‘潘那利’番茄堿性螺旋環(huán)螺旋轉錄因子基因的克隆與表達分析

胡佳蕙，王柏柯，李 寧，余慶輝，王 娟*

(1 新疆農業(yè)科學院 園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2 新疆農業(yè)大學 園藝學院，烏魯木齊 830052)

堿性螺旋環(huán)螺旋(basic/Helix-Loop-Helix, bHLH)轉錄因子結構域高度保守，由堿性區(qū)及螺旋環(huán)螺旋2個部分組成[1]，即N端的堿性區(qū)域和緊隨其后的堿性螺旋環(huán)螺旋區(qū)域。這2個區(qū)域的功能分別是DNA結合和促進蛋白-蛋白相互作用[2-3]。bHLH編碼蛋白能識別靶基因的核心DNA序列元件，并與其相互作用[4-5]。近期研究顯示，植物bHLH轉錄因子家族與植物各階段的生長發(fā)育密切相關，參與多種轉錄調控途徑及應對各種環(huán)境脅迫[6]。1989年，首次在玉米中發(fā)現調控R基因的bHLH轉錄因子[7]，隨后發(fā)現其廣泛存在于植物界，如在模式植物擬南芥和水稻中分別鑒定出167個和177個bHLH轉錄因子[8-9]。

研究表明，bHLH能夠通過ABA信號轉導途徑參與植物多種非生物脅迫反應。在擬南芥中，AtbHLH92[10]、AtbHLH17[11]和AtbHLH122[12]通過ABA依賴途徑響應干旱、鹽、氧化或低溫脅迫。葡萄VvbHLH1通過ABA信號通路賦予轉基因擬南芥更好的耐鹽性和抗旱性[13]。最近，有研究發(fā)現，在擬南芥中異源表達MfbHLH38能夠調節(jié)細胞的滲透平衡，提高保水能力，增強脅迫誘導的氧化清除系統(tǒng)，顯著提高了擬南芥對鹽和干旱的耐受性，并可能參與了ABA依賴的脅迫響應途徑[14]。

在大腸桿菌(Escherichiacoli)中異源表達植物非生物脅迫響應基因，已成為初步探索基因功能的有效方法。Narayan等[15]在E.coli中異源表達魚腥藻(Anabaenasp.)的PCC 7120all3940(一個Dps家族基因)，能有效提高受體E.coli的非生物脅迫耐受性；在E.coli中異源表達異子蓬(Suaedaaralocaspica)SaPEPC1(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)，能夠促進重組細菌在非生物脅迫下的生長[16]；而在E.coli中過表達番茄SlWRKY6，則降低了重組菌的脅迫耐受性[17]。此外，在抗旱轉基因小麥安全性風險評價過程中，發(fā)現轉基因抗旱小麥中的表達蛋白與E.coli表達的His-WK融合蛋白具有相似的功能[18]。

野生番茄‘潘那利’(SolanumpennelliiCorrell)多分布于干旱的河床與巖石斜坡。經過自然界長期篩選，對干旱環(huán)境產生了較強的耐受力，其已進化出許多抗旱、耐鹽等優(yōu)秀突變體品種(系)，積累了豐富的耐旱基因資源[19]?；谄鋬?yōu)良的抗旱能力，本研究從野生‘潘那利’番茄中分離得到一個bHLH轉錄因子基因SpbHLH89，通過生物信息學、亞細胞定位等分析其編碼蛋白質的結構；同時在E.coli中異源表達SpbHLH89，檢測重組菌對干旱脅迫的耐受性，初步研究該基因的耐旱功能，為番茄抗逆育種提供優(yōu)良的候選基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料栽培和處理

