續(xù)隨子ElSAD2基因的克隆與功能分析

王鑫雨，葛麗萍*，盛曉倩，牛聽(tīng)風(fēng)，包 鵬，李潤(rùn)植

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西太谷 030801；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801)

續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)為大戟科大戟屬，1～2年生草本植物，全株無(wú)毛，高可達(dá)1 m。根柱狀，莖直立，頂部二歧分枝，灰綠色；葉交互對(duì)生，線狀披針形，全緣，無(wú)葉柄；花序單生近鐘狀，雄花多數(shù)，雌花1枚。蒴果三棱狀球形，種子柱狀至卵球狀?；ㄆ?～7月，果期6～9月，在中國(guó)多個(gè)省區(qū)有分布或栽培[1]。20世紀(jì)80年代，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)M．Calvin教授通過(guò)對(duì)油脂植物續(xù)隨子進(jìn)行能源利用潛力的評(píng)價(jià)研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)隨子的種子油中含有30%～40%類似于石油的碳?xì)浠衔?，這些油脂化合物可作為石油代用品，是一種很有開(kāi)發(fā)前途的新型能源油料植物。危文亮等在2007年研究表明，續(xù)隨子種子含油率為43.3%，脂肪酸成分以C16、C18為主，其中油酸(C18∶1Δ9)含量高達(dá)83%，亞麻酸為2.5%，不飽和度適中[2]。研究認(rèn)為，如果充分利用可耕土地，種植能源植物，并對(duì)其他農(nóng)副產(chǎn)物的生物質(zhì)進(jìn)行加工，全球的植物能源開(kāi)發(fā)潛力可達(dá)到435 EJ/年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)初級(jí)能源的需求量[3]。

植物油脂是植物體內(nèi)的儲(chǔ)能物質(zhì)，在人類生產(chǎn)生活方面起著重要作用，尤其還可以用于生物燃料的產(chǎn)生[4]。植物油脂是由1個(gè)甘油分子和3個(gè)不同類型的脂肪酸分子相結(jié)合而成的高級(jí)脂類化合物。質(zhì)體中的Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶 (stearoyl-acyl carrier protein Δ9desaturase，SAD)催化單不飽和油酸的合成，是控制植物細(xì)胞飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例的關(guān)鍵酶。以硬脂酰-ACP(C18∶0-ACP)為底物，在第9～10碳原子之間脫氫形成一個(gè)雙鍵，催化生成油酰-ACP(C18∶1Δ9-ACP)，在硫酯酶的作用下解離，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行三酰甘油的組裝或再延長(zhǎng)去飽和等過(guò)程，生成多不飽和脂肪酸[5-7]。多項(xiàng)研究表明SAD基因決定植物細(xì)胞中的不飽和脂肪酸含量。煙草中過(guò)表達(dá)黃羽扇豆(Lupinusluteus)的SAD基因，導(dǎo)致葉片油酸的含量增加[8]。在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中，降低SAD的表達(dá)量，引起硬脂酸含量增加[9]。在甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)種子中過(guò)表達(dá)烏桕(Sapiumsebiferum)SAD基因，也引起油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)含量的變化[10]。在擬南芥[7](Arabidopsisthaliana)、蓖麻[11](Ricinuscommunis)和大豆[12](Glycinemax)等植物中也分離得到了SAD基因，并驗(yàn)證了異源表達(dá)SAD基因可以提高宿主組織油脂含量。然而，有關(guān)續(xù)隨子SAD基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組前期已研究了續(xù)隨子種子油脂合成通路中ElDGAT1[13]、ElDGAT2[14]、ElFAD2[15]和ElPDAT1[16]基因。本研究基于續(xù)隨子種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)一條高表達(dá)的功能注釋為SAD的轉(zhuǎn)錄本，以續(xù)隨子為材料，應(yīng)用生物信息工具分析續(xù)隨子SAD2蛋白的理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育特征，PCR技術(shù)獲得該續(xù)隨子ElSAD2基因的cDNA序列，并分析該基因在不同器官中的表達(dá)譜，構(gòu)建植物表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體，通過(guò)異源表達(dá)ElSAD2基因分析煙葉及酵母細(xì)胞中的油脂含量變化，鑒定續(xù)隨子ElSAD2基因的功能。研究可為解析續(xù)隨子油脂合成的分子機(jī)理提供科學(xué)參考，可進(jìn)一步應(yīng)用于油料植物油脂產(chǎn)量和品質(zhì)改良。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用續(xù)隨子種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站苗圃。取材為續(xù)隨子根、莖、葉、花以及3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(花后15、30 和45 d)的種子。所有材料采集后立即置于-80 ℃超低溫冰箱保存。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種植于基質(zhì)土中，設(shè)置光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)條件為：溫度26 ℃，相對(duì)濕度60%，光照/黑暗16 h/8 h[17]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)突變菌株BY4389缺陷型酵母(MATaolelΔ∷LEU2ura3-52his4)、DH5α大腸桿菌、pMD18-T克隆載體、GV3101根癌農(nóng)桿菌均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.2 方 法

