香蕉MaSNAT2基因的克隆與表達分析

劉嘉鵬，武 歡，王 斌，伍俊為，程春振,2，黃玉吉*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350002；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西太谷 030801)

自褪黑素(N-乙酰基-5甲氧基色胺，N-acetyl-5-methoxytrytamine)被Lerner等[1]在牛松果體中發(fā)現(xiàn)以來，其在動物晝夜節(jié)律、睡眠、體溫、季節(jié)繁殖及免疫系統(tǒng)等的調(diào)控作用被廣泛揭示和關(guān)注[2-4]。1995年褪黑素于高等植物中被發(fā)現(xiàn)[5-6]，從此開啟植物褪黑素研究的熱潮。植物褪黑素是一種生長調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)控植物生長發(fā)育[7-8]和生物及非生物脅迫響應(yīng)[9-11]。其合成途徑以色氨酸為前體，通過TDC(tryptophan decarboxylase)、T5H(tryptamine 5-hydroxylase)或TPH(tryptophan hydroxylase)、SNAT(serotonin N-acetyltransferase)和ASMT(acetylserotonin-O-methyltransferase)或COMT(caffeic acid O-methyltransfer-ase)等酶催化的酶促反應(yīng)合成[9]。其中，SNAT酶催化最后一步或倒數(shù)第二步反應(yīng)[10-11]，編碼該酶的基因首次從水稻中被鑒定獲得[12-13]，之后陸續(xù)在多種植物中被鑒定研究[14-16]。

SNAT不僅催化褪黑素的合成[17-18]，在植物逆境響應(yīng)過程中也扮演著重要角色[9]。藍藻SNAT在70 ℃仍具有較高催化活性[19]；重組水稻SNAT在55 ℃的酶活性比30 ℃提高了16倍，并通過增加褪黑素含量提高了水稻的耐熱性[13, 20]；火炬松SNAT 酶在 55 ℃ 時表現(xiàn)出較高的催化活性[16]。除高溫脅迫外，SNAT在響應(yīng)其他生物脅迫及非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用。比如，抑制GhSNAT1基因的表達，降低了棉花對病原菌的抵抗力[21]；異源過表達葡萄VvSNAT2基因的擬南芥褪黑素含量增加，白粉病抗性增強[15]；異源過表達蘋果MzSNAT5 的擬南芥褪黑素含量增加，耐旱性提高[11]。Byeon等[22]研究發(fā)現(xiàn)，抑制水稻內(nèi)源SNAT的表達會導(dǎo)致褪黑素含量降低、生長發(fā)育滯后。

鑒于SNAT在植物生長發(fā)育和抗逆防御反應(yīng)中的重要作用，本研究以‘巴西蕉’為材料對香蕉MaSNAT進行了克隆和生物信息學(xué)分析，研究了其在不同激素、外源褪黑素及低溫處理下的表達模式，為揭示香蕉MaSNAT的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用‘巴西蕉’(Musaacuminatacv. ‘Brazil’，AAA group)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口試驗站提供。將長勢一致的‘巴西蕉’進行ABA、GA3、MeJA、褪黑素及低溫處理。激素處理方法參考劉嘉鵬等[23]的方法：分別使用100 μmol·L-1ABA、100 μmol · L-1GA3和100 μmol·L-1MeJA溶液噴淋香蕉葉片至充分濕潤，在處理0、4、8、12、24和48 h后收集樣品。使用100 μmol·L-1褪黑素處理后將植株分為兩組，分別放入28 ℃和4 ℃光照培養(yǎng)箱，于處理前及 處理12 h后觀察植株表型并取樣。以上所有處理均重復(fù)3次。使用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，China)試劑盒提取葉片RNA；使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，China)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA用于PCR擴增；使用HifairⅢ 1stStrand cDNA Synthesis逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TESEN，China)獲得cDNA用于qRT-PCR。

