基于響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取青陽(yáng)參苷元工藝

梁蕾蕾，羅伊婷，徐逍宣，胡顯光，李永菲，劉丹丹**

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；3.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650000)

青陽(yáng)參（CynanchumotophyllumSchnei）是蘿藦科鵝絨藤屬植物[1]，其干燥根在云南少數(shù)民族中作藥用.青陽(yáng)參中化合物類型復(fù)雜多樣，主要是C21甾體苷元與糖基結(jié)合而成的糖苷[2]，藥物學(xué)家證實(shí)了青陽(yáng)參苷類化合物在抗癲癇、抗抑郁、抗肝臟纖維化和中樞鎮(zhèn)靜等方面有顯著藥理活性[3-7].

青陽(yáng)參苷類化合物的甾體苷元大部分為青陽(yáng)參苷元（Qingyangshengenin）（圖1）和告達(dá)亭[8-9].過(guò)去的文獻(xiàn)[10-12]以檢測(cè)青陽(yáng)參苷元含量反映青陽(yáng)參苷類提取物或制劑的質(zhì)量指標(biāo)，缺乏對(duì)苷元單體的進(jìn)一步探索.我們認(rèn)為青陽(yáng)參苷元在醫(yī)藥應(yīng)用方面具備潛力，有進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、藥效學(xué)機(jī)制等研究的價(jià)值，而系統(tǒng)、重復(fù)、大量地獲得青陽(yáng)參苷元是開(kāi)展研究的前提.

圖1 青陽(yáng)參苷元的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Qingyangshengenin

提取青陽(yáng)參苷元的報(bào)道鮮見(jiàn).文獻(xiàn)[5]采用回流提取法處理藥品，操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)；文獻(xiàn)[13]以正交設(shè)計(jì)輔助優(yōu)化了提取條件，但所得青陽(yáng)參苷元提取率不甚理想.本研究通過(guò)鹽酸水解糖苷游離出青陽(yáng)參苷元，乙醇作提取溶劑，超聲提取法處理，NaHCO3調(diào)節(jié)供試液pH 值，HPLC 法測(cè)定苷元含量.在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法（RSM），對(duì)影響青陽(yáng)參苷元提取率的主要因素及其交互作用進(jìn)行分析探討，確定了超聲提取青陽(yáng)參苷元的最佳技術(shù)參數(shù)，為青陽(yáng)參苷元的分離制備奠定基礎(chǔ).

1 材料與儀器

1.1 材料青陽(yáng)參苷元對(duì)照品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：P1548443，純度：HPLC 測(cè)定w≥98%）；甲醇、乙腈（韶關(guān)高科祥高新材料有限公司，色譜純）；純凈水；其他試劑為分析純.

青陽(yáng)參藥材購(gòu)自昆明市菊花園中藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陸露研究員（研究方向?yàn)樗幱弥参飳W(xué)）鑒定為青陽(yáng)參（Cynanchum otophyllumSchnei）的干燥根，加工成0.172 mm（100 目）粉末備用.

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器Waters e2695 型高效液相色譜儀（瑞士BUCHI 公司）；SK3200H 型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；STARTER300型便攜式pH 計(jì)（常州奧豪斯儀器有限公司）；GR-202 型電子分析天平（日本AND 公司）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超聲處理法制備青陽(yáng)參苷元供試液精確稱取青陽(yáng)參粉末5 g，置于100 mL 圓底燒瓶，加入乙醇和鹽酸水溶液，使料液比為1∶10（g/mL），置于超聲清洗儀中，以特定的超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行提取.取出冷卻，用飽和NaHCO3水溶液調(diào)節(jié)pH 至7～8，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移入容量瓶，用甲醇定容至100 mL，即得到青陽(yáng)參苷元供試液.

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取青陽(yáng)參苷元對(duì)照品10 mg，置10 mL 容量瓶中.用甲醇定容至刻度，搖勻，即為1 mg/mL 的青陽(yáng)參苷元對(duì)照品溶液備用.

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（φ4.6 mm ×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流動(dòng)相：乙腈（A）?水（B）梯度洗脫（體積比，0～10 min，30% A；10～15 min，30～38% A；15～20 min，38% A；20～28 min，38～43% A；28～36 min，43% A；36～38 min，43～56% A；38～46 min，56% A；46～64 min，56～74% A；64～72 min，74% A；72～73 min，74～90% A；73～75 min，90% A）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：259 nm（青陽(yáng)參苷元最大吸收波長(zhǎng)）.