1.2.1 續(xù)隨子RNA提取、cDNA第一鏈的合成以續(xù)隨子根、莖、葉、花的混樣及3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(花后15、30和45 d)的種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選用模式植物擬南芥SAD(AtSADs)基因家族編碼的蛋白序列作為檢索序列，對(duì)續(xù)隨子種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，并參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)功能注釋，分析得到續(xù)隨子Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶轉(zhuǎn)錄本，命名為ElSAD2。使用Trizol法提取續(xù)隨子根、莖、葉、花以及3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(花后15、30 和45 d)種子的總RNA。利用5×All-In-One RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 續(xù)隨子各器官ElSAD2基因表達(dá)特性檢測(cè)及基因克隆以續(xù)隨子各器官cDNA為模板，使用NCBI中的 Primer-BLAST 對(duì)ElSAD2 基因編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以續(xù)隨子ElActin作為內(nèi)參基因，使用2×RealStar Green Fast Mix(GenStar公司)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：cDNA 模板0.5 μL， 2×RealStar Green Fast Mixture 5 μL，正向引物0.25 μL，反向引物0.25 μL，ddH2O 4 μL。引物退火溫度均為60 ℃，反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒ǎ?5 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線拍照。

表1 引物信息

以表達(dá)量最高的cDNA為模板，使用目的基因特異引物及2×GPV8 HF Polymerase Master高保真酶擴(kuò)增目的基因的ORF，目的片段經(jīng)凝膠回收和純化后連入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，選取陽(yáng)性菌株，并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 續(xù)隨子ElSAD2蛋白的理化性質(zhì)分析以擬南芥AtSADs家族蛋白為序列源，對(duì)續(xù)隨子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得續(xù)隨子ElSAD2基因候選氨基酸序列。將檢索到的氨基酸序列提交到CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證分析，分析鑒定ElSAD2蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。用在線軟件 ProtParam 預(yù)測(cè)續(xù)隨子ElSAD2蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性等理化性質(zhì)。通過(guò)在線工具TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)預(yù)測(cè)續(xù)隨子ElSAD2的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；通過(guò)Plant-mPLoc(www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)在線軟件對(duì)續(xù)隨子ElSAD2蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 續(xù)隨子ElSAD2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用SOPMA網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat. pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)ElSAD2的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL對(duì)ElSAD2進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析并建模。

1.2.5 續(xù)隨子ElSAD2蛋白的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析從NCBI中調(diào)取其他植物的SAD蛋白序列，用軟件DNAMAN對(duì)續(xù)隨子、擬南芥、蓖麻、煙草、茶樹(shù)和芝麻的SAD蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。運(yùn)用MEGA7.0軟件對(duì)續(xù)隨子和其他物種SAD蛋白的氨基酸序列采用鄰接法(NJ)構(gòu)建無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉檢驗(yàn)值設(shè)置為1 000個(gè)循環(huán)[18]。

1.2.6 續(xù)隨子ElSAD2基因表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)已經(jīng)克隆獲得的續(xù)隨子ElSAD2基因序列信息，使用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)帶有KpnI和XbaI酶切位點(diǎn)的引物。以上述重組質(zhì)粒pMD18-T- ElSAD2為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有酶切位點(diǎn)(KpnI和XbaI)的ElSAD2目的片段，回收純化，同時(shí)對(duì)酵母表達(dá)載體pYES2.0進(jìn)行KpnⅠ和XbaⅠ 雙酶切，用T4-DNA連接酶將ElSAD2基因連接到pYES2.0載體上，形成重組酵母表達(dá)載體pYES2.0-ElSAD2，將其轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中，繼續(xù)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pYES2.0-ElSAD2，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將陽(yáng)性菌液加入等體積的50%甘油，保存于-80 ℃冰箱備用。

