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    商品海參溯源分析技術(shù)研究進(jìn)展

    2021-07-29 03:27:12蔣冰雪張曉梅何曉霞張九凱張鴻偉李兆杰薛長湖馮婷玉姜曉明
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:刺參海參組學(xué)

    蔣冰雪,張曉梅,何曉霞,張九凱,張鴻偉,*,李兆杰,薛長湖,,馮婷玉,姜曉明,,*

    (1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003;2.青島海關(guān)技術(shù)中心,山東 青島 266002;3.即墨海關(guān),山東 青島 266200;4.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;5.青島海洋食品營養(yǎng)與健康創(chuàng)新研究院,山東 青島 266000)

    由于食品安全問題、產(chǎn)品欺詐性貼標(biāo)行為層出以及消費(fèi)者獲知產(chǎn)地和生產(chǎn)方法的意愿逐漸增強(qiáng)[1],食品產(chǎn)品的溯源正成為全球消費(fèi)者、海參行業(yè)從事者和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的主要關(guān)注點(diǎn)。自1950年以來,水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量一直在穩(wěn)步增長,其中海參作為重要的海產(chǎn)品,全球產(chǎn)量近22萬 t,總產(chǎn)值超過70億 美元[2]。海參含有多種生物活性化合物,具有抗氧化[3]、抗癌[4]、抗炎[5]、抗血栓[6]、抗糖尿病[7]、抗肥胖[8]等作用,并可以提高學(xué)習(xí)能力和記憶力[9],因而深受消費(fèi)者喜愛。在貿(mào)易產(chǎn)品中,海參通常會(huì)經(jīng)過干制、切片、粉碎等處理,使得消費(fèi)者、經(jīng)銷商和監(jiān)管部門難以從外觀形態(tài)上對其種類、產(chǎn)地和生產(chǎn)方式進(jìn)行溯源。參種、產(chǎn)地、生產(chǎn)方式(如野生和養(yǎng)殖)不同會(huì)導(dǎo)致市面上不同的海參產(chǎn)品價(jià)格相差數(shù)十倍。為了牟取暴利,不誠信的商家會(huì)故意給海參產(chǎn)品貼上錯(cuò)誤的標(biāo)簽,如以低值海參冒充高值海參、偽造產(chǎn)地、養(yǎng)殖海參偽裝野生海參等[10]。這些欺詐行為除了影響海參行業(yè)的公信度之外,還易引發(fā)消費(fèi)者對海參產(chǎn)品安全、衛(wèi)生和真實(shí)性的擔(dān)憂,也對整體行業(yè)及消費(fèi)者利益造成不可挽回的損害[11]。因此,明確商品海參參種、產(chǎn)地和生產(chǎn)方式信息是保證消費(fèi)者對海參產(chǎn)品信任的必要條件。

    當(dāng)前,產(chǎn)品溯源體系建設(shè)分為監(jiān)管、控制和檢測分析三大部分。溯源監(jiān)管主要體現(xiàn)在法律法規(guī)、政策層面?!吨腥A人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》(2018修正)第五條規(guī)定禁止偽造或者冒用認(rèn)證標(biāo)志等質(zhì)量標(biāo)志;禁止偽造產(chǎn)品的產(chǎn)地,偽造或者冒用他人的廠名、廠址;禁止在生產(chǎn)、銷售的產(chǎn)品中摻雜、摻假,以假充真,以次充好,并對相應(yīng)違法行為列有明確的懲罰措施。溯源控制主要體現(xiàn)在流程追溯層面,即采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和方法以追蹤從原料供應(yīng)、生產(chǎn)加工到流通消費(fèi)的全過程,保證這些過程中的環(huán)節(jié)需要符合相關(guān)質(zhì)量管理體系標(biāo)準(zhǔn),包括ISO9000認(rèn)證、危險(xiǎn)分析和關(guān)鍵點(diǎn)控制(hazard analysis critical control point,HACCP)、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)操作程序(sanitation standard operation procedures,SSOP)、良好操作規(guī)范(good manufacturing practice,GMP)等。在溯源控制過程中,盡管射頻識別(radio frequency identification,RFID)[12]和新近的區(qū)塊鏈[13-14]技術(shù)對流程信息記錄和留存提供了高可控性的技術(shù)保障,但對于產(chǎn)品的內(nèi)在本質(zhì)特征則無法提供相關(guān)的數(shù)據(jù)信息。溯源分析作為監(jiān)管和控制的技術(shù)支撐,為監(jiān)管和控制提供技術(shù)驗(yàn)證,是溯源體系鏈條中不可或缺的重要部分,溯源分析不僅可以通過技術(shù)證據(jù)改進(jìn)和完善監(jiān)管與控制環(huán)節(jié),而且還可以作為監(jiān)管和控制環(huán)節(jié)的有效補(bǔ)充和驗(yàn)證,甚至在某些情況下起到推動(dòng)另外兩個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)展的作用,更為重要的是,溯源分析技術(shù)可以在不同水平呈現(xiàn)產(chǎn)品的內(nèi)在本質(zhì)特征,可有效補(bǔ)充溯源控制環(huán)節(jié)的信息溝壑,在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、積累和完善中與溯源控制技術(shù)聯(lián)合實(shí)現(xiàn)全流程、多維度、高容量的產(chǎn)品溯源信息采集體系的建立。

