寧夏枸杞果皮蠟質微形態(tài)及蠟質組分研究

馬 潔，胡永超，岳藝彤，楊淑娟，楊 涓，鄭國琦

(寧夏大學 生命科學學院，銀川 750021)

寧夏枸杞是中國重要的藥用植物資源，其干燥果實為中藥“枸杞子”。寧夏枸杞果實屬漿果類，其鮮果采后易發(fā)生霉變和難以制干，主要原因是其果實含水率高(濕基含水率達80%)，而且表皮上有一層蠟質層覆蓋，致使內部水分難以排出，延長了制干時間且增加了霉變的發(fā)生。枸杞外果皮的表面由表皮層和角質化的皮下層組成，角質層上由蠟被覆蓋，由于表皮細胞和蠟被的保護，枸杞果實才可正常生長、發(fā)育、成熟。但表皮細胞和蠟被的存在阻礙了果實內水分的蒸發(fā)，使枸杞鮮果不易制干[1]。為了縮短枸杞制干時間，前人已通過促干劑破壞枸杞表皮蠟質和角質層的完整性，使水分快速蒸發(fā)，進而提高干燥效率。

果實角質層主要由角質基質和覆蓋并嵌入其中的蠟質兩部分組成[2]，植物表皮蠟質為能溶于有機溶劑不溶于水的一層晶體結構，主要由超長鏈脂肪酸及其衍生物組成的有機混合物構成。它不僅在植物抵抗生物和非生物逆境中發(fā)揮重要作用，還對植物生長發(fā)育具有重要影響。目前關于果實表皮蠟質的研究主要集中在蠟質的結構[3-5]、含量[6-7]、組分[8-10]、生物合成[11-12]、功能[13-15]和形成的相關轉錄因子[16-18]等方面且多為模式植物，但關于枸杞果皮蠟質的相關研究屈指可數。楊愛梅等[19]以正己烷為溶劑對枸杞表皮蠟質進行浸提，通過GC-MS分析共檢測出44個化合物，鑒定了39種成分，其中長鏈脂肪烴類化合物被確定是枸杞表皮蠟質層的主要成分；同時枸杞果實表皮蠟質層厚，呈排列緊密的光滑束狀條帶。杜靜[1]的研究也表明，枸杞果皮蠟質層的主要組分為長鏈脂肪烴類物質(占總組分58.19%)，蠟質層的結構呈條狀覆蓋于枸杞表皮。但枸杞表皮蠟質并非為光滑的束狀條帶，而是枸杞外果皮細胞壁外側呈現脊狀突起的結構，蠟質成膜片狀覆蓋在其上面。目前關于枸杞果皮結構、果皮蠟質微形態(tài)和組分的研究僅限于成熟期枸杞果實，隨著枸杞栽培品種的多樣化，不同品種由于果實特性的差異，在制干方面存在的差異也日趨顯現，而以往的一些傳統制干劑已不能滿足當前品種多樣化的需求，因此，開展不同品種枸杞果實結構、果皮蠟質微形態(tài)、蠟質含量及組分的研究，以期揭示影響不同品種枸杞果實制干差異的原因，對于下一步篩選不同品種專用促干劑及其配套制干方法，縮短枸杞鮮果制干時間和提高制干率具有重要的理論指導意義。為此，本研究以當前寧夏枸杞種植中普遍栽培的‘寧杞1號’和‘寧杞5號’品種為材料，通過采集不同發(fā)育時期枸杞果實，進行果實結構發(fā)育、果皮蠟質微形態(tài)、單位面積蠟質含量及蠟質組分的研究，明確不同枸杞品種果皮蠟質組分差異，為不同枸杞品種適宜促干劑的篩選以及促干劑的合理使用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為栽培于寧夏蘆花臺園林場枸杞種植基地7年生寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)品種‘寧杞1號’和‘寧杞5號’，于2020年6月～7月中旬對寧夏枸杞夏果(七寸枝)進行取樣觀察和測定，實驗采取定點定株的方法，各選取20株枸杞于6月10日用毛線標記同一天開放的花朵(花瓣紫堇色，花藥堅挺白色未開裂)，分別取花后7 d(6月17日)、15 d(6月25 日)、24 d(7月4日)和33 d(7月13日)的枸杞果實，于FAA固定液中固定，置于采樣箱帶回實驗室。

