• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甲醛溶液浸泡的人類組織樣本基因組DNA的提取方法與質量鑒定

    2022-05-24 01:28:56楊博宇孫魯寧欒澤東龐文艷吳秀山范雄偉江志鋼
    激光生物學報 2022年2期
    關鍵詞:福爾馬林凝膠電泳瓊脂糖

    楊博宇,蔡 毅,孫魯寧,欒澤東,龐文艷,吳秀山,范雄偉,江志鋼*

    (1. 湖南師范大學心臟發(fā)育研究中心,長沙 410081;2. 萊州市婦幼保健院,煙臺 261400)

    福爾馬林(4%甲醛)浸泡是一種常見的保存組織樣本的方式,其固定的人類組織樣本通常是分子遺傳學研究的一種極其寶貴的資源[1-2],通常是可供個體基因測序的唯一樣本。福爾馬林可固定保留組織和細胞的形態(tài)以供解剖病理學家評估,它還使固定的組織能夠在常溫條件下儲存。然而,使用福爾馬林浸泡的組織其DNA在進行分子檢測時通常存在問題。由于序列的隨機斷裂,從福爾馬林保存的組織中提取的基因組DNA被高度降解,導致可用于PCR擴增的可擴增模板的數(shù)量顯著減少[3-4]。由于DNA降解,這種類型的組織中只能擴增出短序列,通常少于100個堿基。過去經常使用非緩沖甲醛溶液保存樣本,在保存了20年以上的組織中經常發(fā)現(xiàn)更廣泛的核酸降解。沒有緩沖的甲醛溶液會被氧化成甲酸,而酸性環(huán)境是DNA降解的主要原因。DNA在輕度酸性溶液中相對穩(wěn)定,但在pH值為4左右時,嘌呤堿基中的β糖苷鍵被水解,最終導致DNA片段的斷裂[5]。除此之外,甲醛浸泡的組織樣本通常存在DNA與蛋白質交聯(lián)的復合物,可阻礙蛋白酶對組織的消化, 從而影響DNA的提取。同時,在PCR擴增時,復合物也會阻礙引物與模板的結合以及DNA雙鏈的延伸[6]。然而,為臨床診斷、基因測序、分子試驗研究準備足量的高質量DNA是非常重要的[7-8]。本文擬從DNA提取的質量濃度、純度以及體外擴增效果三方面來探究甲醛浸泡組織的基因組DNA提取方法的實用性。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗所需的組織樣本為2019年6月、2019年10月、2021年1月和2021年7月使用福爾馬林浸泡的1號、2號、3號和4號引產人類胎兒的部分皮膚和肌肉組織,并于常溫儲存至今。試驗開展時,其分別已在福爾馬林中固定約30、24、11、5個月。經湖南師范大學生物醫(yī)學研究倫理委員會審查,該研究的試驗設計和方案充分考慮了安全性和公平性原則,試驗材料獲取方式正規(guī)、合法。研究內容和研究結果不存在利益沖突。

    1.2 引物

    本研究使用的引物為擎科生物(Tsingke)公司合成的通用引物。其序列為目的片段長為175 bp的GATA4基因組引物(F:TGGAGACTTTGCAGTCGCTT;R: CTCAGATCCCGCTGCGTTTA)、目的片段長為327 bp的GAPDH基因組引物(F:GGCTCTTAAAAAGTGCAGGGTC;R:ATGGTACATGACAAGGTGCGG)、目的片段長為674 bp的LRRC10基因組引物(F:CCTGGCTTTTCTAGGGTCGG;R:CGCTGGACAAGATGGTGGAT)。

    1.3 試劑盒

    FastPure FFPE DNA Isolation Kit(Vazyme DC105)、Universal Genomic DNA Kit(康為世紀 CW2298S)用于基因組DNA提取。2×Taq plus Master Mix(Biosharp,BL547B)用于PCR反應。

    1.4 方法

    1.4.1 基于常規(guī)柱式DNA提取試劑盒的提取方法(提取方法一)

    使用清洗消毒后的鑷子將甲醛中的組織塊取出,用眼科剪將約40 mg的組織盡量剪碎,放于吸水紙上吸干,并收集組織碎片放入滅菌EP管中。使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)浸泡2 h以洗去組織表面殘留的甲醛。將樣品以12000 r/min的速度離心5 min,吸棄上清液,加入Universal Genomic DNA Kit中的Buffer GTL(180 μL)和Proteinase K(20 μL),56℃水浴3 h。接下來的處理完全按照Universal Genomic DNA Kit的說明書操作。

    1.4.2 經改良的專門用于甲醛溶液浸泡組織的提取方法(提取方法二)