    近年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷發(fā)展,目前DNA分析、元素分析、穩(wěn)定同位素分析和組學(xué)分析等技術(shù)方法在商品的溯源分析中已經(jīng)得到了實(shí)際應(yīng)用。本文針對商品海參的摻假現(xiàn)狀,綜述了相關(guān)技術(shù)在商品海參溯源分析中的應(yīng)用情況及最新進(jìn)展,以期為這一領(lǐng)域的研究提供參考。

    1 商品化食用海參的分類分布及生產(chǎn)方式

    目前,全球已知的海參種類達(dá)到1 200多種,其中大約40 種為食用海參[15]。熱帶海域海參產(chǎn)量約占總產(chǎn)量的86%,溫帶海域海參主要分布在太平洋沿岸,主要以加州擬刺參(Parastichopus californicus)和仿刺參(Apostichopus japanicus)為主[16]。我國海參種類超過140 種,具有食用價(jià)值的約20 種,具有較高的商品價(jià)值的有10多種,其中刺參的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值被視為最高[17]。目前,主要食用商品海參的生物學(xué)分類及地理分布見表1。

    表1 主要食用商品海參生物學(xué)分類及地理分布[18-20]Table 1 Main commercial edible sea cucumber species and their geographical distribution[18-20]

    在海參的生產(chǎn)方式上,早期的商品海參主要源自海捕的方式,但由于野生資源的有限性和消費(fèi)者對商品選擇的趨向性,人工養(yǎng)殖已成為食用海參供應(yīng)的主要生產(chǎn)方式,自20世紀(jì)90年代以來,在我國山東牟平和遼寧大連開始逐漸規(guī)?;B(yǎng)殖刺參,刺參養(yǎng)殖已經(jīng)突破傳統(tǒng)海域的限制,實(shí)現(xiàn)了“北參南養(yǎng)”和“東參西養(yǎng)”。北方主要養(yǎng)殖模式有池塘養(yǎng)殖、圍堰養(yǎng)殖、底播增殖、海底網(wǎng)箱養(yǎng)殖和大棚工廠化養(yǎng)殖等,南方則以浮筏吊籠養(yǎng)殖技術(shù)為主。此外,為了實(shí)現(xiàn)生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益的最大化,出現(xiàn)了參魚、參蝦、參貝藻混養(yǎng)等多種養(yǎng)殖模式[21]。

    2 商品海參溯源分析技術(shù)及研究進(jìn)展

    2.1 DNA分析

    由于DNA分析表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢,近10 年來其發(fā)展迅速,被廣泛應(yīng)用于食品產(chǎn)品溯源分析[22]。利用DNA圖譜鑒定食物中的動(dòng)物物種是理想的技術(shù)手段,因?yàn)镈NA的穩(wěn)定性強(qiáng),不受季節(jié)、環(huán)境和生物體狀態(tài)影響且相對耐高溫。隨著現(xiàn)代化儀器和商品化試劑盒的使用,大大縮短了DNA分析的檢測時(shí)間,使得分子標(biāo)記方法更加簡便快捷,同時(shí),自動(dòng)化檢測能夠提高操作的精準(zhǔn)度和重復(fù)性,防止交叉污染,使檢測過程更安全可靠。常見的DNA分析有基于核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)兩種標(biāo)記技術(shù),其中PCR被認(rèn)為更快、更準(zhǔn)確。DNA分析相關(guān)技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)比較見表2。盡管DNA分析作為物種溯源分析技術(shù)應(yīng)用相當(dāng)普遍,但如果沒有一個(gè)集中的公共數(shù)據(jù)庫,很難使用DNA分析作為檢測食品替代和判定標(biāo)簽合規(guī)性的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)方法[23]。