1.2 觀測指標及方法

1.2.1 果皮結構顯微鏡觀察以花后7 d、15 d、24 d和33 d的枸杞果實為材料，參照楊濤等[20]的石蠟切片法制片。切片用Leica-DMLB型顯微鏡觀察并照相。

1.2.2 果皮蠟質形貌結構掃描電鏡觀察枸杞果實果皮蠟質形貌結構觀察參照徐秀蘋等[21]的方法。分別撕取脫蠟前和脫蠟后‘寧杞1號’和‘寧杞5號’青果期、色變期和成熟期枸杞果實表皮，采用叔丁醇+乙醇不同濃度置換后冷凍干燥；叔丁醇：酒精置換濃度分別為：90%乙醇+10%叔丁醇，80%乙醇+20%叔丁醇，65%乙醇+35%叔丁醇，50%乙醇+50%叔丁醇，25%乙醇+75%叔丁醇，100%叔丁醇，每次15～20 min，最后將樣品浸泡在100%叔丁醇中-20 ℃過夜；之后放在冷凍干燥器(德國Martin Christ)內完成樣品干燥。干燥后的樣品黏貼到樣品臺上，干燥后用離子濺射儀噴金，置于鎢燈絲掃描電鏡下進行觀察。

1.2.3 果皮蠟質含量測定取青果期、色變期和成熟期30 g枸杞鮮果實，且計算出30 g果實的個數，從中隨機取20粒果實，重復3次，采用游標卡尺逐個測定果?？v徑、橫徑，按照橢球形表面積公式計算單果表面積[=4/3π×(2×縱徑×橫徑+橫徑×橫徑)][22]。然后將30 g鮮枸杞與正己烷以1∶1(g∶mL)的比例混合，常溫浸泡2 h，過濾，浸出液用旋轉蒸發(fā)儀40 ℃濃縮[23]，并經氮氣吹干后用電子天平稱重，作為GC-MS檢測樣品備用。蠟質含量的計算公式為：蠟質量濃度(μg/cm2)=(m1-m0)/S，S為30 g枸杞果實的總表面積；m1為蒸餾瓶和蠟質的質量；m0為原蒸餾瓶的質量。

1.2.4 果皮蠟質組分的GC-MS測定將前期實驗獲得的果皮蠟質樣品溶于1.5 mL正己烷中，進行GC-MS分析檢測(圖1)，每個時期樣品重復測定3次。

GC-MS的條件：HPGC6890/MS5972色譜柱：石英毛細管柱ATSE-54(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL；進樣方式為分流，分流比為40∶1；程序升溫：初始溫度50 ℃(5 min)→260 ℃(20 ℃/min)；載氣為He，載氣流量為1 mL/min；接口溫度為250 ℃；離子源溫度為200 ℃；離子源電離能為70eV。

圖1 ‘寧杞1號’枸杞果實成熟期揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow map of volatile components in mature fruit stage of L. barbarum ‘Ningqi No.1’

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 19.0統計分析軟件進行數據分析及差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 寧夏枸杞果實發(fā)育過程中果皮顯微結構的變化

枸杞果實果皮由外果皮、中果皮和內果皮組成。由圖2可知，‘寧杞1號’和‘寧杞5號’枸杞果實的外果皮均由1層緊密排列的近似方形細胞組成，隨著果實的發(fā)育，方形細胞逐漸變?yōu)檠貦M軸排列的長方形細胞，用以適應體積的增大；中果皮則由含有大液泡的薄壁細胞和小型維管束組成，在果實的發(fā)育過程中，可以明顯看到薄壁細胞的分裂和體積的增大，且‘寧杞5號’中果皮果肉細胞增大的速度明顯較‘寧杞1號’快，細胞排列疏松程度也較‘寧杞1號’高；內果皮由2層細胞構成，在果實形成初期就已明顯分化出2層長方形細胞，但其體積的增加比例低于中果皮薄壁細胞。同一采樣時期，‘寧杞5號’果皮厚度明顯大于‘寧杞1號’的果皮厚度。

