白云鄂博稀土礦來源放線菌Actinorectispora metalli 的次生代謝產(chǎn)物研究

何江波，石洋銖，康大偉，牛燕芬，王紀愛，陳 秀，秦 靜，畢曉旭，欒 杰，曹艷茹**

(1.昆明學院，云南 昆明 650214；2.云南省疾病預防與控制中心，云南 昆明 650022)

白云鄂博稀土礦是一座世界罕見的多金屬共生礦床，礦產(chǎn)資源十分豐富，被譽為“世界稀土之鄉(xiāng)”[1]，其鈮?鐵礦床的稀土資源居世界第一[2].除此以外，該礦還含有豐富的銅礦、金礦等資源.白云鄂博稀土礦微生物是特殊的環(huán)境微生物，對這一特殊礦區(qū)的微生物資源進行多樣性的研究，有利于我們研究其次生代謝產(chǎn)物的多樣性.特殊環(huán)境微生物具有獨特的新陳代謝途徑、適應機制，因此會產(chǎn)生具有新穎結構的次生代謝產(chǎn)物，可以為藥物的研發(fā)提供參考.放線菌Actinorectispora metalli是我們從白云鄂博礦區(qū)分離得到的一個放線菌新種[3]，前期研究表明該菌的典型菌株KC 198T在酵母膏?蛋白胨培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活性較好，分別在第7 d 和第8 d 時酶活性較高，其蛋白酶酶活性在28 ℃時達到最高.研究結果表明A.metalliKC 198T可作為工業(yè)酶制劑的菌株來源[4].因此，我們課題組繼續(xù)對A.metalliKC 198T進行深入研究，挖掘高活性的次生代謝產(chǎn)物，為該菌的深入開發(fā)奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 自白云鄂博稀土礦中分離，16S rRNA 基因序列分析結果表明KC 198 與印度放線菌(Actinorectispora indicaYIM 75 728)相似性最高，為98.4%.經(jīng)多相分類實驗，命名為Actinorectispora metallisp.nov[3]，菌種目前保存于昆明學院農(nóng)學與生命科學學院菌種庫(編號為KC 198).

1.1.2 培養(yǎng)基 ISP2 培養(yǎng)基(1 L)：酵母膏4 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖4 g，動物蛋白胨2 g，植物蛋白胨1 g，微量鹽1 mL，復合維生素少許，自來水1 000 mL，pH 7.2.

PDB 培養(yǎng)基(1 L)：土豆200 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，微量鹽1 mL.

1.1.3 主要試劑和儀器 1.1-二苯基-2-苦肼基自由基(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；柱層析用硅膠(0.054～0.077 mm)、薄層層析用硅膠GF254 均為青島海洋化工廠生產(chǎn)，Sephadex LH-20 (25～100 μm)為Pharmacia 公司產(chǎn)品；RP-18 (40～60 μm)為日本Daiso 產(chǎn)品.色譜試劑：甲醇、乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?.顯色劑為H2SO4(10%)的乙醇溶液.分析純甲醇超高壓液相色譜三重四級桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀器(英國Waters 公司，Xevo TQ-S)；Avance 600 MHz 核磁共振儀(TMS 作為內(nèi)標)；島津UV-2401 紫外分光光度計；Hanbon-NP7000C 制備液相(漢邦儀器公司)，制備柱(Zorbax XDB-C-18，φ21.2×150 mm，5 μm)；旋轉蒸發(fā)儀(東京理化，N-1100)；搖床(上海智城分析儀器制造有限公司，ZWY-2102)；萬分之一電子天平(上海越平電子天平，F(xiàn)A1004B).

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與種子液的培養(yǎng) 將保存于?20 ℃的菌株接種于PDA 平板，28 ℃，7 d，以進行活化.然后將單菌落接種至改良ISP2 培養(yǎng)基，恒溫搖床28 ℃，180 r/min，3 d，作為種子液.

1.2.2 菌株發(fā)酵 將種子液接種至PDB 培養(yǎng)基(121 ℃，滅 菌30 min，pH 7.2)，培 養(yǎng)8 d，28 ℃，180 r/min，發(fā)酵液采用紗布過濾，收集濾液，得發(fā)酵液25 L，然后將發(fā)酵液濃縮至2 L.