    表2 DNA檢測技術(shù)比較Table 2 Comparison of DNA analysis techniques

    用于物種溯源的PCR測序法通常稱為法醫(yī)信息核酸測序,常用的目標(biāo)片段包括Cytb、COI、16S rRNA等基因[31]。Wen Jing等[32]通過基于COI基因和16S rRNA基因的DNA條形碼技術(shù)對市售商品海參科樣品進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)有7 個(gè)樣品存在標(biāo)簽錯(cuò)誤現(xiàn)象(63.6%)。Wen Jing等[33]建立了一種物種特異性PCR方法來鑒定11 種海參,設(shè)計(jì)位于16S rRNA基因區(qū)大小為269~406 bp的11 個(gè)種特異性引物,其中使用引物16Sar和16Sbr,即使從每個(gè)參種的冷凍和干燥產(chǎn)品中也可以很容易地?cái)U(kuò)增出線粒體16S rRNA基因的570 bp片段,最終檢測出兩種冷凍海參存在參種欺詐情況。之后又使用該技術(shù)設(shè)計(jì)了10 個(gè)種特異性PCR引物用以鑒定10 種干制商品海參參種[34]。Lü Yingchun等[35]在692 bp的COI片段中找到限制性酶BamH I、KpnI、PstI、XbaI和Eco31 I的酶切位點(diǎn),采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)成功鑒別出仿刺參、梅花參、加州擬刺參、大西洋瓜參和子安福岡參5 種商品海參,并在10 種海參混合物中同時(shí)檢測到兩種海參。Zeng Ling等[36]用限制性內(nèi)切酶DdeI、HaeIII和StyI對16S rRNA線粒體基因的570 bp區(qū)域進(jìn)行酶切,通過所開發(fā)的PCR-RFLP方法成功鑒定了冷凍和干燥共19 種的海參產(chǎn)品,其中48%的產(chǎn)品標(biāo)簽有誤。線粒體DNA的高豐度使得其與核DNA相比可以進(jìn)行更有效的PCR擴(kuò)增,深加工產(chǎn)品中線粒體DNA會(huì)比核DNA存活時(shí)間長,使擴(kuò)增變得容易。然而,每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)在相同物種中,甚至同一個(gè)樣本體內(nèi)的組織之間都會(huì)發(fā)生變化,這使得線粒體基因不適合量化[37]。因此,在需要定量分析確保溯源分析正確性的情況下,核基因更為適合[38]。

    除了區(qū)分不同的參種,DNA分析還被應(yīng)用于海參的產(chǎn)地溯源。Yun Zhenyu等[39]采用PCR-RAPD技術(shù)和基因片段測序技術(shù)對來自遼寧大連、山東煙臺和山東威海3 個(gè)產(chǎn)地的仿刺參進(jìn)行遺傳關(guān)系和DNA多態(tài)性分析,結(jié)果表明,不同海域海參的基因差異特征明顯,由于威海和煙臺的地理位置相近,兩地的樣本親緣關(guān)系比大連更為密切。利用PCR-RAPD技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析可作為一種快速產(chǎn)地溯源的方法,但同一物種之間遺傳變異的確切原因尚未得到詳盡的研究,一些研究認(rèn)為這種變異是適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件造成的,而另一些研究則認(rèn)為是遺傳漂變造成的[40]。

    盡管諸如生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)和美國國立生物技術(shù)信息中心等數(shù)據(jù)庫不斷改進(jìn)完善以解決一些普遍性問題,可是標(biāo)準(zhǔn)化方法缺失的問題仍然存在[41]。不過,DNA分析仍然是海參參種溯源時(shí)最值得推薦的分析方法之一。然而,由于基于DNA的分析技術(shù)無法區(qū)分來自同一地點(diǎn)海參的養(yǎng)殖樣本和野生捕獲樣本,因此使用DNA分析很難進(jìn)行海參的生產(chǎn)方式溯源。最近,新興的基于基因組學(xué)的技術(shù)被應(yīng)用于食品溯源分析研究,研究人員試圖從特異性、靈敏性和重復(fù)性等方面改善傳統(tǒng)DNA技術(shù)的性能。這些方法包括下一代測序(next-generation sequencing,NGS)[42]、高分辨熔解(high-resolution melt,HRM)[43]、液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)[44]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[45]。NGS技術(shù)徹底改變了分析DNA的方式,極大地提高了通量,對于未知食品或者深加工食品的溯源有著重要意義[46],已經(jīng)應(yīng)用于肉類食品物種溯源[47]。DNA條形碼本質(zhì)上依賴于測序,為了克服這一缺點(diǎn),另一項(xiàng)研究將實(shí)時(shí)PCR與HRM分析結(jié)合起來,對對蝦的物種進(jìn)行了成功的溯源[48]。具有物種特異性寡核苷酸探針的DNA微陣列可快速進(jìn)行多物種溯源,這也將是海參DNA溯源分析技術(shù)的發(fā)展方向之一[49]。目前的研究還傾向于開發(fā)便于攜帶和現(xiàn)場檢測的DNA分析技術(shù),結(jié)合納米技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)研發(fā)的納米示蹤劑簡化了DNA分析步驟,不依賴專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的測序就可以實(shí)現(xiàn)物種溯源[50],對未來海參溯源分析技術(shù)的開發(fā)具有一定的啟發(fā)。