A-D分別為‘寧杞1號’花后7 d、15 d、24 d和33 d果皮；E-H分別為‘寧杞5號’花后7 d、15 d、24 d和33 d果皮；Ep.外果皮；Me.中果皮；End.內果皮圖2 寧夏枸杞果實不同發(fā)育時期果皮石蠟切片A-D are peels of ‘Ningqi No. 1’ at 7, 15 24 and 33 days after anthesis respectively, and E-H are peels of ‘Ningqi No. 5’ at 7, 15, 24 and 33 days after anthesis, respectively; Ep. Exocarp; Me. Mesocarp; End. EndocarpFig.2 Fruit peel paraffin section of L. barbarum L. at different developmental stages

2.2 寧夏枸杞果皮蠟質晶體結構和果實表面積分析

根據李文佃等[24]的研究，枸杞果實發(fā)育成熟大約需要35 d，根據花和果實顏色等的變化情況可將其發(fā)育時期劃分為形成期、青果期、色變期和成熟期。通過掃描電鏡觀察(圖3，A、C、E、G、I、K)，‘寧杞1號’和‘寧杞5號’枸杞表皮細胞外側細胞壁均呈現脊狀突起的結構；在青果期脊狀突起不連續(xù)，脊和脊之間排列緊密；隨著發(fā)育時期的延后，脊狀突起的連續(xù)性逐漸增強，且脊與脊之間的間距逐漸變寬，蠟質成膜狀覆蓋于突起的脊和兩脊之間的溝內；隨果實發(fā)育成熟，推測蠟質層總體呈現逐漸增厚的趨勢。從發(fā)育時期整體來看，‘寧杞5號’果皮外表皮脊狀突起的連續(xù)性較‘寧杞1號’明顯，蠟質層的起層現象也較‘寧杞1號’明顯，兩脊之間的間隙較‘寧杞1號’略寬，蠟質排列分布的均勻性和規(guī)律性也較‘寧杞1號’強，但覆蓋在脊狀突起表皮的蠟質層較‘寧杞1號’薄。同時，經正己烷脫蠟后(圖3，B、D、F、H、J、L)，3個生育時期枸杞果皮蠟質層都能較為明顯地溶解于有機溶劑正己烷中，覆蓋在枸杞表皮的蠟質層幾乎能夠完全去除，且‘寧杞5號’的去除效果優(yōu)于‘寧杞1號’。未經去除的蠟質層經過溶劑的刺激積聚成大小不等的顆粒狀，這樣也更加便于水分能夠從沒有蠟質覆蓋的部分散失出去。

另外，參照袁慧君等[22]的枸杞果實面積的測定方法，對寧夏枸杞不同發(fā)育時期的枸杞果實表面積進行了測定與計算(圖4)，發(fā)現隨著兩品種枸杞果實逐漸發(fā)育成熟，果實的表面積不斷增大，且不同品種不同發(fā)育時期的果實表面積間差異顯著；同時，‘寧杞5號’枸杞果實表面積始終較同期‘寧杞1號’大。

2.3 寧夏枸杞果皮蠟質含量和組分分析

‘寧杞1號’和‘寧杞5號’枸杞果實果皮蠟質含量隨著發(fā)育時期先下降后上升(圖5)。其中，‘寧杞1號’青果期、色變期和成熟期的蠟質總量分別為75.52、30.88和92.27 μg/cm2，‘寧杞5號’3個時期的蠟質總量則分別為66.91、51.78和78.34 μg/cm2；‘寧杞1號’在生育期的波動更大，其果實果皮蠟質總量總體較‘寧杞5號’高。方差分析表明，‘寧杞1號’蠟質總量在青果期和成熟期均顯著高于色變期，而青果期與成熟期無顯著差異；‘寧杞5號’蠟質總量表現為成熟期顯著高于色變期，其余2個時期的蠟質總量并無顯著差異。