本實驗所用植物材料‘潘那利’番茄(S.pennellii)種子由番茄遺傳資源中心TGRC(Tomato Genetics Resource Center)引進。選取飽滿成熟種子播種于營養(yǎng)土和蛭石(體積比為2∶1)的育苗缽中，在溫度25 ℃、光照16 h/黑暗8 h、相對濕度10%～20%、光照強度100 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)5～6周，取幼嫩葉片液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用于農桿菌瞬時轉化實驗的本氏煙草(NicotianabenthamianaKarel Domin)，栽培條件同上，于煙草生長5～6周時選取完全展開的葉片進行注射。

1.2 方 法

1.2.1 番茄總RNA提取及SpbHLH89基因克隆利用植物總RNA提取試劑盒DP441(天根，北京)提取番茄葉片總RNA，利用5×All-In-One RT MasterMix(AccuRT Genomic DNA Removal Kit，Abm，蘇州)合成cDNA，-80 ℃貯存?zhèn)溆?。利用SpbHLH89(Sol Genomics登錄號Sopen04g001150)基因序列設計引物(表1)，以cDNA為模板，分別利用引物pSuper1300-SpbHLH89-GFP-F/R和pET30a-SpbHLH89-F/R擴增目的片段連接至pMD19-T克隆載體(TaKaRa，大連)上，利用限制性內切酶XhoⅠ，或XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切重組質粒pMD19-SpbHLH89，回收純化目的片段連接至原核表達載體pET30a或植物雙元表達載體pSuper1300-GFP上。PCR鑒定陽性重組菌落，重組質粒雙酶切鑒定測序。序列比對正確的質粒分別轉化E.coliBL21(DE3)和農桿菌GV3101感受態(tài)細胞。

1.2.2 生物信息學分析及亞細胞定位通過在線工具ProtParam分析SpbHLH89的基本理化性質；利用SMART(http://smart.embl.de)分析蛋白質結構域。通過在線軟件NCBI和GenBank數據庫檢索與SpbHLH89高度相似的13個不同物種的序列，利用DNAMAN8.0對其進行多序列比較，分析bHLH轉錄因子家族的保守結構；同時利用MEGA X軟件構建系統(tǒng)進化樹，利用Neighbor-joining分析方法分析進化親緣關系。

亞細胞定位分析時，將該基因開放閱讀框的cDNA 3′端與編碼綠色熒光蛋白基因的開放閱讀框的5′端融合。重組表達載體質粒利用電轉化法，轉化至農桿菌GV3101。將重組農桿菌GV3101∷pSuper1300-SpbHLH89-GFP活化后，1 200 r/min離心棄上清，棄掉廢液，用煙草轉化液重懸菌液調至OD600為0.8；將重組農桿菌、番茄叢矮病毒P19蛋白(促進異源蛋白的表達)和類鈣調磷酸酶亞基B蛋白CBL(Calcineurin B-like protein)的農桿菌按體積比=3∶2∶3混合，室溫靜置2 h；注射葉片，并標記注射范圍。注射后保持煙草植株生長條件濕潤。3 d后，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 800，Carl Zeiss，德國)進行觀察，通過ZEN Imaging Software(Version 2.3)捕捉熒光信號并獲取圖像。

1.2.3SpbHLH89基因表達分析1)組織特異性表達。取開花期‘潘那利’番茄植株的莖、葉、花，液氮研磨提取植物RNA并反轉錄生成cDNA。2)干旱響脅迫下表達。生長5～6周的‘潘那利’番茄植株進行模擬干旱脅迫(0、200、300、500、600 mmol/L甘露醇)處理5 h，并選擇300 mmol/L甘露醇處理植株，分別在脅迫處理前及處理后1、3、6、9 h采取植株葉片，用液氮速凍后與-80 ℃貯存?zhèn)溆?。然后提取其葉片RNA并反轉錄成cDNA。以Actin基因作為內參，用QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Qiagen, 德國)和LightCycler96(Roche, 美國)進行qRT-PCR，引物序列見表1。