1.2.3 提取與分離 浸膏采用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，濃縮萃取液，得乙酸乙酯浸膏3.5 g.水層再次采用等體積正丁醇萃取3 次，濃縮萃取液，得正丁醇浸膏12.5 g.乙酸乙酯浸膏采用甲醇溶解后，過濾，除去不溶物，經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜初步分離，根據(jù)薄層色譜(TLC)，10%濃硫酸乙醇溶液顯色合并相似成分，得3 個組分Fr A～C.Fr A 組 分(238.3 mg)采用硅膠柱色譜(0.054～0.077 mm，φ2 cm×50 cm)再次純化，以石油醚?丙酮系統(tǒng)梯度洗脫(體積比10∶1～0∶1)，根據(jù)TLC合并相似組分，再經(jīng)Sephadex LH-20 柱(MeOH)分離后得到化合物1(4.3 mg).Fr C 經(jīng)RP-18 反相柱色譜(甲醇?水10%～100%，梯度洗脫，每梯度200 mL)分離，經(jīng)TLC (GF254硅膠板)檢測后為樣品Fr C1(162.2 mg)，采用制備液相進一步分離，40%色譜甲醇等度洗脫(流速10 mL/min，tR12′33′′)，得化合物2(7.8 mg).Fr C2 質量18.9 mg，采用制備液相分離純化，以10%色譜甲醇等梯度洗脫(流速10 mL/min，tR10′57′′)得化合物3(9.5 mg).正丁醇浸膏采用甲醇溶解，過濾，棄去不溶物，采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜脫糖，得到Fr A-F 部分.Fr A 部分采用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚?丙酮體系(體積比10∶1～0∶1，梯度洗脫)，得到FrA1-3，F(xiàn)rA-1 再次采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化得到化合物4(11 mg).FrA-2 采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化得到化合物5(8.2 mg).Fr C 1.2 g，采用RP-18 (10%～100%，梯度洗脫，每個梯度200 mL)，根據(jù)TLC 顯色合并相似部分，然后采用硅膠柱色譜法石油醚?丙酮梯度洗脫(體積比5∶1～0∶1)，得化合物6(25.8 mg).Fr D 部分采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜脫色，根據(jù)TLC 合并相似組分，然后采用制備液相70%甲醇水等度洗脫純化(流速10 mL/min，tR14′00′′)，得化合物7(9.0 mg).以上化合物結構見圖1.

圖1 化合物1～7 的結構式Fig.1 Chemical structure of compounds 1?7

1.2.4 抗氧化活性實驗 稱取一定量的DPPH粉末，用甲醇溶解，配成1 mmol/L 的母液.測定時用甲醇稀釋10 倍，配成0.1 mmol/L 的DPPH 反應液.取用甲醇稀釋的不同濃度樣品0.5 mL 于5 mL離心管中，加入2 mL 的DPPH 工作液，混勻，振蕩30 min，在517 nm 處測定吸光值.然后按照公式計算DPPH 自由基清除率，并計算IC50值.

其中：A0—對照組吸光值，0.5 mL 甲醇+2 mL DPPH；Ax0—0.5 mL 樣品+2 mL 甲醇；Ax—0.5 mL 樣品+2 mL DPPH.

2 結果與分析

2.1 新化合物的結構鑒定

化合物1，無色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MS：m/z365 [M-H]?；HR-ESI-MS：m/z401.100 7，[M+Cl]?，calcd.for根據(jù)1H NMR 和13C NMR 推測該化合物為含有萘環(huán)的結構，同時還含有一個β型(δ=5.04，J=6.0 Hz)葡萄糖的單元.根據(jù)質譜推斷該化合物含有18 個碳，其中包含一個萘環(huán)單元，一個葡萄糖單元，以及兩個甲氧基.再次結合1H NMR 分析，萘環(huán)上有5 個未取代的H 信號，兩個甲氧基信號在δ=3.96 (3H，s，1-OCH3)和3.99 (3H，s，4-OCH3).根據(jù)1H-1H COSY譜可知，δH=8.11 與δH=7.35 相 關，δH=7.35 與δ=7.49 相關，δH=7.49 與δH=8.00 相關.因此推斷δC=123.1 與δC=125.0 連接，δC=125.0 與δC=127.9 連接，δC=127.9 與δC=122.1 連接(圖2).根據(jù)HMBC 圖譜，確定δH=3.96 與δC=138.2 連接，δH=3.99 與δC=153.8連接.δH=5.04 與δC=147.5 存在相關，確定糖單元的連接位置(圖2).