用以上的重組質(zhì)粒pMD18-T-ElSAD2為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有酶切位點(diǎn)(KpnⅠ和XbaⅠ)的ElSAD2目的片段，回收純化，同時(shí)對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA1303用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用T4-DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)載體 (pCAMBIA1303-ElSAD2)。再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)PCR和雙酶切試驗(yàn)鑒定陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性菌液加入等體積的50%甘油，混勻后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.7 續(xù)隨子ElSAD2基因的煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)和突變體酵母功能互補(bǔ)檢測(cè)將構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體pCAMBIA1303-ElSAD2及空載體pCAMBIA1303通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，配制煙草侵染液，使用注射器侵染本氏煙草的葉片[19-20]。取侵染3 d后的葉片，提取RNA，并檢測(cè)目的基因是否有效表達(dá)。取侵染6 d后的葉片冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述構(gòu)建成功的酵母表達(dá)載體pYES2.0-ElSAD2和空載體pYES2.0轉(zhuǎn)化到BY4389缺陷型酵母中，挑取轉(zhuǎn)化后的2種BY4389缺陷型酵母[轉(zhuǎn)基因的BY4389缺陷型酵母和轉(zhuǎn)空載的BY4389缺陷型酵母(EV)]單菌落和未轉(zhuǎn)化的BY4389缺陷型酵母[以下稱為野生型(WT)]單菌落分別接種于尿嘧啶缺陷的合成完全培養(yǎng)基SC-URA上，待長(zhǎng)出菌落，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因酵母置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體。

1.2.8 脂肪酸甲酯和總油脂的提取與測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)上述酵母和煙草葉片提取脂肪酸甲酯。稱取50 mg樣品研磨至粉末(設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù))，加入50 μL的Tir17:0 作為內(nèi)標(biāo) (濃度為10 mg/mL)。加入1.5 mL的2.5%的濃硫酸-甲醇混合液，80 ℃水浴2 h進(jìn)行甲酯化，冷卻后，加入2 mL 0.9%KCl和1 mL正己烷，離心，取上清液至新的玻璃試管中，氮吹儀吹干，沉淀用50 μL的乙酸乙酯混勻溶解，轉(zhuǎn)移到GC小瓶中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用氯仿-甲醇法分別提取酵母和煙草葉片的總油脂。分別稱取上述冷凍干燥的酵母和煙草葉片50 mg粉末置于離心管中(設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù))，加入7.5 mL的氯仿∶甲醇(1∶2)，混勻后于37 ℃抽提24 h，收集上層有機(jī)相。將收集的上層有機(jī)相混勻，加5 mL氯仿和9 mL 1%氯化鈉溶液，使氯仿∶甲醇∶水體積比為2∶2∶1.8，充分混勻后8 000 r/min離心10 min，收集下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至已稱重的玻璃管m0(g)中，待氮吹儀吹干后再次稱重，稱取總重量m1(g)?？傊舅岷?(提取后總重m1-提取前管重m0)/0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 續(xù)隨子ElSAD2基因的表達(dá)分析

提取續(xù)隨子根、莖、葉、花以及3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(花后15、30和45 d)種子的RNA，經(jīng)核酸濃度儀檢測(cè)，RNA的濃度和純度合適，并通過(guò)凝膠成像儀觀察RNA條帶(圖1)，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。為鑒定續(xù)隨子ElSAD2基因是否行使功能，通過(guò)qRT-PCR分析續(xù)隨子ElSAD2基因在不同器官及種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性。實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR(圖2)結(jié)果顯示：在花后30 d，ElSAD2基因的表達(dá)量最高，其次是花后45 d。

M. DL2000；1. 根；2. 莖；3. 葉；4. 花；5. 花后15 d種子；6. 花后30 d種子；7. 花后45 d種子圖1 續(xù)隨子各器官RNA瓊脂糖凝膠電泳M. DL2000; 1. Root; 2. Steam; 3. Leaf; 4. Flower;5. Seeds of 15 days after flowering; 6. Seeds of 30 days after flowering; 7. Seeds of 45 days after floweringFig.1 The agarose gel electrophoresis of RNA from Euphorbia lathyris organs