同時，通過GC-MS分析(表1)，‘寧杞1號’枸杞果實表皮蠟質混合物中在青果期、色變期和成熟期分別鑒定到117、84、86種物質，其中青果期、色變期和成熟期特有的物質分別有58、23和49種，同時鑒定到3個生育期共有的物質23種；‘寧杞5號’枸杞果實表皮蠟質混合物中在青果期、色變期和成熟期分別鑒定到126、80和81種物質，其中青果期、色變期和成熟期分別有特有物質64、17和17種，同時鑒定到3個生育期共有的物質43種。

參照曾瓊等[25]對植物蠟質的分類，將枸杞果實表皮蠟質混合物分為酯類、醇類、烷烴類、酮類、碘代烷烴類、醛類和酸類，‘寧杞1號’在青果期和色變期果皮蠟質組分分別有7類物質，成熟期果皮蠟質組分有6類物質，無醛類，烷烴類為3個發(fā)育時期主要組分(圖6)。‘寧杞1號’青果期和色變期的蠟質組分主要為烷烴類、醇類和碘代烷烴類，青果期峰面積百分比分別為45.6%、12.81%和7.93%，色變期則分別為47.18%、8.66%和5.77%；成熟期的蠟質組分主要為烷烴類、醇類和酯類，峰面積的百分比分別為48.42%、5.35%和6.68%?！畬庤?號’在青果期果皮蠟質組分有6類物質，無醛類；在色變期果皮蠟質組分有5類物質，無酮類和醛類；在成熟期果皮蠟質組分有6類物質，無酮類?！畬庤?號’青果期和色變期的蠟質組分主要為烷烴類、醇類和碘代烷烴類，青果期峰面積百分比分別為43.80%、14.40%、8.21%，色變期分別為56.40%、7.16%、6.27%；成熟期的蠟質組分主要為烷烴類、醇類和酯類，峰面積百分比分別為49.47%、3.73%和2.52%。

圖6 寧夏枸杞不同發(fā)育時期果皮蠟質組分的峰面積百分比Fig.6 Peak area percentage of waxy components of L. barbarum pericarp at different developmental stages

2.4 寧夏枸杞果皮蠟質組分的主成分分析

2.4.1 ‘寧杞1號’主成分分析結果(表2和表3)顯示，‘寧杞1號’在青果期可以提取到1個特征值大于1的主成分，特征值為11.448，方差貢獻率為95.397%，累計貢獻率為95.397%；青果期果皮蠟質的第一主成分為二十七烷、二十八烷、廿六烷、1-碘代-三十烷烴、二十二烷酸、二十四烷酸和[1R-(1α，3a.β，4α，8a.β，9S*)]-十氫-1，5，5，8-四甲基-1，4-甲基唑烯-9-醇。這些成分都屬于蠟質組分中的烷烴類、酸類、碘代烴類和醇類?！畬庤?號’在色變期可以提取到2個特征值大于1的主成分，特征值分別為6.441和4.559，方差貢獻率分別為58.554%和41.446%，累計貢獻率為100%。色變期果皮蠟質的第一主成分主要為1-碘代-二十八烷、十八烷基-3,5雙(1,1-)-4-二甲基乙基羥基苯丙酸酯、2-己基-1-癸醇和二十二烷酸等；第二主成分主要為δ8(14)-異海松酸、11，13-二甲基-12-十四烯-1-醇醋酸酯、二十八烷、β-香樹素和廿六烷等，這些成分都屬于蠟質組分中的烷烴類、酯類、醇類、酸類和碘代烷烴類?！畬庤?號’在成熟期可以提取到2個特征值大于1的主成分，特征值分別為7.143和5.857，方差貢獻率分別為54.944%和45.056%，累計貢獻率為100%。成熟期果皮蠟質的第一主成分主要為雙(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸二丁酯、二十七烷、順-9-十四烯酸異丁酯、11，13-二甲基-12-十四烯-1-醇醋酸酯、二十二烷酸和β-香樹素；第二主成分主要為2-辛基-1-十二醇、二十四烷酸、1-(乙烯氧基)-十八烷、[1R-(1α，4a.β，5β，6α，8aβ)]-2(1H),5-[2-(3-呋喃基)乙基]八氫-1，5，6，8-四甲基-萘酮、法尼醇異構體a，這些都屬于蠟質組分中的酯類、烷烴類、酸類、醇類和酮類。