    通過與1.4.1中相同的操作得到40 mg的組織碎片,放入滅菌EP管中。根據張紅玲等[9]的方法,使用核酸提取緩沖液(1.21 g/L Tris,5.84 g/L NaCl,0.37 g/L EDTA)和100%乙醇分別浸泡樣品,每次2 h,之后用核酸提取緩沖液沖洗2次。將樣品以12000 r/min的速度離心5 min,吸棄上清液,加入FastPure FFPE DNA Isolation Kit中的Buffer FTL(270 μL)和Proteinase K工作液(30 μL),振蕩約30 s。56℃水浴過夜(約12~16 h)。將樣品轉移至90℃水浴約1.5 h后,10000×g離心3 min,吸上清轉移至新EP管中并加入300 μL Buffer FL和300 μL無水乙醇,震蕩約30 s。將試劑盒內置DNA吸附柱置于收集管中,轉移混合液至吸附柱中,10000×g離心60 s。棄濾液,將吸附柱置于收集管中,加入500 μLBuffer FW1(已加入乙醇)至吸附柱上,10000×g離心60 s。棄濾液,將吸附柱置于收集管中,加入650 μL Buffer FW2(已加入乙醇)至吸附柱上,10000×g離心60 s。棄濾液,將吸附柱置于收集管中,10000×g離心空柱3 min。將吸附柱轉移至新的1.5 mL離心管中,放置于37℃恒溫箱中5 min以揮發(fā)乙醇,分兩次共加入40 μL ddH2O至吸附柱膜中央,分別在室溫靜置1 min后以12000 r/min的速度離心2 min,以得到樣本的基因組DNA溶液。

    1.4.3 基因組DNA的質量濃度和純度檢測

    加入99 μL ddH2O和1 μL DNA樣本,使用分光光度計(eppendorf BioPhotometer plus 6132)進行dsDNA檢測,并記錄5次的質量濃度,計算OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm的數(shù)值以求平均值。

    1.4.4 基因組DNA的PCR擴增

    以所提取的甲醛浸泡組織的基因組DNA為模板,使用Thermo Fisher Scientific公司的PCR儀(Applied Biosystems MiniAmp A37028)擴增人類基因序列。將PCR儀設置反應程序為Touch Down降落PCR程序,具體如下:95℃ 預變性3 min,95℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸1 min;之后每個循環(huán)依次降低退火溫度1℃,直到56℃,共10個循環(huán);95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,23個循環(huán);72℃ 延伸3 min后,置于4℃存放。

    1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳

    取適量DNA溶液,使用1.5%的瓊脂糖凝膠在150 V電壓下進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下檢測拍照。

    2 結果與分析

    2.1 樣本基因組DNA提取及質量濃度與純度測定

    使用上述方法,分別將使用福爾馬林固定30個月的1號樣本、固定24個月的2號樣本、固定11個月的3號樣本和固定5個月的4號樣本剪碎,并分別提取其基因組DNA。各取1 μL,使用分光光度計測量其雙鏈DNA的質量濃度,并計算OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm。表1和表2分別展示出使用提取方法一和提取方法二所得的基因組DNA溶液的檢測數(shù)值。結果顯示,同樣的樣本,使用改良的提取方法二提取的基因組DNA的質量濃度普遍高于提取方法一,大部分的純度高于提取方法一。

    表1 分光光度計測量提取方法一所得基因組的數(shù)值Tab. 1 Spectrophotometry was used to measure the value of the genome obtained by extraction method 1

    表2 分光光度計測量提取方法二所得基因組的數(shù)值Tab. 2 Spectrophotometry was used to measure the value of the genome obtained by extraction method 2

    2.2 樣本基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳

    為了直觀地了解上述8份基因組DNA的提取效果,我們每份樣本取1 μL(方法二提取的4號樣本由于質量濃度較高,取0.5 μL),混入適量的DNA Loading Buffer進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示,所有樣本均有因甲醛長期保存導致的降解的Smear DNA帶,這預示著基因組DNA提取成功,其中用改良的提取方法二得到的保存時間最短的4號樣品的DNA 的亮度最高(圖1)。

    圖1 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNAMethod 1:使用提取方法一得到的基因組;Method 2:使用提取方法二得到的基因組;M:DNA marker;1:使用固定30個月的1號樣本所提取的基因組DNA;2:使用固定24個月的2號樣本所提取的基因組DNA;3:使用固定11個月的3號樣本所提取的基因組DNA;4:使用固定5個月的4號樣本所提取的基因組DNA。Method 1: Genome obtained by extraction method 1; Method 2: Genome obtained by extraction method 2; M: DNA marker; 1: Genomic DNA extracted from No. 1 sample fixed for 30 months; 2: Genomic DNA extracted from No. 2 sample fixed for 24 months; 3: Genomic DNA extracted from No. 3 sample fixed for 11 months; 4: Genomic DNA extracted from No. 4 sample fixed for 5 months.