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同圖2 ElSAD2基因在不同器官及種子不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Different normal letters on the bar represent significant difference (P<0.05), the same as belowFig.2 Relative expression of ElSAD2 in different organs and seed developing stages

2.2 續(xù)隨子ElSAD2蛋白理化性質(zhì)及高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)NCBI-ORF Finder在線軟件對(duì)續(xù)隨子ElSAD2基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)及編碼氨基酸序列進(jìn)行識(shí)別、比對(duì)，結(jié)果顯示：ElSAD2基因cDNA全長(zhǎng)為1 665 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 194 bp，共編碼397個(gè)氨基酸殘基。ElSAD2相對(duì)分子量為45.21kD，理論等電點(diǎn)為6.29，為親水性蛋白。ElSAD2蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)定位于葉綠體，推測(cè)該蛋白可能在葉綠體中發(fā)揮作用。

ElSAD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3)結(jié)果顯示，ElSAD2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸連組成，所占比例分別為54.91%、5.54%、31.99%和7.56%。其中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較大，β-折疊所占比例最小。

藍(lán)色.α-螺旋；紅色.延伸連；綠色.β-折疊；紫色.無(wú)規(guī)則卷曲；橫坐標(biāo)表示氨基酸數(shù)圖3 ElSAD2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Blue. Alpha helix; Red. Extended strand; Green. Beta turn; Purple. Random coil；The horizontal axis represents the number of amino acidsFig.3 The second structure prediction of ElSAD2

利用SWISS-MODEL軟件以蓖麻硬脂酰酰基載體蛋白去飽和酶T199D突變株(PDB數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)：2j2f.1)為模板對(duì)續(xù)隨子ElSAD2蛋白進(jìn)行同源建模。如圖4所示，預(yù)測(cè)到ElSAD2蛋白活性形式為二聚體，在SAD保守區(qū)，4個(gè)α-螺旋束包圍的2個(gè)二價(jià)鐵離子，F(xiàn)e離子的配基即是四螺旋束的氨基酸側(cè)鏈，兩個(gè)單體的二價(jià)鐵離子位于SAD二聚體底物結(jié)合凹槽的內(nèi)部，共同組成了脫氫酶催化活性中心。

圖4 ElSAD2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The tertiary structure prediction of ElSAD2 protein

2.3 續(xù)隨子ElSAD2蛋白保守域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)對(duì)續(xù)隨子、擬南芥、蓖麻、煙草、茶樹(shù)和芝麻這6種植物的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果表明，續(xù)隨子ElSAD2的關(guān)鍵氨基酸殘基與蓖麻RcSAD1和擬南芥AtSSI2完全相同, 氨基酸序列相似度高。續(xù)隨子ElSAD2中有兩個(gè)典型SAD特征的保守的組氨酸富集區(qū)，即EENRHG和DEKRHE(圖5)，其中天冬氨酸(D)和組氨酸(H)為ElSAD2催化活性中心的二價(jià)鐵離子提供了必須結(jié)合位點(diǎn)，保證脫氫酶具有一定的催化活性。

AtSSI2. 擬南芥 (At2g43710); RcSAD1. 蓖麻(XP_002531889.1); NtSAD1. 煙草(XP_016449714.1); CsSAD. 茶樹(shù) (XP_028086173.1);SiSAD. 芝麻 (NP_001291335.1); 綠色框代表2個(gè)保守的富含組氨酸的基序EENRHG和DEKRHE，紅色框標(biāo)記決定功能性的氨基酸圖5 不同物種SAD氨基酸序列比對(duì)分析AtSSI2. Arabidopsis thaliana (At2g43710); RcSAD1. Ricinus communis (XP_002531889.1); NtSAD1. Nicotiana tabacum (XP_016449714.1); CsSAD. Camellia sinensis(XP_028086173.1); SiSAD. Sesamum indicum (NP_001291335.1);The green boxes represent two conserved histidine-rich motifs EENRHG and DEKRHE, the red box marks the amino acids that determine the functionalityFig.5 Sequence alignment of SAD proteins from different plant species