表2 寧夏枸杞不同發(fā)育時期主組分的特征值及累計貢獻率

表3 ‘寧杞1號’不同發(fā)育時期枸杞果實組分矩陣

表4 ‘寧杞5號’不同發(fā)育時期枸杞果實成分矩陣

2.4.2 ‘寧杞5號’主成分分析結果(表2、表4)顯示，‘寧杞5號’在青果期可以提取到2個特征值大于1的主成分，特征值分別為10.09和4.91，方差貢獻率分別為67.268%和32.732%，累計貢獻率為100%；青果期果皮蠟質的第一主成分主要為廿六烷、十七烷基-環(huán)氧乙烷、二十八烷、β-香樹素、1-碘代-三十烷、二十二烷酸和十八烷基-3,5雙(1,1-)-4-二甲基乙基羥基苯丙酸酯；第二主成分主要為1-乙烯氧基-十八烷和二十二醇。這些成分為蠟質組分中的烷烴類、酸類、醇類、酯類和碘代烷烴類?！畬庤?號’在色變期可以提取到2個特征值大于1的主成分，特征值分別為11.355和5.645，方差貢獻率分別為6.794%和33.206%，累計貢獻率為100%；色變期果皮蠟質的第一主成分主要為二十七烷、2-己基-1-癸醇、二十烷酸、十八烷基-3,5雙(1,1-)-4-二甲基乙基羥基苯丙酸酯、十六烷基-環(huán)氧乙烷、16-氧基甲基-環(huán)氧乙烷、9-十八碳烯酸(Z)-苯甲酯和1-碘代-三十烷；第二主組分主要為二十二烷酸和廿六烷。這些成分屬于蠟質成分中的烷烴類、酯類、酸類、碘代烷烴類和酸類。‘寧杞5號’在成熟期可以提取到2個特征值大于1的主成分，特征值分別為9.501和5.499，方差貢獻率分別為63.342%和36.658%，累計貢獻率為100%；成熟期的第一主成分主要為二十一烷、1-碘代-二十八烷、二十八烷、11，13-二甲基-12-十四烯-1-醇醋酸酯和二十七烷；第二主成分主要為二十碳烷和十五烷。這些成分為蠟質組分中的烷烴類、酯類和碘代烷烴類。

3 討 論

植物表皮的蠟質晶體在不同植物間都有所差異，蠟質的晶體形態(tài)有片狀、桿狀、管狀、棒狀等類型。Barthlott等[26]發(fā)現晶體的形態(tài)在植物生長發(fā)育過程中會隨著蠟質含量的變化而有所改變。也有研究表明，蠟質的組分對蠟質的結構有一定的影響，當烷烴含量占主導地位時，植物蠟質結構表現為無晶體或表面光滑；當蠟質組分多為β-二酮和羥基-β-二酮時，蠟質結構則為管狀或棒狀結構；而當脂肪醇含量較高時，蠟質結構則為片狀結構[27-28]。本研究中，青果期蠟質結構均呈膜狀結構覆蓋在枸杞外側呈脊狀突起的外果皮上，隨著發(fā)育時期的延后，色變期外果皮表面脊狀突起的規(guī)律性和連續(xù)性更加明顯，果皮蠟質依然均勻分布在呈脊狀突起的外果皮上，成熟期則呈現出‘寧杞1號’果皮蠟質層比‘寧杞5號’的更加致密和均勻，導致這種現象的原因可能與果實發(fā)育后期‘寧杞5號’果實膨大速率大于‘寧杞1號’有關。這與王永旭[29]的研究結果一致，利用SEM掃描電鏡觀察不同發(fā)育時期蘋果果皮蠟質形態(tài)，果皮蠟質隨著發(fā)育時期的延后覆蓋程度逐漸增加，發(fā)育末期完全覆蓋果皮且表皮蠟質逐漸積累。也與Koch等[30]研究的研究結果相同，果皮蠟質為光滑的蠟膜層，是由以烷烴類物質為主的多種組分共同作用而成。因此，觀察枸杞果實整個發(fā)育過程發(fā)現，蠟質積累不斷增加，而果實發(fā)育后期表皮蠟質積累厚度降低，這可能是由于隨著枸杞果實發(fā)育時期的延后，果實直徑的增大引起表面積的突增造成的，同時也導致了蠟質層的厚度較前期有所下降，造成這些結果的原因都需要進一步研究。

