質(zhì)，以紅藻作為可再生生物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化利用的研究相對(duì)較少。自從紅藻中不可發(fā)酵糖L-AHG的分解代謝途徑被闡明以后，以紅藻作為再生生物質(zhì)來(lái)源用于生物燃料或生物基產(chǎn)品的制備，其經(jīng)濟(jì)可行性大為提高。挖掘鑒定更多的L-AHG代謝基因/酶，并采用代謝工程的方法改造工業(yè)微生物，提升其代謝L-AHG的能力，有望為紅藻的高效利用打開(kāi)新的大門(mén)。此外，紅藻制備的瓊膠寡糖具有多種生物活性，在醫(yī)藥、保健、化妝、食品和飼料添加劑等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但其活性機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。而關(guān)于卡拉膠類(lèi)紅藻生物質(zhì)利用的報(bào)道目前較少，且現(xiàn)有報(bào)道表明，還不能從卡拉膠中生產(chǎn)單體糖，需探索更多卡拉膠水解酶，尤其是能夠切割新卡拉二糖α-1,3-鍵連接的酶，以實(shí)現(xiàn)更多類(lèi)型紅藻的生物降解與利用。