運(yùn)用MEGA 7.0軟件對(duì)續(xù)隨子ElSAD2蛋白和其他植物SAD蛋白進(jìn)行多序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖(圖6)，ElSAD2與蓖麻RcSAD1、茶樹(shù)CsSAD等親緣關(guān)系較近，聚為一支。

OeSAD.油橄欖(XP_022874955.1);GhSAD.陸地棉(XP_016699036.1);HlSAD.湖泊紅球藻(ABP57425.1); BnSAD.油菜(AAT65205.1);BrSAD.白菜(XP_009133630.1);SlSAD.番茄(XP_004234817.1);VvSAD.葡萄(XP_003635378.1);ZmSAD.玉米(NP_001151340.2);TaSAD.翼葉山牽牛(AAA82160.1);OsSAD.水稻(CAE03992.1);PsSAD.北美云杉(ABK24594.1);MtSAD.結(jié)核桿菌(NP_335274)圖6 ElSAD2與其他物種SAD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析OeSAD. Olea europaea (XP_022874955.1); GhSAD. Gossypium hirsutum (XP_016699036.1); HlSAD. Haematococcus lacustris (ABP57425.1); BnSAD. Brassica napus (AAT65205.1);BrSAD. Brassica rapa (XP_009133630.1); SlSAD. Solanum lycopersicum (XP_004234817.1); VvSAD. Vitis vinifera (XP_003635378.1); ZmSAD. Zea mays (NP_001151340.2);TaSAD. Thunbergia alata (AAA82160.1); OsSAD. Oryza sativa (CAE03992.1); PsSAD. Picea sitchensis (ABK24594.1);MtSAD. Mycobacterium tuberculosis (NP_335274)Fig.6 Phylogenetic tree of ElSAD2 and other SAD proteins

2.4 續(xù)隨子ElSAD2基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

為解析ElSAD2編碼的酶蛋白是否具有SAD酶活性以及在續(xù)隨子油脂生物合成中的功能，我們克隆了ElSAD2基因，并分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體。以開(kāi)花后30 d種子的cDNA為模板，通過(guò)高保真PCR擴(kuò)增出ElSAD2基因片段，經(jīng)過(guò)回收純化和測(cè)序驗(yàn)證，成功克隆出ElSAD2。

用KpnⅠ和XbaⅠ酶分別雙酶切ElSAD2基因和酵母表達(dá)載體pYES2.0，使用T4連接酶將二者進(jìn)行連接，通過(guò)雙酶切驗(yàn)證得到重組酵母表達(dá)載體pYES2.0-ElSAD2(圖7，A)。用類似的方法，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1303-ElSAD2(圖7，B)。

A. 重組酵母表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證：1. pYES2.0；2. 雙酶切pYES2.0-ElSAD2；M. 12 000 bp marker；B. 重組植物表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證：1. pCAMBIA1303；2. 雙酶切pCAMBIA1303-ElSAD2；M. 12 000 bp marker圖7 雙酶切驗(yàn)證A. Double restriction enzyme digestion verification of recombinant yeast expression vectors: 1. pYES2.0; 2. Double digested electrophoresis pYES2.0-ElSAD2; M. 12 000 bp marker;B. Double restriction enzyme digestion verification of recombinant plant expression vectors: 1. pCAMBIA1303; 2. Double digested electrophoresis pCAMBIA1303-ElSAD2; M. 12 000 bp markerFig.7 Double restriction enzyme digestion verification

2.5 過(guò)表達(dá)ElSAD2促進(jìn)煙葉總油脂含量升高及脂肪酸成分的變化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)ElSAD2基因，取根癌農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染3 d后的煙草葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)ElSAD2基因是否有表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pCAMBIA1303-ElSAD2基因煙草葉片能擴(kuò)增出約1 194 bp大小的目的條帶，而轉(zhuǎn)pCAMBIA1303空載的煙草葉片無(wú)目的條帶。這表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后的煙草葉片中目的基因ElSAD2能夠正常轉(zhuǎn)錄形成mRNA有效表達(dá)。