    2.2 元素分析

    電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)是一種檢測微量元素濃度的高精度分析技術(shù),具有精密度高、分析速度快、能夠多元素同時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)[51]。ICP-MS已用于食品溯源分析領(lǐng)域,并可區(qū)分海參的產(chǎn)地來源[52-53]。海參“沉積食性”的特點(diǎn)決定了其更加容易受到生長環(huán)境中水體和海底底泥的影響,對環(huán)境中各種無機(jī)元素進(jìn)行富集使得海參體內(nèi)微量元素呈現(xiàn)地域性差異。Liu Xiaofang等[54]采用ICP-MS技術(shù)對來自我國3 個(gè)海域(渤海、黃海、東海)的39 個(gè)海參樣品中15 種元素(Al、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Cd、Hg和Pb)進(jìn)行定量分析,并結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析和線性判別分析建立了分類模型,使用交叉驗(yàn)證程序評估該模型,顯示交叉驗(yàn)證率為100%,證實(shí)多元素分析用于海參產(chǎn)地溯源分析具有較高可行性。高岳等[55]收集了大連、青島、煙臺、福建4 個(gè)產(chǎn)地不同養(yǎng)殖方式(圈養(yǎng)、深海)的仿刺參,采用ICP-MS和原子吸收法測定刺參體壁中6 種元素(Mn、Cr、Cu、Al、P、Zn)含量,發(fā)現(xiàn)大連刺參Zn、Mn含量最高,煙臺刺參B、Cu含量最高,福建刺參Al、Cr含量最高,并且深海刺參體壁B、Cr和Cu含量均高于圈養(yǎng)刺參。

    為了使ICP-MS法成為區(qū)分海參產(chǎn)地和生產(chǎn)方式的標(biāo)準(zhǔn)方法,需要確定區(qū)分所依賴的元素。雖然ICP-MS技術(shù)可以測定大多數(shù)元素濃度,但一些研究還在不影響產(chǎn)地溯源分析的前提下盡量減少分析的元素?cái)?shù)量,ICP-MS的樣品前處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因此測定每個(gè)樣品中元素?cái)?shù)目越多,需要的分析時(shí)長就越長。此外,還需要構(gòu)建一個(gè)海參產(chǎn)地區(qū)域的基本概況數(shù)據(jù)庫,以便對樣本進(jìn)行精細(xì)比較,確定食品欺詐行為。

    2.3 穩(wěn)定同位素分析

    同位素是具有相同數(shù)量質(zhì)子但不同數(shù)量中子的元素,穩(wěn)定同位素分析(stable isotope analysis,SIA)通過同位素來區(qū)分樣本。一般來說,用于溯源的同位素有δ13C/δ12C、δ2H/δ1H、δ15N/δ14N、δ18O/δ16O[56]。當(dāng)穩(wěn)定同位素在營養(yǎng)鏈向上移動(dòng)時(shí),輕重同位素比率通過分流效應(yīng)被同化到動(dòng)物組織中[57]。對于海參而言,同位素分餾效應(yīng)受到產(chǎn)地、生產(chǎn)方式及種間差異等因素影響,由此可以對海參的產(chǎn)地和生產(chǎn)方式進(jìn)行溯源分析。

    周永亮[58]采集大連瓦房店市下轄的紅沿河鎮(zhèn)、謝屯鎮(zhèn)、永寧鎮(zhèn)、李官鎮(zhèn)和三臺象5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的刺參并進(jìn)行分析,結(jié)果顯示不同地區(qū)的刺參之間δ13C、δ15N值存在明顯差異,進(jìn)行判別分析的準(zhǔn)確率達(dá)到71.5%。Kang Xuming等[59]從中國秦皇島、大連、東營、青島和福建5 個(gè)地區(qū)收集76 只海參,研究分析這些海參中C、H、O、N的穩(wěn)定同位素比和組成,使用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)獲得了較高的識別率(93.4%),預(yù)測能力也高達(dá)89.5%。同時(shí),單體穩(wěn)定同位素分析技術(shù)(compound-specific isotope analysis,CSIA)已成為海參產(chǎn)地溯源分析的新工具。劉瑀等[60]測定并分析了黃渤海區(qū)域遼寧、山東兩地刺參氨基酸相對含量及其δ13C值,發(fā)現(xiàn)其中非必需氨基酸δ13C值差異顯著性高于必需氨基酸,由此選取Tyr和Ser的δ13C值作為指標(biāo)區(qū)分刺參產(chǎn)地,判別結(jié)果明顯優(yōu)于單一的氨基酸譜鑒別。之后,劉瑀等[61]通過此技術(shù)分析了大連轄區(qū)下的瓦房店、普蘭店、長??h等7 個(gè)地區(qū)刺參的氨基酸δ13C值,結(jié)果表明刺參中的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸的δ13C值表現(xiàn)出顯著差異,特別是非必需氨基酸不僅來源于食物,還可以通過自身合成,具有更高的多樣性,能表現(xiàn)出更獨(dú)特的信息特征。張旭峰在對刺參脂肪酸碳穩(wěn)定同位素組成的地域性差異研究中發(fā)現(xiàn),萊州、擔(dān)子島、牟平、瓦房店、皮口、長海島、獐子島、乳山、霞浦的刺參大部分脂肪酸的δ13C值表現(xiàn)出顯著性差異[62]。Liu Yu等[63]利用脂肪酸CSIA技術(shù)對中國沿海萊州、擔(dān)子島、牟平、乳山、瓦房店、皮口、長海島、獐子島和霞浦9 個(gè)地區(qū)A. japonicus樣品進(jìn)行產(chǎn)地鑒別,除了長海島和獐子島地區(qū)外,其他地區(qū)的樣品都可以得到有效區(qū)分,乳山、瓦房店和皮口樣品的δ13C值較高,而擔(dān)子島、牟平和長海島樣品的值較低。Zhao Xinda等[64]通過氨基酸的CSIA技術(shù)成功地鑒別了福建、遼寧、山東3 個(gè)省8 個(gè)采樣點(diǎn)的野生A. japonicus,結(jié)果表明,通過氨基酸的δ13C值區(qū)分此8 種樣品的總準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證率皆為100%,特別是δ13C Ser表現(xiàn)出顯著的區(qū)分能力。單一的穩(wěn)定同位素技術(shù)在海參溯源中的難度越來越大,研究表明,多種溯源分析技術(shù)相結(jié)合對溯源準(zhǔn)確率有顯著提高。