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以“2.2.1”項(xiàng)中青陽(yáng)參苷元對(duì)照品溶液，用甲醇定量稀釋為0.001、0.025、0.050、0.125、0.250、0.500、1.000 g/L 的不同質(zhì)量濃度溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定.峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度ρ（g/L）為橫坐標(biāo)回歸處理，得回歸方程Y=17 174 520ρ? 68 757（R2=0.999 9，n=7）.結(jié)果表明，青陽(yáng)參苷元質(zhì)量濃度在0.001～1.000 g/L 與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)中青陽(yáng)參苷元對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6 次，測(cè)得峰面積的RSD=1.00%，證明進(jìn)樣精密度良好.

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)中青陽(yáng)參苷元供試液，連續(xù)測(cè)定6 次，測(cè)得峰面積的RSD=1.30%，證明此方法重復(fù)性良好.

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)中青陽(yáng)參苷元供試液，24 h 內(nèi)每隔3 h 測(cè)定1 次，測(cè)得峰面積的RSD=1.40%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.7 樣品的測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)制備青陽(yáng)參苷元供試液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下，分別取供試液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣.以峰面積按外標(biāo)?標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定含量，并計(jì)算青陽(yáng)參苷元的提取率.

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)精確稱取青陽(yáng)參粉末5 g，以料液比1 :10（g/mL）為工藝基礎(chǔ)，分別研究提取溶液的鹽酸濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間5 個(gè)單因素對(duì)供試液中青陽(yáng)參苷元含量的影響，各因素的考察水平見(jiàn)表1.每個(gè)條件平行實(shí)驗(yàn)3 組，結(jié)果取平均值.

表1 單因素實(shí)驗(yàn)考察因素及水平Tab.1 The factors and levels of single factor experiment

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間三因素對(duì)提取效果的影響.以青陽(yáng)參苷元提取率為響應(yīng)值，采用 Box-Behnken 設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化青陽(yáng)參中青陽(yáng)參苷元的提取工藝參數(shù)，各因素水平見(jiàn)表2.每個(gè)條件平行實(shí)驗(yàn)3 組，結(jié)果取平均值.

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溶液的鹽酸濃度 首先按“2.1”項(xiàng)制備青陽(yáng)參苷元供試液，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲功率420 W、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間30 min 的固定條件下，分別選取提取溶液的鹽酸濃度為0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mol/L，并按“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.7”項(xiàng)方法測(cè)定青陽(yáng)參苷元的提取率.隨著提取溶液的鹽酸濃度增加，提取率升高后降低，鹽酸濃度達(dá)到0.36 mol/L 時(shí)，提取率最高.鹽酸濃度低，青陽(yáng)參糖苷無(wú)法充分水解，同時(shí)溶液粘度很大難以抽濾.當(dāng)鹽酸濃度高于0.36 mol/L 時(shí)，可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)破壞了青陽(yáng)參苷元的結(jié)構(gòu)，使提取率又顯著下降.因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)提取溶液的鹽酸濃度均確定在0.36 mol/L.

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 在提取溶液的鹽酸濃度0.36 mol/L、超聲功率420 W、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間30 min 的條件下，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%，測(cè)定青陽(yáng)參苷元的提取率.隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取率升高后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率達(dá)到峰值，故將乙醇體積分?jǐn)?shù)的多因素考察中心點(diǎn)定為50%.

3.1.3 超聲功率 在提取溶液的鹽酸濃度0.36 mol/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間30 min 的條件下，分別選取超聲功率為240、330、420、510、600 W，測(cè)定青陽(yáng)參苷元的提取率.隨超聲功率增加，提取率不斷升高.由于600 W 是所用超聲儀的上限，是否還有更高的功率更有利于青陽(yáng)參苷元的溶出，需要進(jìn)一步的研究工作.因此，限于實(shí)驗(yàn)條件把超聲功率確定在600 W，不將其作為多因素考察內(nèi)容.

3.1.4 超聲溫度 在提取溶液的鹽酸濃度0.36 mol/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲功率600 W、超聲時(shí)間30 min 的條件下，分別選取超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃，測(cè)定青陽(yáng)參苷元的提取率.隨超聲溫度增加，提取率升高后呈下降趨勢(shì)，超聲溫度為60 ℃時(shí)，提取率達(dá)到峰值，故將超聲溫度的多因素考察中心點(diǎn)定為60 ℃.