植物表皮蠟質具有多種功能，如抵御外界侵害、果實貯藏保鮮、防止非氣孔性水分散失和影響果實品質等[2, 31-32]。植物表皮蠟質含量的高低也對植物的功能有一定的影響。有研究發(fā)現突變體wsll植株的蠟質含量低于正常植株，且抗旱能力也弱于野生型植株，表明植株抗旱能力與蠟質含量呈正相關[33]。張海祿等[34]關于大麥葉片的研究也發(fā)現，大麥葉片的蠟質含量越高，水分利用效率越高，表明葉片表皮蠟質與水分利用率呈顯著正相關。本研究發(fā)現，從青果期到成熟期，枸杞果皮蠟質總量先下降后上升，‘寧杞1號’枸杞果皮蠟質總量在青果期和成熟期顯著高于色變期，‘寧杞5號’枸杞果皮蠟質含量在成熟期顯著高于色變期。這與Leide等[35]和Kosma等[36]在番茄上的研究結果不一致，Li等[37]在蘋果中的研究發(fā)現，隨果實的逐漸成熟，蘋果蠟質總量表現為上升的趨勢，也與本研究結果不同，可能是植物間的遺傳差異以及種植年份的不同所致。

角質膜的滲透性不一定與其厚度或者蠟質的覆蓋程度有關，很大程度上可能與其化合物的組成或者結構相關。Leide等[38]在番茄突變體中發(fā)現，突變體角質層的水分透性增加與果實蠟質三萜類和甾醇類物質含量呈正相關，與正構烷烴、醛類和酯類含量呈負相關，表明果實蠟質組分對角質層水分透性有影響。王永旭[29]報道，蘋果果皮蠟質主要含有長鏈烷烴、脂肪醇、脂肪醛、游離脂肪酸和三萜類等物質，但卻在葡萄和草莓中難以檢測到相同的蠟質組分[8, 39]，表明植物種類不同，植物蠟質組分也不盡相同。在生產中，‘寧杞1號’和‘寧杞5號’枸杞果實制干率后的商品率分別為71.73%和41.35%(課題組數據未發(fā)表)。本研究利用GC-MS技術測定了‘寧杞1號’和‘寧杞5號’枸杞不同發(fā)育時期果皮的蠟質組分，它們都含有酯類、醇類、烷烴類、酮類、碘代烷烴類、醛類和酸類，其蠟質組分沒有差異，但蠟質組分所占的面積百分比和碳鏈的分布有差異；蠟質組分的占比可能影響枸杞果實表皮的水分透性，烷烴類、醇類、醛類和酯類具有保持果實水分的功能，且阻止水分滲透作用的功能較強。

進一步主成分分析的結果表明，在青果期、色變期和成熟期3個生育時期，‘寧杞5號’果實蠟質組分比‘寧杞1號’含有更多的烷烴類物質，而烷烴類物質可以增強果實的持水能力[40]，表明‘寧杞5號’較‘寧杞1號’果皮的保水性更強，說明在枸杞干制過程中‘寧杞1號’較‘寧杞5號’更易制干。這與Isaacson等[13]在番茄突中的研究一致，即野生型番茄果皮的蠟質中烷烴類蠟質組分高于突變體植株，說明蠟質組分中保水性最好的組分為烷烴類物質。

綜上所述，影響不同品種枸杞果實制干的原因在于枸杞果皮蠟質含量、結構和蠟質組分。烷烴類成分能夠有效阻止果實體內水分的散失，‘寧杞5號’果皮蠟質中烷烴類成分多于‘寧杞1號’，比‘寧杞1號’的保水性更強，因此生產上‘寧杞1號’較‘寧杞5號’枸杞果實更易制干。該研究結果初步揭示了枸杞果皮蠟質的積累規(guī)律和不同品種間蠟質組分差異，進一步為解析枸杞果皮蠟質的分子調控奠定了基礎，同時也為采后果實的保鮮技術與制干技術改良提供了新的方向。