    2.3 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

    由于基因組DNA的后續(xù)使用大多依賴于PCR體外擴增,我們分別使用上述的8份基因組DNA各0.3 μL為模板,分別對來自人類GATA4、GAPDH、LRRC10三個基因,長度為175、327、674 bp的片段進行PCR擴增,并分別取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示:兩種方法所提取的所有DNA模板均能擴增出175 bp的GATA4基因片段;方法一所提取的4號DNA模板可以擴增出327 bp的GAPDH基因片段,而方法二所提取的4號DNA模板可以擴增出327 bp的GAPDH片段和674 bp的LRRC10基因片段,且產物質量濃度較高(圖2)。這一結果證明,采用改良的專門用于甲醛溶液浸泡組織的基因組DNA提取方法提取出的基因組DNA的質量要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

    圖2 以基因組 DNA 作為模板的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products using genomic DNA as template每種PCR產物取5 μL點樣。M:DNA Marker;Method 1:以提取方法一得到的基因組為模板的PCR產物;Method 2:以提取方法二得到的基因組為模板的PCR產物;1:1號樣本基因組 DNA 為模板的 PCR 產物;2:2號樣本基因組DNA為模板的PCR產物;3:3號樣本基因組 DNA 為模板的 PCR 產物;4:4號樣本基因組DNA為模板的PCR產物;G:目的條帶為175 bp的GATA4片段產物;H:目的條帶為327 bp的GAPDH片段產物;L:目的條帶為674 bp的LRRC10片段產物。白色箭頭所指為目的條帶。5 μL samples were taken for each PCR product. M: DNA Marker; Method 1: PCR product using the genome obtained by extraction method 1 as template; Method 2: PCR products using the genome obtained by extraction method 2 as template; 1: PCR product of sample No. 1 genomic DNA as template; 2: PCR product of sample No. 2 genomic DNA as template; 3: PCR product of sample No. 3 genomic DNA as template; 4: PCR product of sample No. 4 genomic DNA as template product; G: The product of GATA4 fragment with 175 bp target band; H: The product of GPADH fragment with 327 bp target band; L: The product of LRRC10 fragment with 674 bp target band. The white arrow points to the target strip.

    3 討論

    根據前人的研究,固定時間是影響福爾馬林固定組織中DNA保存的主要因素[10]。我們的研究表明,隨著福爾馬林浸泡時間的延長,一定質量的組織中能夠提取出的基因組DNA量出現(xiàn)明顯的下降,這預示著對于福爾馬林固定的樣本的基因組DNA的提取和使用要盡早進行。經過嘗試,使用核酸提取緩沖液和乙醇沖洗的方法清洗福爾馬林浸泡樣本中的甲醛,并使用蛋白酶K長時間消化,同時結合FFPE樣本基因組提取試劑盒,可有效地從最長固定30個月的組織樣本中提取出一定量的基因組DNA,且PCR體外擴增最高可擴增出長達674 bp的基因片段。與之相比,使用通用式的柱式基因組DNA提取試劑盒提取的1號、2號、4號的基因組DNA溶液的質量濃度均要低于改良方法,且2號樣品和3號樣品的OD260nm/OD280nm的數(shù)值明顯低于改良方法,更加偏離純凈的基因組DNA的標準值(1.80)。這預示著這種通用提取試劑盒的提取產物存在更嚴重的蛋白質污染[11-13],而這很可能是甲醛浸泡導致的蛋白質-DNA交聯(lián)造成的。除此之外,四種樣品使用通用式基因組DNA提取試劑盒所得DNA的OD260nm/OD230nm的數(shù)值均小于我們的改進方法,而此值明顯偏小時表明樣品可能被糖類、鹽類或有機溶劑污染[14]。以上結果證明,我們改進的基因組提取方法是有效且實用的,其PCR擴增效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。這可能是由于較長時間的乙醇浸泡致使樣品中的大量甲醛被洗去,蛋白酶K的過夜反應消化掉了與DNA交聯(lián)的蛋白質,以及裂解后的90℃高溫水浴使之進一步解交聯(lián),從而使得循環(huán)擴增反應更順利地進行。