3.1.5 超聲時(shí)間 在提取溶液的鹽酸濃度0.36 mol/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲功率600 W、超聲溫度60 ℃的固定條件下，分別選取超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min，測(cè)定青陽(yáng)參苷元的提取率.隨超聲時(shí)間增加，提取率升高后又下降，超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，提取率達(dá)到峰值，故將超聲時(shí)間的多因素考察中心點(diǎn)定為30 min.

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)（Response surface methodology，RSM）設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)原理，參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The experiment design and results of RSM

3.2.2 響應(yīng)面法回歸方程及方差分析 采用Design Expert 11 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以響應(yīng)值為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程為：Y=0.264 3+0.016 6A+0.007 7B+0.015 7C+0.003 1AB+0.021 0AC? 0.011 0BC? 0.031 3A2? 0.010 0B2? 0.034 2C2，式中Y為青陽(yáng)參苷元提取率，A為乙醇體積分?jǐn)?shù)，B為超聲溫度，C為超聲時(shí)間.

回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4.P值反映模型或因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，P值越小表示越顯著；F值反映模型或因素對(duì)響應(yīng)值影響的具體程度，F(xiàn)值越大表示影響越大.模型的P<0.01，說(shuō)明模型差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.A、B、C、AC、BC、A2、B2與C2為顯著影響因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間皆對(duì)青陽(yáng)參苷元提取率影響大，并且乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、超聲溫度與超聲時(shí)間之間具有明顯的交互作用.失擬項(xiàng)P=0.196 9，差異不顯著，說(shuō)明模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度高，實(shí)驗(yàn)誤差小.回歸系數(shù)R2=0.982 5，調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.951 1，表明響應(yīng)值95.11%的變化可用該模型解釋.RSD=3.19%小于10%，信噪比14.964 8 大于4，所以模型的穩(wěn)定性、預(yù)測(cè)性均良好.

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis resuIts of variance for quadric regression model

3.2.3 響應(yīng)曲面分析 響應(yīng)面圖及等高線圖直觀反映了各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面圖中曲線越彎曲表示研究因素對(duì)響應(yīng)值影響越大，等高線越呈橢圓形表示研究因素之間的交互作用越顯著.利用Design Experts 11 軟件將各因素兩兩進(jìn)行擬合，得出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，見(jiàn)圖2.影響青陽(yáng)參苷元提取率的顯著因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間，超聲溫度最小，并且乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、超聲溫度與超聲時(shí)間之間有顯著的交互作用.結(jié)果表明，響應(yīng)面圖及等高線圖與回歸模型方差分析結(jié)果是一致的.

圖2 各因素對(duì)青陽(yáng)參苷元提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Responsive surface and contour of effects of each factor on extraction rate of Qingyangshengenin

3.2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證 通過(guò)軟件分析，乙醇體積分?jǐn)?shù)57.60%、超聲溫度62.76 ℃、超聲時(shí)間33.02 min為青陽(yáng)參苷元最佳提取工藝參數(shù)，提取率預(yù)測(cè)值為0.271 0%.為了便于實(shí)際操作，將最佳參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、超聲溫度63 ℃、超聲時(shí)間33 min.以此條件進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，青陽(yáng)參苷元提取率平均值為0.274 5%，與預(yù)測(cè)值的RSD值為0.91%，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性較好，有使用價(jià)值.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超聲提取法處理、HPLC 法檢測(cè)，首先考察了提取溶液的鹽酸濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)青陽(yáng)參苷元提取率的影響，然后以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度及超聲時(shí)間作因素水平表，采用響應(yīng)面法優(yōu)化青陽(yáng)參苷元超聲提取的工藝.以青陽(yáng)參苷元提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化得出的最佳超聲提取工藝參數(shù)為：提取溶液的鹽酸濃度0.36 mol/L、料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、超聲功率600 W、超聲溫度63 ℃、超聲時(shí)間33 min，此條件下青陽(yáng)參苷元提取率為0.274 5%.

超聲提取法較其他常用的提取方法操作更簡(jiǎn)單，工藝運(yùn)行成本低、能耗小，提取效率高；乙醇作提取溶劑可減少有毒溶劑殘留和降低成本；同時(shí)，以弱堿NaHCO3代替NaOH 中和提取液酸性，確保青陽(yáng)參苷元不會(huì)與強(qiáng)堿成鹽損失而造成提取率下降，也避免了腐蝕性對(duì)人體和環(huán)境的不利影響.因此，本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)高效、綠色的青陽(yáng)參苷元提取方法，為青陽(yáng)參苷元的分離制備、藥理及構(gòu)效關(guān)系研究等打下良好的基礎(chǔ).