    除了產(chǎn)地溯源外,生產(chǎn)方式溯源也同樣重要。周永亮[58]對不同環(huán)境下生長的刺參進(jìn)行SIA,研究表明,同一采樣點(diǎn)成參δ13C值較人工養(yǎng)殖幼參高約2.5‰,δ15N值低約2.5‰,說明生長環(huán)境變化會(huì)帶來穩(wěn)定同位素值的明顯改變。Zhao Xinda等[64]收集瓦房店、長島、煙臺三地野生和養(yǎng)殖仿刺參,根據(jù)氨基酸δ13C值在PCA中可以很好地將野生與養(yǎng)殖海參區(qū)分開來,特別是Gly的δ13C值對不同生長方式區(qū)分效果顯著。然而,大多數(shù)研究必須結(jié)合其他方法來分析在穩(wěn)定同位素值無法區(qū)分的樣品。這些重疊可能是養(yǎng)殖飼料的相似、野生物種越境遷徙和人為污染造成。此外,季節(jié)性變化也會(huì)導(dǎo)致這些重疊的發(fā)生。由于穩(wěn)定同位素組成受到飼料和環(huán)境條件等因素的影響,人為控制這些因素有可能調(diào)控同位素組成。雖然考慮到成本,這類欺詐不太可能發(fā)生,但僅使用SIA很難發(fā)現(xiàn)此類欺詐案件。因此,將SIA與其他溯源分析技術(shù)結(jié)合有助于區(qū)分具有相同同位素特征的樣品。

    2.4 組學(xué)分析

    2.4.1 脂質(zhì)組學(xué)分析

    脂肪酸可以根據(jù)飽和度的不同分為飽和脂肪酸、一價(jià)多不飽和脂肪酸和多價(jià)多不飽和脂肪酸,多價(jià)不飽和脂肪酸又可分為n-6系和n-3系[65]。脂質(zhì)組學(xué)分析通常使用各種色譜或光譜學(xué)方法來確定樣品的脂肪酸組成[66]。雖然制備分析樣品所需時(shí)間較長,但它在產(chǎn)地來源和生產(chǎn)方式溯源方面顯示出很好的應(yīng)用前景。在海參產(chǎn)地溯源分析中,脂質(zhì)組學(xué)分析通常與SIA聯(lián)用[67]。

    海參產(chǎn)地的不同會(huì)導(dǎo)致海參脂肪酸組成差異。Azad等[68]在馬來西亞沙巴海參中并沒有檢測到二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA),其以飽和脂肪酸為主要脂肪酸,這與地中海海參中以多不飽和脂肪酸為主要脂肪酸具有明顯差異[69]。這可能由于馬來西亞沙巴地處赤道附近,氣候溫暖和常年的光照導(dǎo)致氧氣溶解度下降并且不利于去飽和酶基因表達(dá),進(jìn)而飽和脂肪酸成為主要脂肪酸[70]。劉瑀等[71]收集整理了不同緯度海參脂肪酸含量數(shù)據(jù),總結(jié)歸納得出,海參EPA、DHA相對含量隨著緯度的降低而降低,C16:0和C18:0相對含量隨緯度降低而升高。Budge等[72]利用受飲食影響的脂肪酸分布來對28 種不同海產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)地溯源,發(fā)現(xiàn)物種內(nèi)的差異不如物種間的差異大。