    然而,我們的方法還有許多可以改進之處,如可使用梯度乙醇洗滌更長時間[15-16]。使用酒精梯度置換法除去甲醛的原理是利用乙醇與甲醛之間反應生成半縮醛或縮醛,通過設置梯度乙醇濃度替換液不斷置換出甲醛,從而更加有利于DNA的提取,而之后復水的過程主要是為了保護細胞結構的完整,此外,將90℃水浴處理提至蛋白酶K消化之前可以避免長時間消化對DNA的影響, 且節(jié)省蛋白酶K的用量[17]。這種福爾馬林浸泡樣本中提取的DNA還存在序列偽影[3,18],這給DNA測序后的序列比對設置了難題,導致我們無法判斷測序結果與模板的不一致是來源于生物體遺傳基因的改變還是甲醛的作用對樣本DNA造成的破壞。有文獻報導,與普通福爾馬林相比,使用10%中性緩沖福爾馬林可使組織穩(wěn)定更長的時間,這種溶液也被用于尸檢采樣[19-20]。

    猜你喜歡
    福爾馬林凝膠電泳瓊脂糖
    “PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗改進與優(yōu)化
    中學生物學(2024年4期)2024-01-01 00:00:00
    基于膠原-瓊脂糖的組織工程表皮替代物構建研究
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    冰凍冷藏解剖臺在解剖實驗室的應用
    瓊脂糖以及高分辨率瓊脂糖制備方法研究進展*
    廣州化工(2016年11期)2016-09-02 00:42:59
    擠壓添加耐高溫α—淀粉酶高粱輔料麥汁的蛋白質組分分析
    4種核酸染料在實驗教學中的應用研究
    改良外科手消毒液噴嘴在固定標本時的應用
    進出口食品中腸炎沙門氏菌的脈沖場凝膠電泳分子分型分析
    食品科學(2013年22期)2013-03-11 18:29:30
    国产精品女同一区二区软件| eeuss影院久久| 久热久热在线精品观看| 国产精品av视频在线免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本黄色视频三级网站网址| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产男人的电影天堂91| 日韩av不卡免费在线播放| 两个人的视频大全免费| 午夜福利网站1000一区二区三区| av在线蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲不卡免费看| 狠狠狠狠99中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 麻豆成人av视频| 婷婷色麻豆天堂久久 | 亚洲av不卡在线观看| av在线亚洲专区| 久久久亚洲精品成人影院| 国产亚洲91精品色在线| 日日啪夜夜撸| АⅤ资源中文在线天堂| 国产片特级美女逼逼视频| av黄色大香蕉| 色综合色国产| 国产三级在线视频| 长腿黑丝高跟| 七月丁香在线播放| 亚洲va在线va天堂va国产| 人妻系列 视频| 国产av一区在线观看免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产三级中文精品| 色吧在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产色爽女视频免费观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 永久免费av网站大全| 精品久久久久久久久亚洲| 国产成人精品婷婷| 性插视频无遮挡在线免费观看| 少妇熟女欧美另类| 真实男女啪啪啪动态图| 国产免费又黄又爽又色| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲内射少妇av| 毛片一级片免费看久久久久| 99热这里只有精品一区| 国产伦在线观看视频一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产一区二区在线观看日韩| 免费大片18禁| 乱系列少妇在线播放| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 赤兔流量卡办理| 插逼视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 国产精品国产三级国产专区5o | 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产精品专区欧美| 久久精品久久精品一区二区三区| 久99久视频精品免费| 亚洲美女搞黄在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲精品aⅴ在线观看| 成人国产麻豆网| 中国国产av一级| 日本一二三区视频观看| 久久人妻av系列| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久久久性生活片| 成人鲁丝片一二三区免费| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国内精品美女久久久久久| 国产不卡一卡二| 97超视频在线观看视频| 好男人视频免费观看在线| 国产亚洲精品久久久com| 免费黄色在线免费观看| 国产在线一区二区三区精 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲内射少妇av| 91久久精品国产一区二区成人| 成人av在线播放网站| 色尼玛亚洲综合影院| av在线亚洲专区| ponron亚洲| 国产精品av视频在线免费观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩人妻高清精品专区| 久久人人爽人人爽人人片va| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 人妻系列 视频| 秋霞伦理黄片| 欧美一区二区精品小视频在线| 日日撸夜夜添| 国产精品久久久久久av不卡| 99热这里只有精品一区| 伦理电影大哥的女人| 美女大奶头视频| 中文字幕熟女人妻在线| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品,欧美在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 丝袜喷水一区| 天堂中文最新版在线下载 | 日本一本二区三区精品| 亚洲在久久综合| 2022亚洲国产成人精品| 一边亲一边摸免费视频| 国产乱来视频区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美日韩综合久久久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 观看免费一级毛片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品,欧美精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 麻豆成人av视频| 日本五十路高清| 免费观看性生交大片5| a级毛色黄片| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 免费观看的影片在线观看| 成年免费大片在线观看| 九草在线视频观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 嫩草影院新地址| 久久精品夜色国产| 大香蕉久久网| 男人舔女人下体高潮全视频| 美女内射精品一级片tv| 午夜福利成人在线免费观看| 免费看光身美女| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品国产成人久久av| 人妻系列 视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 禁无遮挡网站| 