1.2.4SpbHLH89基因原核表達活化攜帶有重組原核表達載體pET-30a-SpbHLH89的E.coliBL21(DE3)菌株，利用0.5 mmol/L IPTG誘導表達3 h。制備蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，檢測特異表達目標蛋白。將未染色SDS-PAGE膠上的蛋白樣品利用半干轉膜儀轉移至PVDF膜后，用2%脫脂奶粉將鼠抗His-標簽的單克隆抗體稀釋2 000倍。第二抗體羊抗鼠IgG稀釋10 000倍，進行Western

bloting檢測。顯色用全式金EasySee?Western Blot Kit(DW101-01)避光孵育30 s后于LAS 4000超靈敏化學發(fā)光成像儀(Fujifilm，日本)拍照。

1.2.5 重組菌的脅迫耐受性測定以E.coliBL21(DE3)∷pET-30a為對照菌株，測定重組菌E.coliBL21(DE3)∷pET-30a-SpbHLH89的干旱脅迫耐受性。將IPTG誘導表達3 h后的重組菌和對照菌菌液利用液體LB培養(yǎng)基調節(jié)OD600至1.0，按1% (V/V)接種在分別含有0、200、400、600、800 mmol/L甘露醇和含有0、200、300、400、500 mmol/L NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)12 h后測定菌液OD600，記錄并分析重組菌的干旱脅迫耐受性。將誘導的菌液接種至400 mmol/L NaCl和600 mmol/L甘露醇的LB液體培養(yǎng)基中，每隔2 h取1次樣，測菌液OD600，繪制生長曲線。

1.2.6 統(tǒng)計分析對本體表達分析qRT-PCR數據及重組菌脅迫耐受性測定數據均采用軟件Graphad Prism 8.0(GraphPad Software，San Diego，USA)分析，并進行單因素方差分析(One-way ANOVA)；通過多重比較進行差異顯著性分析。

表1 本研究所用引物

2 結果與分析

2.1 番茄SpbHLH89基因的克隆

SpbHLH89基因(Sol Genomics登錄號Sopen04g001150)的開放閱讀框長度為684 bp，編碼227個氨基酸。以‘潘那利’番茄葉片cDNA為模板擴增SpbHLH89基因的開放閱讀框序列，將其構建于重組質粒pET30a-SpbHLH89，pSuper1300-SpbHLH89-GFP并進行雙酶切驗證及測序(圖1)，將重組載體質粒分別轉化E.coliBL21(DE3)及農桿菌GV3101,通過PCR鑒定重組菌中目標片段陽性。

M.DL2000；A.SpbHLH89基因PCR擴增及重組質粒的雙酶切：1.SpbHLH89；2.重組質粒；3.Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶切；B.重組菌菌落PCR：+.陽性對照；1-2.pET30a-SpbHLH89；3-5.pSuper1300-SpbHLH89-GFP圖1 SpbHLH89基因的cDNA擴增及重組質粒的雙酶切鑒定M. DL2000; A. PCR of SpbHLH89 gene and double digestion of recombinant plasmid: 1. SpbHLH89; 2. Cloning vector recombinant plasmid; 3. Kpn Ⅰ and Xho Ⅰ digested recombinant plasmid; B. PCR of recombinant. +. Positive control; 1-2. pET30a-SpbHLH89; 3-5. pSuper1300-SpbHLH89-GFPFig.1 PCR amplification of SpbHLH89 and double digestion of recombinant plasmids

2.2 生物信息學分析

通過NCBI網站BlastP對SpbHLH89氨基酸序列進行同源比對，保守結構域分析顯示，該序列具有bHLH的典型結構域，SpbHLH89氨基酸序列與芝麻(Sesamumindicum)、菠菜(Spinaciaoleracea)、豇豆(Vignaunguiculata)等物種的bHLH轉錄因子相似性較高(圖2)。系統(tǒng)進化樹結果顯示，番茄SpbHLH89與煙草NtbHLLH094相似性最高(圖3)。