選擇野生型(WT)、轉(zhuǎn)pCAMBIA1303空載體(EV)以及轉(zhuǎn)pCAMBIA1303-ElSAD2的煙草葉片進(jìn)行總油脂含量和脂肪酸組分測(cè)定。總油脂含量結(jié)果顯示(圖8)，與野生型和轉(zhuǎn)空載相比，轉(zhuǎn)pCAMBIA1303-ElSAD2基因煙草葉片的總油脂含量提高了2.46%。脂肪酸組分分析顯示(圖9)，與野生型和轉(zhuǎn)空載相比，轉(zhuǎn)pCAMBIA1303-ElSAD2基因煙草葉片的不飽和油酸(C18∶1Δ9)和亞油酸(C18∶2)分別增加了2.1%和2.4%，而棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、亞麻酸(C18:3)和花生酸(C20∶0)的含量均下降，其中硬脂酸(C18∶0)下降了約2.7%?？傊珽lSAD2增加了煙草葉片中總油脂含量，并且飽和脂肪酸含量下降，不飽和油酸顯著增加。結(jié)果表明，ElSAD2在煙葉組織中發(fā)揮SAD蛋白功能，催化18∶0-ACP生成18∶1Δ9-ACP，且促進(jìn)總油脂的積累。

圖8 過(guò)表達(dá)ElSAD2基因的煙葉總油脂含量Fig.8 Total oil contents in tobacco leaves overexpressing ElSAD2

圖9 過(guò)表達(dá)ElSAD2基因的煙葉脂肪酸成分變化Fig.9 Changes of fatty acid profiles in tobacco leaves overexpressing ElSAD2

2.6 缺陷型酵母異源表達(dá)ElSAD2促進(jìn)酵母總油脂含量升高和脂肪酸成分變化

將重組酵母表達(dá)載體pYES2.0-ElSAD2和空載體pYES2.0轉(zhuǎn)入BY4389缺陷型酵母中，同時(shí)通過(guò)尿嘧啶缺失的固體培養(yǎng)基來(lái)篩選轉(zhuǎn)化株，得到平板上的陽(yáng)性克隆菌落，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒pYES2.0-ElSAD2的BY4389缺陷型酵母中得到長(zhǎng)度為1 194 bp的目的條帶，這與目的基因的ElSAD2的開(kāi)放閱讀框(ORF)大小相符，轉(zhuǎn)基因BY4389缺陷型酵母在不含油酸的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)擴(kuò)繁，未轉(zhuǎn)化的BY4389缺陷型酵母(WT)和轉(zhuǎn)空載的BY4389缺陷型酵母(EV)則無(wú)法正常生長(zhǎng)，表明目的基因已成功轉(zhuǎn)入BY4389缺陷型酵母中，并能夠合成不飽和脂肪酸滿足自身生長(zhǎng)需求。

將陽(yáng)性菌株涂布于以半乳糖為碳源的SC-URA誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2～4 d出現(xiàn)菌斑，擴(kuò)繁收集酵母，冷凍干燥研磨獲得酵母菌粉，選擇野生型(WT)、轉(zhuǎn)pYES2.0空載體(EV)以及轉(zhuǎn)pYES2.0-ElSAD2的BY4389缺陷型酵母進(jìn)行總油脂含量和脂肪酸組分測(cè)定?？傆椭繙y(cè)定結(jié)果顯示(圖10)：與野生型和轉(zhuǎn)空載相比，轉(zhuǎn)pYES2.0-ElSAD2的BY4389缺陷型酵母中總脂肪酸含量增加了約4.0%。脂肪酸組分測(cè)定結(jié)果顯示(圖11)：與野生型和轉(zhuǎn)空載相比，轉(zhuǎn)pYES2.0-ElSAD2的BY4389缺陷型酵母中棕櫚酸(16∶0)和硬脂酸(C18∶0)分別下降了約2.6%和4.8%，單不飽和脂肪酸油酸(C18∶1)增加了約6.6%，棕櫚油酸(C16∶1)含量有少量(約1.6%)增加。表明ElSAD2可以使BY4389缺陷型酵母不飽和脂肪酸含量升高，且主要以硬脂酰-ACP(18∶0-ACP)為底物，催化脫氫成為油酰-ACP(18∶1-ACP)。

圖10 過(guò)表達(dá)ElSAD2基因的BY4389缺陷型酵母總油脂含量Fig.10 Total oil contents in SAD-defective yeast BY4389 overexpressing ElSAD2