1.2 方 法

1.2.1MaSNAT基因的鑒定及克隆從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu)下載獲得水稻OsSNAT蛋白序列[24]，參考劉范等[25]的方法鑒定香蕉MaSNAT。具體方法為：使用香蕉蛋白序列構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫，以水稻SNAT蛋白序列進行本地Blast搜索，篩選條件為：E<1e-5，目標(biāo)分值>50。通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)下載Acetyltransf_7 (Pfam13508) 的隱馬氏模型[9]，使用hmmer 3.0軟件篩選出含有Acetyltransf_7結(jié)構(gòu)域的香蕉蛋白，并使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行結(jié)構(gòu)域驗證。從香蕉基因組(https://banana-genome-hub.southgreen.fr)下載獲得了2條基因MaSNATs的gDNA、CDS和蛋白序列，二者僅相差18 bp，因此使用DNAMAN軟件，根據(jù)CDS序列設(shè)計出1對引物(F: ATGCCTTTCGGCGCTTCCA，R: CTAAT-ATCTTGGGTACCAG，目的片段長度分別為726 和744 bp)。參考劉嘉鵬等[26]的方法使用25 μL 體系進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物回收純化后進行TA克隆，挑取9個陽性單菌落送至鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析參考劉嘉鵬等[23,26]的方法，對克隆獲得MaSNATs基因進行生物信息學(xué)分析(表1)，將MaSNATs蛋白序列進行Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)搜索，篩選相似度大于70%，覆蓋度高于80%，E-value小于1e-5的同源蛋白用于蛋白序列比對及進化樹構(gòu)建。

表1 本研究所用生物信息學(xué)軟件

1.2.3 實時熒光定量PCR利用DNAMAN軟件根據(jù)MaSNAT2的CDS序列設(shè)計實時熒光定量PCR引物(F：GTGCTGGATTCATAATGGAC-TC，R：TCTGCTCAAATGTTCCGTC，224 bp)，以CAC內(nèi)參基因(CAC-F：CTCCTATGTTGCTCG-CTTATG，CAC-R：GGCTACTACTTCGGTTCT-TTC)進行qRT-PCR擴增。使用2-ΔΔCT法計算MaSNATs基因相對表達量[26]。使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析后，使用GraphPad Prism 5軟件作圖[23]。

1.2.4 褪黑素含量測定參考Wei等[27]的方法使用江萊生物科技有限公司生產(chǎn)的植物褪黑素酶聯(lián)免疫吸附試劑測定試劑盒測定CK、M、T和MT組香蕉葉片褪黑素含量。利用SPSS軟件分析MaSNAT2基因相對表達水平與內(nèi)源褪黑素含量的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaSNATs基因的鑒定、克隆及基因結(jié)構(gòu)

從香蕉基因組中鑒定獲得2個SNAT蛋白，根據(jù)基因組ID分別命名為 MaSNAT1(Ma05_p32060.1)和MaSNAT2(Ma05_p32060.2)。MaSNAT1和MaSNAT2的CDS長度分為726和744 bp(圖1)，MaSNAT1僅比MaSNAT2缺少一段18 bp的序列(GTAGGTCTCCAGGCACAG)。使用RT-PCR僅克隆獲得1條長度約740 bp的目的條帶，測序結(jié)果顯示該序列長度為741 bp(圖2)，比香蕉基因組的MaSNAT2少3 bp，相似度達98.92%，說明成功獲得了‘巴西蕉’MaSNAT2，而MaSNAT1在‘巴西蕉’中不表達?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示MaSNAT2基因具有7個內(nèi)含子和8個外顯子(圖3)。

MaSNAT2為巴西蕉SNAT基因，SNAT1與SNAT2為小果野蕉SNAT基因。黑框為SNAT1與SNAT2差異堿基圖1 巴西蕉和小果野蕉SNAT基因CDS序列比對結(jié)果MaSNAT2 is Brazil banana SNAT gene, SNAT1 and SNAT2 are Musa acuminata subsp. malaccensis SNAT gene. The black box is the base difference between SNAT1 and SNAT2 geneFig.1 Sequence alignment results of the SNAT CDS sequences from ‘Brazil’ banana and Musa acuminata subsp. malaccensis

M．DL2000圖2 MaSNAT2 cDNA擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of the amplified complementary sequence of MaSNAT2

紅框為Acetyltransf_7結(jié)構(gòu)域圖3 MaSNAT2保守結(jié)構(gòu)域The red box is the Acetyltransf_7 domainFig.3 Conserved domains in MaSNAT2