圖2 化合物1 的重要1H?1H COSY(─)和HMBC(→)相關Fig.2 The key 1H?1H COSY(─) and HMBC(→) correlations of compound 1

因此化合物1的結構被確定，并命名為1,4-dimethoxy-2-hydroxy naphthalene-2-O-β-D-glucopyra noside，該化合物為新化合物，與文獻化合物1,2,4-trihydroxynaphthalene-2-O-β-D-glucopyranoside [5]相似.核磁數(shù)據(jù)為1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ：8.11(1H，dt，J=6.0，0.8 Hz，H-5)，8.00 (1H，dt，J=6.0，0.6 Hz，H-8)，7.49 (1H，ddd，J=6.0，5.0，0.8 Hz，H-7)，7.35 (1H，ddd，J=6.0，5.0，0.8 Hz，H-6)，6.99 (1H，s，H-3)，5.04 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，3.99 (3H，s，4-OCH3)，3.96 (3H，s，1-OCH3)，3.91 (1H，dd，J=9.0，1.8 Hz，H-6′b)，3.68 (1H，dd，J=9.0，4.8 Hz，H-6′a)，3.56 (1H，dd，J=7.2，6.0 Hz，H-2′)，3.50 (1H，t，J=6.6 Hz，H-3′)，3.46 (1H，ddd，J=7.2，4.8，1.8 Hz，H-5′)，3.38 (1H，dd，J=7.2，6.6 Hz，H-4′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：138.2 (C-1)，147.5 (C-2)，99.2(C-3)，153.8 (C-4)，123.1 (C-5)，125.0 (C-6)，127.9 (C-7)，122.1 (C-8)，130.3 (C-9)，123.8 (C-10)，103.7 (C-1′)，75.2 (C-2′)，78.2 (C-3′)，71.6 (C-4′)，78.5 (C-5′)，62.7 (C-6′)，62.2 (1-OCH3)，56.3 (4-OCH3).

2.2 已知化合物的核磁數(shù)據(jù)

化合物2：無色油狀物，易溶于甲醇.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.93 (1H，d，J=7.2 Hz，H-8)，7.65～7.62 (2H，m，H-5，H-6)，7.42 (1H，m，H-7)，4.92 (1H，dd，J=6.0，3.0 Hz，H-4)，2.86 (1H，ddd，J=13.2，5.4，3.6 Hz，H-2a)，2.62 (1H，ddd，J=13.2，7.8，3.6 Hz，H-2b)，2.36 (1H，m，H-3a)，2.11 (1H，m，H-3b).13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：200.2 (C-1)，36.4 (C-2)，33.1 (C-3)，68.4 (C-4)，127.8 (C-5)，135.4(C-6)，128.7 (C-7)，128.8 (C-8)，129.2 (C-9)，148.1 (C-10).以上數(shù)據(jù)與文獻化合物[6]一致，故鑒定為4-hydroxy-tetralone.

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.49 (1H，d，J=6.0 Hz，H-8′)，7.35 (1H，d，J=6.0 Hz，H-5′)，7.09 (1H，t，J=6.0 Hz，H-6′)，7.04 (1H，s，H-2′)，7.01 (1H，t，J=6.0 Hz，H-7′)，4.19 (1H，t，J=3.6 Hz，H-9)，3.46 (1H，dd，J=10.8，2.4 Hz，H-6)，3.40 (1H，dt，J=12.0，6.0 Hz，H-3)，3.10 (1H，dd，J=11.4，3.6 Hz，H-10)，2.99 (1H，ddd，J=9.0，7.2，1.8 Hz，H-3)，2.20 (1H，dd，J=8.4，4.8 Hz，H-10)，1.85 (1H，m，H-5)，1.75 (1H，m，H-4)，1.52 (1H，m，H-5)，1.20 (1H，m，H-4)；13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：166.8 (C-1)，44.6 (C-3)，20.9 (C-4)，29.8 (C-5)，58.1 (C-6)，170.2 (C-7)，57.8 (C-9)，28.3(C-10)，107.9 (C-1′)，124.8 (C-2′)，136.6 (C-4′)，111.0 (C-5′)，121.3 (C-6′)，118.1 (C-7′)，118.6 (C-8′)，127.2 (C-9′).以上數(shù)據(jù)與文獻化合物[7]一致，故鑒定為環(huán)(L－色氨酸－L－脯氨酸).

化合物4：白色粉末，易溶于DMSO.1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.94 (1H，s，NH)，7.39 (1H，d，J=7.5 Hz，H-6)，5.45 (1H，d，J=7.5 Hz，H-5)；13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：151.6 (C-2)，164.4 (C-4)，142.3 (C-5)，100.3 (C-6).以上數(shù)據(jù)與文獻化合物[8]一致，故鑒定為尿嘧啶.