    脂肪酸還適用于區(qū)分不同生產(chǎn)方式的海參。張旭峰[62]采集了萊州、擔(dān)子島、牟平、乳山、瓦房店、皮口、長海、獐子島和霞浦的刺參,研究發(fā)現(xiàn)霞浦地區(qū)刺參的C18:2n-6、C18:3n-3、C20:1n-9、C22:1n-9含量明顯高于其他地區(qū),而C18:1n-9和C20:5n-3含量明顯低于其他地區(qū),主要由于霞浦地區(qū)刺參的養(yǎng)殖方式為筏式養(yǎng)殖,飼料中添加了大量海帶,而底播養(yǎng)殖刺參食物來源主要以底棲硅藻為主;因此,底播刺參的C20:5n-3含量明顯高于筏式養(yǎng)殖。同時(shí),不同季節(jié)刺參的脂肪酸組成也存在明顯差異,主要與刺參的主要食物來源與季節(jié)變化有關(guān),來源為春季硅藻類、夏季綠藻類、秋季細(xì)菌、冬季褐藻類[73]。脂肪酸在生物新陳代謝中比較穩(wěn)定,經(jīng)過生物長期攝食累積后結(jié)構(gòu)基本保持不變,食性差異會(huì)反映在海參的脂肪酸組成中[74]。

    脂質(zhì)組學(xué)分析也能夠與SIA一起用于區(qū)分海參的產(chǎn)地來源。Zhang Xufeng等[67]利用脂肪酸分析和碳、氮的SIA來區(qū)分中國北部海域7 個(gè)地點(diǎn)采集的仿刺參(Apostichopus japonicus)。利用δ13C和δ15N值可以有效區(qū)分5 個(gè)采集點(diǎn)的樣品,但長海島和擔(dān)子島結(jié)果部分重疊,可能是因?yàn)檫@兩地域海參有相似的食物來源。然而,δ13C與C14:1n-5結(jié)合可作為區(qū)分擔(dān)子島和長海島海參的指標(biāo)。通過脂肪酸成分含量差異結(jié)合SIA,利用PCA能夠有效區(qū)分這7 個(gè)地點(diǎn)的仿刺參。不同海域生物的脂肪酸組成與鹽度直接相關(guān)。在高鹽度下,多不飽和脂肪酸含量增加,飽和脂肪酸含量減少,主要是為了維持細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)和提高細(xì)胞的遷移率[75]。Liu Yu等[63]建立了一種新的脂肪酸CSIA方法,結(jié)合PCA和判別分析對中國沿海9 個(gè)地區(qū)仿刺參產(chǎn)地進(jìn)行溯源,結(jié)果表明:除瓦房店和皮口,春季刺參脂肪含量明顯高于秋季刺參,其中對A. japonicus產(chǎn)地起源鑒定貢獻(xiàn)最大的脂肪酸為C22:6n-3、C16:1n-7、C20:5n-3、C18:0和C23:1n-9。

    脂質(zhì)組學(xué)分析不僅可以區(qū)分海參產(chǎn)地來源,而且有助于生產(chǎn)方式溯源[75-76]。然而,海參脂肪酸組成的季節(jié)性變化需要進(jìn)一步研究,以避免得到的產(chǎn)地來源和生產(chǎn)方式之間可能存在的重疊,并且海參的脂肪酸成分可能會(huì)通過控制飲食進(jìn)行調(diào)控。此外,為了確定未知樣品的實(shí)際來源,需要一個(gè)包含不同海參物種脂肪酸分布的數(shù)據(jù)庫。一旦這些問題得到解決,脂質(zhì)組學(xué)分析就可以在海參溯源分析中發(fā)揮重要作用。