β折疊(28%)和無規(guī)則卷曲(13%)組成。MaSNAT2三級結(jié)構(gòu)與水稻OsSNAT相似度為81.60%。

2.2 香蕉MaSNAT2生物信息學(xué)分析

ExPASy預(yù)測結(jié)果顯示MaSNAT2編碼一個分子式為C1254H1925N327O354S8，具有246 aa，相對分子量為27 502.54，等電點為6.20，脂肪系數(shù)和親水性分別為88.37和-0.123的不穩(wěn)定蛋白。MaSNAT2蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，具有葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽；亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于葉綠體。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示MaSNAT2主要由α螺旋(37%)、結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示MaSNAT2的C端159～231 aa間存在乙酰轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域(Acetyltransf_7)，182～195 aa間存在輔酶A結(jié)合位點(圖3)。保守基序預(yù)測結(jié)果顯示MaSNAT2具有15個保守基序，基序NATIWD、YQGQGLG、VEQLIR、GMARAT、DFYKNL、TLFADNK、VLLQRD和VLVDPS等8個基序是組成結(jié)構(gòu)域Acetyltransf_7的保守序列。

基于水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，使用STRING在線軟件預(yù)測了MaSNAT2潛在互作蛋白。結(jié)果(圖4)顯示，香蕉MaSNAT2與水稻SNAT1高度同源，與ASMT1、TDC2和 SNAT2互作系數(shù)均高于0.990(分別為0.994、0.991和0.990)，與酪氨酸/多巴脫羧酶以及芳香族-L-氨基酸脫羧酶也存在互作。

圖4 以水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為參考構(gòu)建的MaSNAT2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型Fig.4 Protein-protein interaction network of MaSNAT2 based on Oryza sativa L. protein database

2.3 蛋白序列比對及進化樹

蛋白序列比對結(jié)果(圖5)顯示：植物SNAT蛋白C端高度保守。MaSNAT2與小果野蕉SNAT相似度最高(99.19%)，其次為野蕉(相似度為98.39%)。進化樹分析結(jié)果(圖6)也表明，MaSNAT2與小果野蕉(XP_009402202.1)親緣關(guān)系最近，其次是野蕉(THU68065.1)。

框內(nèi)為Acetyltransf_7結(jié)構(gòu)域圖5 MaSNAT2與其他物種蛋白序列比對結(jié)果The box represents the Acetyltransf_7 domainFig.5 Protein sequence alignment between MaSNAT2 and other species

圖6 不同植物SNAT蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of homologous SNAT proteins of different plant species

2.4 啟動子順式作用元件分析結(jié)果

啟動子順式作用元件分析結(jié)果顯示，除核心元件外，MaSNAT2啟動子上存在6個ABA、2個GA和 3個MeJA響應(yīng)元件，此外還含有1個厭氧誘導(dǎo)元件、1個胚乳表達、1個分生組織表達和13個光響應(yīng)元件(表2)。

表2 MaSNAT2基因啟動子順式作用元件

2.5 激素處理下MaSNAT2基因的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖7)，在ABA處理下，MaSNAT2相對表達量隨處理時間呈‘降-升’的趨勢，在處理4、8、12、24和48 h時的表達量分別為對照的0.37、0.11、0.43、0.56和0.55倍；在GA3處理下，MaSNAT2相對表達量呈‘降-升-降-升’的趨勢，在8 和48 h表達量顯著上調(diào)，分別為對照的15.1和16.2倍；在MeJA處理下，MaSNAT2基因表達呈‘升-降-升-降’的趨勢，在4 h時的表達量顯著高于對照，為對照的5.2倍，其他時間點的表達量低于對照，但與對照差異不顯著。

*表示與對照相比差異顯著圖7 激素處理下MaSNAT2的相對表達量* represents significant difference compared with CKFig.7 Relative expression level of MaSNAT2 gene under hormone treatments

2.6 外源褪黑素對MaSNAT2表達的影響

通過比較4組處理香蕉表型差異發(fā)現(xiàn)：M組與CK組相比無明顯變化，T組香蕉葉緣軟化、卷曲下垂，MT組也表現(xiàn)出葉片卷曲癥狀，但明顯輕于T組(圖8，A)，說明褪黑素處理可以提高香蕉的抗寒性。通過分析4組香蕉葉片中MaSNAT2基因表達情況，發(fā)現(xiàn)褪黑素及低溫復(fù)合處理時MaSNAT2表達量最高，為對照的2.66倍；其次是單獨低溫處理，為對照的2.03倍；單獨褪黑素處理時MaSNAT2表達量也高于對照，但差異不顯著(圖8，B)。