圖11 過(guò)表達(dá)ElSAD2基因的BY4389缺陷型酵母脂肪酸成分變化Fig.11 Changes of fatty acid profiles in SAD-defective yeast BY4389 overexpressing ElSAD2

3 討 論

新型能源植物續(xù)隨子種子含油率為43.3%，油酸含量高(83%)，且作為林下植物，具有“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的優(yōu)勢(shì)，加速相關(guān)應(yīng)用基礎(chǔ)研究對(duì)于該能源植物的開(kāi)發(fā)利用極為重要。Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶在不飽和脂肪酸合成中發(fā)揮重要作用。研究表明，蓖麻RcSAD1和擬南芥AtSSI2均對(duì)18∶0-ACP具有底物選擇性，催化生成18∶1Δ9-ACP，形成油酸。因此，探究續(xù)隨子Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶的催化活性，為解析油酸合成機(jī)制，并為后續(xù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程培育高油酸續(xù)隨子具有重要指導(dǎo)意義。

在獲得續(xù)隨子種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)情況下，通過(guò)BLAST比對(duì)分析，鑒定得到續(xù)隨子ElSAD2基因序列。ElSAD2基因cDNA全長(zhǎng)為1 665 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 194 bp，共編碼397個(gè)氨基酸殘基。ElSAD2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與蓖麻RcSAD1相似。Lindqvist等通過(guò)X射線晶體衍射方法分析的蓖麻RcSAD的晶體結(jié)構(gòu)，是第一個(gè)鑒定了三級(jí)結(jié)構(gòu)的SAD蛋白，該SAD為同型二聚體，4個(gè)α-螺旋與Fe2+共同形成SAD活性中心[21]。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，續(xù)隨子ElSAD2中有兩個(gè)典型SAD特征的保守組氨酸富集區(qū)，即EENRHG和DEKRHE。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，續(xù)隨子ElSAD2蛋白與同科植物蓖麻RcSAD蛋白相似度最高，具有較高的同源性，說(shuō)明SAD在進(jìn)化中是非常保守的，這進(jìn)一步說(shuō)明SAD是一種非常重要的脂肪酸去飽和酶。

表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，ElSAD2基因在不同器官中均有表達(dá)，尤其在開(kāi)花后30 d種子中表達(dá)量最高。這與麻瘋樹(shù)JSAD基因表達(dá)譜一致，麻瘋樹(shù)JSAD基因在麻瘋樹(shù)的幼嫩根、莖、葉、花、果實(shí)以及成熟葉片中都有表達(dá)，在幼嫩的果實(shí)(正發(fā)育的果皮和種子)中表達(dá)最旺盛[22]。陸地棉GhSAD2基因在花后25 d的種子中表達(dá)量達(dá)到最高值[23]。紫蘇PfSAD5在開(kāi)花后30 d種子中表達(dá)較高[24]。推測(cè)SAD酶在種子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮主要作用，參與油脂的合成。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化廣泛應(yīng)用于植物外源基因的快速表達(dá)和功能鑒定。釀酒酵母由于其生長(zhǎng)周期短，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)，常用于外源基因的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證基因功能[25]。BY4389缺陷型酵母中OLE1基因發(fā)生缺失突變，酵母中失去脫氫酶活性，無(wú)法正常合成不飽和脂肪酸[26]。本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體，通過(guò)異源表達(dá)ElSAD2基因分析煙葉及酵母細(xì)胞中的油脂含量變化，鑒定ElSAD2基因的功能。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙葉中ElSAD2基因參與了油脂合成，使得不飽和油酸顯著增加，轉(zhuǎn)基因的BY4389缺陷型酵母中的油酸含量升高。煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)和BY4389缺陷型酵母功能互補(bǔ)結(jié)果表明ElSAD2能高效催化硬脂酸生成油酸，促進(jìn)細(xì)胞總油脂合成積累。

本研究鑒定得到續(xù)隨子ElSAD2基因，確定該基因具有SAD酶的典型特征。對(duì)該基因的序列特征和表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并通過(guò)異源表達(dá)鑒定該基因的功能。本研究為深入解析能源植物續(xù)隨子種子油脂合成和富集油酸的分子調(diào)控機(jī)制提供了科學(xué)參考，ElSAD2基因可作為靶基因應(yīng)用于油料作物油脂產(chǎn)量及不飽和脂肪酸合成的基因工程。