    2.4.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

    蛋白質(zhì)是海參的主要組成成分,蛋白質(zhì)的差異可以指示海參相關(guān)特性,利用蛋白質(zhì)技術(shù)可以鑒定并篩選有關(guān)蛋白作為生物標(biāo)記物,建立海參的溯源分析技術(shù)。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測分析技術(shù)有酶聯(lián)免疫分析、電泳法和色譜分析法等。然而,這些檢測技術(shù)都存在一定的缺點(diǎn),酶聯(lián)免疫法對于親緣關(guān)系較近的物種易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,單克隆抗體雖然能顯著提高檢測特異性,但其檢測成本高、操作繁瑣,目前尚無商品化的水產(chǎn)品溯源酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒面世[77]。蛋白質(zhì)電泳法不適用于深加工樣品的分析。色譜分析法也存在操作復(fù)雜、定性能力較弱、不適合分離疏水性蛋白等問題?;蚪M計(jì)劃加快了質(zhì)譜技術(shù)作為鑒定和探查蛋白質(zhì)技術(shù)的趨勢,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因時(shí)代的組學(xué)分析核心為食品真實(shí)性溯源分析提供了新的技術(shù)思路[78],并已在水產(chǎn)品[79]、肉類[80-81]、乳制品[82]等食品的溯源分析中獲得了實(shí)際應(yīng)用。常見的蛋白質(zhì)定量技術(shù)包括同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)、細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling with amino acid in cell culture,SILAC)、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(tandem mass tag,TMT)、非標(biāo)記技術(shù)[83]。非標(biāo)記定量技術(shù)有數(shù)據(jù)依賴性采集(data-dependent acquisition,DDA)和數(shù)據(jù)非依賴性采集(data-independent acquisition,DIA)兩種方式,其中DIA的連續(xù)窗口所有理論碎片離子采集技術(shù)(sequential window acquisition of all the theoretical fragment ion,SWATH)是近年來被廣泛應(yīng)用的技術(shù)[84]。Piovesana等[85]分別采用二甲基標(biāo)記及非標(biāo)記鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)方法表征養(yǎng)殖和野生的金頭鯛(Sparus aurata)的肌肉組織,結(jié)果表明二甲基標(biāo)記的結(jié)果與非標(biāo)記結(jié)果一致,但使用非標(biāo)記方法可以獲得更全面的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果、更好地分析重現(xiàn)性和樣品通量,且費(fèi)用低廉。Zhang Hongwei等[86]基于SWATH-MS技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué),檢測分析了中國霞浦、膠南、威海、煙臺和大連5 個(gè)不同產(chǎn)地來源的干制商品海參,17 種蛋白質(zhì)被鑒定為可進(jìn)行產(chǎn)地溯源的生物標(biāo)記物組,在驗(yàn)證測試和實(shí)際樣品分析中達(dá)到了100%的預(yù)測準(zhǔn)確性。

    基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)具有高穩(wěn)定性、高靈敏度以及高通量的特點(diǎn),有著其他分析方法沒有的優(yōu)勢,例如可以獲得足夠的反映食品真實(shí)性特質(zhì)的分子信息,且可以進(jìn)行數(shù)據(jù)采集后的回溯分析,對加工貯藏過程中的特征標(biāo)記肽段、氨基酸序列的修飾進(jìn)行監(jiān)控,利用熱穩(wěn)定蛋白對標(biāo)記物進(jìn)行篩選等[87]。與DNA分子相比,蛋白的一級結(jié)構(gòu)或多肽序列在某些加工中具有更好的分析穩(wěn)定性,但其在食品溯源分析研究中仍存在某些制約因素。首先是蛋白質(zhì)提取及富集方法的標(biāo)準(zhǔn)化,用以解決豐度低的標(biāo)記蛋白及復(fù)雜基質(zhì)蛋白質(zhì)提取困難的問題;其次,由于海參存在自溶現(xiàn)象以及加工造成蛋白質(zhì)溶解度降低,將依賴高分辨質(zhì)譜技術(shù)先期進(jìn)行深度的數(shù)據(jù)挖掘。最后,生物信息學(xué)工具的豐富和組學(xué)數(shù)據(jù)庫改進(jìn)完善還有需要提升的空間,這兩者是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)有效分析的關(guān)鍵。但未來隨著更多生物基因組測序的完成,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)將進(jìn)一步得到完善,加之?dāng)?shù)據(jù)挖掘工具的進(jìn)一步改進(jìn),將為在更深更廣的范圍內(nèi)闡述蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)提供強(qiáng)有力的支持。

    2.4.3 糖組學(xué)分析

    糖類成分在生物體中主要以復(fù)合糖的形式存在,包括糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂。同時(shí),糖組學(xué)研究也分為聚糖組和糖鏈組[88]。海參體壁主要有兩類活性多糖,一類是海參硫酸軟骨素(sea cucumber chondroitin sulfate,SC-CHS),由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖組成;另一類是海參巖藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan,SC-FUC),由L-巖藻糖構(gòu)成。海參多糖之間存在的硫酸化程度、相對分子質(zhì)量、微觀結(jié)構(gòu)以及殘基數(shù)量的差異決定了其結(jié)構(gòu)分析的復(fù)雜性[89]。陳士國等[90]采用高溫氫核磁共振(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)技術(shù)分析了阿拉斯加刺參、海地瓜、墨西哥刺參、冰島刺參、日本刺參、明禿參、北極海參和八刺參8 種海參的SC-CHS,通過比較SC-CHS中硫酸酯化巖藻糖支鏈上的異頭氫信號確定硫酸基的取代類型,結(jié)果表明SC-CHS的指紋圖譜可作為海參物種的溯源工具。Wu Nian等[91]利用傅里葉變換紅外光譜分析儀和高溫1H-NMR技術(shù)測定印度太平洋的Pearsonothuria graeffei、挪威海岸的Holothuria vagabunda、西印度洋的Stichopus tremulu和西大西洋的Isostichopus badionotu4 種海參的SC-FUC化學(xué)性質(zhì),根據(jù)SC-FUC異頭氫信號可建立不同海域海參的指紋圖譜。