與CK組相比，M組、T組及MT組褪黑素含量顯著增加(P<0.05)，分別為對照的1.10倍、1.16倍和1.32倍(圖8，C)。通過分析4組樣品中MaSNAT2的表達和褪黑素含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MaSNAT2的表達水平與褪黑素含量呈極顯著正相關(guān)(相關(guān)性系數(shù)為0.816，P<0.01)。

CK. 28 ℃對照；T. 低溫；M. 褪黑素；MT. 褪黑素+低溫；*表示與對照相比差異顯著圖8 不同處理對香蕉表型(A)、MaSNAT2表達(B)及內(nèi)源褪黑素含量(C)的影響CK. 28 ℃ control group; M. Melatonin treatment group; T. Low temperature treatment group; MT. Melatonin and low temperature co-treatment group. *represents significant difference compared with CKFig.8 Different treatments on banana phenotypes (A), relative expression of MaSNAT2 gene (B) and endogenous melatonin content (C)

3 討 論

SNAT屬于GNAT超家族(也稱GCN5相關(guān)家族)，該家族成員對不同乙酰受體具有顯著的特異性[28]，在調(diào)節(jié)褪黑素合成與積累過程中發(fā)揮重要的作用[17, 29]。本研究發(fā)現(xiàn)MaSNAT2的C端高度保守，且存在乙酰轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域及輔酶A結(jié)合位點[30]，說明C端高度保守對于SNAT功能的發(fā)揮意義重大[9]。

Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)與水稻OsSNAT1基因同源性較高的煙草(Nicotianatabacum)的NtSNAT1和NtSNAT2基因、絨毛煙草(Nicotianatomentosiformis)NtoSNAT1與開花煙草(Nicotianasylvestris)NsSNAT1等基因均具有7個內(nèi)含子和8個外顯子。本研究發(fā)現(xiàn)MaSNAT2基因也具有7個內(nèi)含子和8個外顯子?；鹁嫠蒔tSNAT定位于葉綠體[16]；葡萄VvSNAT2具有葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽，定位于葉綠體[15]；紅藻PySNAT蛋白不具有葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽，定位于細胞質(zhì)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，香蕉MaSNAT2具有葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果也顯示其定位于葉綠體。因此推斷SNAT蛋白亞細胞定位與葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽存在情況有關(guān)。

褪黑素合成與各種激素代謝間存在密切聯(lián)系[32-33]。本研究通過分析MaSNAT2啟動子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其啟動子上存在有ABA、GA3和MeJA響應(yīng)相關(guān)元件，暗示MaSNAT2的表達可能受多種激素調(diào)控。研究表明干旱脅迫下褪黑素處理可以上調(diào)蘋果2個ABA分解基因MdCYP707A1和MdCYP707A2的表達，減少ABA含量[32]。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)褪黑素降低高溫脅迫下黑麥草ABA含量。本研究發(fā)現(xiàn)，香蕉MaSNAT2的表達受ABA顯著抑制，暗示褪黑素和ABA之間存在一定拮抗關(guān)系。褪黑素可以提高黃瓜GA合成基因GA20ox和GA3ox的表達提高GA含量[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，MaSNAT2基因表達受到GA3誘導(dǎo)，說明GA3可能對褪黑素的合成具有一定促進作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MeJA處理可以誘導(dǎo)MaSNAT2基因的表達，再次暗示褪黑素代謝與多種激素代謝存在‘cross-talk’。

大量研究表明，外源褪黑素處理可以提高植物的抗寒或耐寒能力[36-39]。煙草NtSNAT1基因在低溫處理24 h表達量上調(diào)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫和外源褪黑素處理均能顯著提高香蕉葉片內(nèi)源褪黑素含量，且二者復(fù)合處理對內(nèi)源褪黑素積累的促進效果最佳；而MaSNAT2的相對表達水平也表現(xiàn)為：CK< M< T