化合物5：13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：151.5 (C-2)，165.0 (C-4)，107.7 (C-5)，137.8 (C-6)，11.8 (CH3-5).以上數(shù)據(jù)與文獻化合物[9]一致，故鑒定為胸腺嘧啶.

化合物6：白色粉末，易溶于DMSO.1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.34 (1H，s，H-8)，8.13 (1H，s，H-2)，7.34 (2H，s，NH2)，5.87 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，5.48 (1H，d，J=6.0 Hz，OH-2′)，5.42 (1H，dd，J=7.2，4.8 Hz，OH-5′)，5.22 (1H，d，J=4.8 Hz，OH-3′)，4.60 (1H，d，J=6.0 Hz，H-2′)，4.14 (1H，dd，J=7.8，3.6 Hz，H-3′)，3.96 (1H，q，J=3.0 Hz，H-4′)，3.66 (1H，dt，J=12.0，3.6 Hz，H-5′)，3.55 (1H，ddd，J=11.4，6.6，3.6 Hz，H-5′)；13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：152.4 (C-2)，149.1 (C-4)，119.4 (C-5)，156.2 (C-6)，139.9 (C-8)，87.9 (C-1′)，73.5 (C-2′)，70.7 (C-3′)85.9 (C-4′)，61.7 (C-5′).以上數(shù)據(jù)與文獻化合物[10]一致，故鑒定為β-adenosine.

化合物7：無色油狀物，易溶于甲醇.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.56 (1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，7.32 (1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.09 (1H，s，H-2)，7.07(1H，t，J=7.8 Hz，H-7)，6.99 (1H，t，J=7.8 Hz，H-5)，3.94 (1H，m，H-11)，3.55 (1H，dd，J=10.8，3.6 Hz，H-12a)，3.48 (1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-12b)，2.96 (1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-10a)，2.85 (1H，1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-10b);13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：124.3 (C-2)，112.6 (C-3)，119.7 (C-4)，119.6 (C-5)，122.4 (C-6)，112.3 (C-7)，138.3 (C-8)，129.2 (C-9)，30.7 (C-10) 74.0 (C-11)，67.0 (C-12).以上數(shù)據(jù)與文獻化合物[11]一致，故鑒定為3-(2,3-dihydroxypropyl)indole.

2.3 抗DPPH 自由基結果實驗采用DPPH 自由基清除實驗評價化合物1～7的抗氧化能力.單體化合物分別配成50、40、30、20 μmol/L 的溶液.分別添加50 μL 到96 孔板，再加入200 μL DPPH 液體.在暗處放置30 min，再用酶標儀于517 nm 處測定吸光度，并計算清除率.實驗結果顯示，化合物1～7均未顯示出DPPH 自由基清除活性.

3 討論與結論

微生物次生代謝產(chǎn)物是藥物的重要先導化合物來源，鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物被廣泛用作臨床藥物.從常規(guī)微生物資源中尋找藥物先導化合物面臨巨大的調(diào)整，因此我們選擇白云鄂博稀土礦中的微生物資源 進行挖 掘.通過對A.metalliKC 198T進行PDB 液體發(fā)酵產(chǎn)物研究，發(fā)現(xiàn)7 個化合物，其中化合物1為新化合物，且化合物1的類似物1,2,4-trihydroxynaphthalene-2-O-β-D-glucopyranosides 具有抗氧化活性和拮抗Aβ42 疏水肽聚集活性，被認為可以作為治療阿爾治海默癥的先導物[5].但是本次研究中未發(fā)現(xiàn)化合物1具有顯著的抗氧化活性，初步推斷其原因是酚羥基被甲基化后活性消失.另外，β-adenosine 也在本項研究中分離得到，該化合物在Domondon DL[10]的報道中，具有促進蘑菇生長的作用.從A.metalliKC 198T良好的產(chǎn)酶活性，到次生代謝產(chǎn)物研究，均表明該菌具有較高的研究價值.

本研究對白云鄂博稀土礦放線菌A.metalliKC 198T的次生代謝產(chǎn)物進行了初步的研究，運用現(xiàn)代分離分析方法共分離并鑒定了7 個化合物成分，其中化合物1為新化合物，其余化合物為已知化合物.通過抗氧化活性測試表明，所分離得到的化合物均無顯著的抗氧化活性.以上研究結果為進一步挖掘白云鄂博稀土礦微生物資源奠定了物質研究基礎，同時也豐富了鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物.