    糖組學(xué)分析可以從生物小分子的角度更全面地發(fā)現(xiàn)用于食品溯源分析的分子標(biāo)識物,為后續(xù)的營養(yǎng)功能與調(diào)控機(jī)制的研究積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。相比于蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的分析,糖組學(xué)分析更具有挑戰(zhàn)性。由單糖組成的寡糖和多糖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,需要專門的生物信息學(xué)軟件來分析復(fù)雜的糖基化位點(diǎn)和聚糖成分的質(zhì)譜圖,并且糖類較高的極性也對樣品分離提出了較高的要求[92]。但隨著超高分辨質(zhì)譜在糖組學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用及數(shù)據(jù)庫與分析軟件的不斷完善,糖組學(xué)的研究也將更廣泛地應(yīng)用于食品溯源分析領(lǐng)域。

    2.5 常見海參溯源分析技術(shù)的比較

    表3對6 種分析技術(shù)在海參溯源應(yīng)用中的優(yōu)勢和劣勢進(jìn)行了對比,可以發(fā)現(xiàn),在目前已有的報(bào)道中,沒有一種檢測技術(shù)可以獨(dú)立完成物種、產(chǎn)地和生產(chǎn)方式3 個(gè)方面的溯源分析。根據(jù)溯源目的以及適用條件可選擇最佳的檢測方法,并且多種技術(shù)聯(lián)合分析的手段將成為溯源檢測的發(fā)展趨勢。

    表3 海參不同溯源分析技術(shù)的優(yōu)勢和局限性Table 3 Advantages and limitations of different analytical techniques for the traceability of sea cucumber

    2.6 溯源分析技術(shù)展望

    目前還有一些技術(shù)開始在海產(chǎn)品的溯源分析中得到應(yīng)用,這將為海參溯源分析技術(shù)的發(fā)展提供參考。Itrax X射線熒光光譜法(X ray fluorescence,XRF)是一種可以提供元素組成的方法,常用于沉積物巖芯掃描[93]。這種技術(shù)雖然只能輸出半定量分析的結(jié)果,但具有快速、無損、高精度的優(yōu)勢,并且可以檢測到多達(dá)31 種不同元素的存在[94]。Gadd等[95]在2018年將該技術(shù)的應(yīng)用拓展到了軟生物組織樣品,并認(rèn)為基于Itrax的XRF技術(shù)有可能成為食品質(zhì)量或安全性方面的有效工具。已有報(bào)道將Itrax XRF技術(shù)和SIA結(jié)合進(jìn)行了有效的黑虎蝦生產(chǎn)方式和產(chǎn)地溯源分析[96]。基于該技術(shù)的方法還用于建立亞洲鱸魚(Lates calcarifer)的種源模型,研究表明組合模型中沒有錯(cuò)誤預(yù)測的樣本[97]。這些研究結(jié)果表明,雖然可能無法提供元素的量化值,但基于Itrax的XRF通過分析樣品的元素組成對樣品進(jìn)行溯源是可行的。目前,由于尚不清楚是否會(huì)因被掃描的組織類型不同而對結(jié)果產(chǎn)生影響,該方法在海參和海參不同組織部位的溯源分析應(yīng)用方面還需要進(jìn)一步探究。

    3 結(jié) 語

    目前對于海參物種、產(chǎn)地來源和生產(chǎn)方式3 個(gè)方面的溯源分析,上述不同的技術(shù)都有其各自的優(yōu)勢。市面上海參深加工產(chǎn)品的不斷推出,加之海參養(yǎng)殖模式的演變導(dǎo)致養(yǎng)殖海域及方式的不定,都將給海參溯源分析帶來新的挑戰(zhàn)。與單一方法相比,使用多種溯源分析技術(shù)組合具有更高的辨識精度。同時(shí),還需進(jìn)一步完善相應(yīng)的海參溯源分析數(shù)據(jù)庫,探究最佳的化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)方法,建立不同物種、不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)方式海參的溯源分析判別模型。

    海參溯源分析對發(fā)現(xiàn)和預(yù)防食品欺詐有著重大意義,未來的發(fā)展趨勢主要包括如下3 個(gè)方面:1)深加工產(chǎn)品以及混合樣品的定性定量檢測;2)快速的現(xiàn)場溯源分析技術(shù);3)構(gòu)建無損的溯源分析技術(shù)體系。隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來,基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為海參溯源分析技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了新的機(jī)遇?;诙嘟M學(xué)分析手段、交叉生物信息學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)的食品組學(xué)分析技術(shù)將成為未來海參溯源分析的發(fā)展趨勢。

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