Sp.‘潘那利’番茄；Si.芝麻；So.菠菜；Vr.綠豆；Vu.豇豆；Cc.黃燈籠辣椒；Oe.橄欖樹；Ap.相思子；It.三裂葉薯；Cq.藜麥；Nt.擬絨毛煙草；Sl.番茄；Ce. 咖啡；Ca.辣椒；圖3同圖2 SpbHLH89與其他物種的bHLH序列比對Sp. Solanum pennellii; Si. Sesamum indicum; So. Spinacia oleracea; Vr. Vigna radiata; Vu. Vigna unguiculata;Cc. Capsicum chinense; Oe. Olea europaea; Ap. Abrus precatorius; It. Ipomoea triloba; Cq. Chenopodium quinoa;Nt. Nicotiana tomentosiformis; Sl. Solanum lycopersicum; Ce. Coffea eugenioides; Ca. Capsicum annuum; The same as Fig.3Fig.2 Analysis of conserved domains of SpbHLH89 and its highly homologous proteins

圖3 SpbHLH89與其他物種bHLH轉錄因子進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of SpbHLH89 and bHLH transcription factors in different species

2.3 SpbHLH89基因表達分析

qRT-PCR分析SpbHLH89在‘潘那利’番茄中的表達，結果表明，SpbHLH89在番茄不同組織中均有表達(圖4，A)。不同濃度甘露醇(0、200、300、500、600 mmol/L)處理下，SpbHLH89的表達隨干旱脅迫增強而升高，在500 mmol/L時，表達量達到最高值，且顯著高于處理前及其他處理組(圖4，B)。在500 mmol/L甘露醇處理下,隨著脅迫時間的增加其相對表達量逐漸增高，在處理6 h時達到最高值(圖4，C)。

A.不同器官中的表達；B.不同濃度甘露醇脅迫下的表達；C.500 mmol/L甘露醇處理不同時間的表達；不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)圖4 ‘潘那利’番茄SpbHLH89表達模式分析A.Expression in different organs; B.Expression under different concentrations of mannitol stress; C.Expression under the mannitol of 500 mmol/L at different time points. Different normal letters indicate significant differences (P<0.05)Fig.4 Expression patterns of SpbHLH89 in S. pennellii

2.4 SpbHLH89的亞細胞定位分析

bHLH作為轉錄因子調控基因表達，通常定位于細胞核并在其中發(fā)揮調節(jié)功能[9]，SpbHLH89中預測的NLS(圖2)表示它可能在細胞核中發(fā)揮作用。為了證實這一推測，利用融合綠色熒光蛋白的SpbHLH89蛋白轉化本氏煙草葉片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，SpbHLH89-GFP轉化細胞的細胞核內特異性出現強烈的綠色熒光，表示轉錄因子SpbHLH89蛋白主要在植物細胞核中表達，這與預測相符(圖5)。

2.5 SpbHLH89蛋白免疫印跡分析

SDS-PAGE結果顯示，pET30a-SpbHLH89表達的特異蛋白條帶在35 kD 與25 kD 之間(圖6，A)。Western bloting分析顯示，誘導表達的攜帶His-標簽重組蛋白能與單克隆抗體發(fā)生特異反應，在約31 kD 處產生單一免疫條帶，表明SpbHLH89-His重組蛋白正確表達(圖6，B)。

A.SDS-PAGE：M.蛋白質分子量標準；1.IPTG誘導的pET-30a-SpbHLH89；2.未誘導的重組菌；B.Western bloting：M.預染蛋白質分子量標準；1.重組菌的IPTG誘導；2.重組菌未誘導圖6 SpbHLH89重組蛋白的SDS-PAGE及Western bloting分析A. SDS-PAGE: M. Standard molecular weight of protein;1. IPTG induced pET-30a-SpbHLH89; 2. pET-30a-SpbHLH89 was not induced; B. Western blotting: M. Molecular weight standards for prestained proteins; 1. IPTG induced pET-30a-SpbHLH89; 2. pET-30a-SpbHLH89 was not inducedFig.6 Analysis of recombinant SpbHLH89 protein by SDS-PAGE and Western blotting

2.6 重組菌的干旱脅迫耐受性

為進一步探究SpbHLH89在響應非生物脅迫中的生物學功能，分析了在E.coliBL21(DE3)中異源表達SpbHLH89對大腸桿菌耐旱性的影響，比較不同濃度鹽或甘露醇脅迫下重組菌E.coliBL21(DE3)∷pET30a-SpbHLH89與對照菌株E.coliBL21(DE3)∷pET30a的生長情況。結果(圖7，A、B)顯示，隨著鹽或甘露醇濃度增加，鹽、干旱脅迫逐漸嚴重，菌株生長速度逐漸降低，但重組菌在脅迫下比對照菌株生長狀況更好。

重組菌與對照菌株在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(圖7，C)，發(fā)現重組菌與對照菌株在12 h內的生長情況基本一致。進一步進行600 mmol/L甘露醇模擬干旱脅迫及400 mmol/L NaCl處理(圖7，D、E)，發(fā)現對照菌株的生長受到嚴重抑制，而表達SpbHLH89重組蛋白的菌株相較于對照菌株生長狀態(tài)顯著提高。說明SpbHLH89的表達增強了受體大腸桿菌對鹽、干旱脅迫的耐受性。

不同小寫字母表示同一處理不同濃度間差異顯著(P<0.05)，*、***和 ****分別表示同一濃度處理重組菌與對照菌之間在0.05、0.001和0.0001水平差異顯著性(P<0.05, P<0.001和P<0.0001)圖7 重組菌脅迫耐受性Different normal letters indicate significant differences (P<0.05). *, *** and **** represent significant difference(P<0.05, P<0.001 and P<0.0001) between the recombinant and control bacteria strains at the same concentrationFig.7 Stress tolerance of recombinant bacteria

3 討 論

bHLH轉錄因子是植物第二大轉錄因子家族，其主要在細胞核中發(fā)揮調節(jié)作用[20]。多項研究表明該轉錄因子能積極響應多種逆境脅迫[21]，低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫條件可誘導bHLH轉錄因子表達[22-23]。在擬南芥中，AtbHLH122受干旱脅迫表達量增加[14]。在水稻中，bHLH轉錄因子OsbHLH148和OsbHLH006通過參與茉莉酸信號途徑，調節(jié)相關基因的表達，進而提高植株干旱耐受性[24]。在梨中，通過對PbrbHLH基因家族的鑒定及表達模式分析，結果表明PbrbHLH能積極響應干旱和冷脅迫[25]。在楊樹中，PebHLH35經干旱和鹽脅迫其表達水平提高[26]。在蘋果中MdbHLH106L的表達水平和啟動子活性在鹽脅迫下呈現顯著增強[27]。本研究結果顯示，潘那利番茄SpbHLH89主要定位于細胞核，該轉錄因子受干旱脅迫誘導，其表達量隨脅迫程度加劇而明顯增高。

為進一步驗證SpbHLH89的耐旱功能，本研究借助原核表達途徑，將潘那利番茄SpbHLH89在E.coli中異源表達。據研究報道在E.coli中異源表達非生物脅迫相關基因可初步驗證其脅迫耐受性，例如大豆抗旱負調控基因GmGols，其降低了重組菌的活力，表現出對干旱脅迫更加敏感[29]；番茄SlWRKY16的抗逆分析研究中，也顯示表達融合蛋白WRKY的重組大腸桿菌，降低了自身鹽、旱脅迫耐受性[30]。本研究結果顯示，在E.coli異源表達SpbHLH89可顯著提高重組菌對鹽、旱脅迫的耐受性，此結果與Wang等[28]結果一致，初步實現對SpbHLH89的耐旱功能驗證，然其在植物中抗逆功能有待進一步研究。