欧美高清成人免费视频www| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产av不卡久久| 国产精品国产三级国产专区5o | av国产免费在线观看| 美女内射精品一级片tv| 男女那种视频在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇的逼好多水| 国产精品一二三区在线看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本与韩国留学比较| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 免费看光身美女| 91av网一区二区| 一个人免费在线观看电影| 久久99热6这里只有精品| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 青春草国产在线视频| 国产午夜精品论理片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av国产久精品久网站免费入址| 高清毛片免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 亚洲av男天堂| 亚洲四区av| 国产探花在线观看一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久午夜欧美精品| 国产视频首页在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 观看美女的网站| 国产亚洲一区二区精品| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产精品专区欧美| 国产真实乱freesex| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 五月玫瑰六月丁香| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 男女视频在线观看网站免费| 九九爱精品视频在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 我要搜黄色片| 欧美成人午夜免费资源| 波多野结衣高清无吗| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久久大精品| 成年免费大片在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 啦啦啦啦在线视频资源| 中文字幕av成人在线电影| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美3d第一页| 网址你懂的国产日韩在线| 免费看a级黄色片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲最大成人手机在线| 麻豆成人av视频| 成人国产麻豆网| 亚洲综合精品二区| 国产av一区在线观看免费| 老司机影院毛片| av免费观看日本| 亚洲av熟女| 秋霞在线观看毛片| 女人久久www免费人成看片 | 久久久久久久国产电影| 欧美最新免费一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品电影一区二区三区| 只有这里有精品99| av在线播放精品| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲欧洲国产日韩| 97热精品久久久久久| 国产免费又黄又爽又色| 日本免费一区二区三区高清不卡| 综合色丁香网| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久精品94久久精品| 桃色一区二区三区在线观看| www.av在线官网国产| 精品国产三级普通话版| 能在线免费看毛片的网站| 观看免费一级毛片| 神马国产精品三级电影在线观看| 色哟哟·www| 亚洲四区av| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品一及| 日韩亚洲欧美综合| 赤兔流量卡办理| 五月伊人婷婷丁香| 在线免费十八禁| 91狼人影院| eeuss影院久久| 日韩高清综合在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产一区二区在线观看日韩| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| av在线天堂中文字幕| 亚洲欧美精品综合久久99| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o | 我要搜黄色片| 久久草成人影院| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久99热这里只有精品18| 大香蕉97超碰在线| 亚洲性久久影院| 精品国产三级普通话版| 国产精品蜜桃在线观看| 91久久精品电影网| 69av精品久久久久久| 少妇的逼水好多| 欧美日韩精品成人综合77777| 男人的好看免费观看在线视频| 国产又色又爽无遮挡免| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久国产网址| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 高清日韩中文字幕在线| 一级黄片播放器| 国产午夜福利久久久久久| 综合色av麻豆| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 男的添女的下面高潮视频| 嫩草影院新地址| 国产精品永久免费网站| 成人毛片60女人毛片免费| 久久久久久大精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲自拍偷在线| 久久韩国三级中文字幕| kizo精华| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文资源天堂在线| 国产高清视频在线观看网站| 超碰97精品在线观看| 黄色一级大片看看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 最近手机中文字幕大全| 欧美高清成人免费视频www| 高清av免费在线| 男插女下体视频免费在线播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 看非洲黑人一级黄片| 嫩草影院入口| 免费一级毛片在线播放高清视频| 看非洲黑人一级黄片| 性色avwww在线观看| 精品久久久噜噜| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美成人a在线观看| 免费av观看视频| 日韩精品有码人妻一区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 黄色一级大片看看| 高清av免费在线| 免费看av在线观看网站| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲性久久影院| 精品久久久久久电影网 | 久久精品91蜜桃| 国国产精品蜜臀av免费| 韩国高清视频一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 极品教师在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 丰满人妻一区二区三区视频av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品久久久久久精品电影| 日韩欧美三级三区| 午夜亚洲福利在线播放| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美极品一区二区三区四区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲,欧美,日韩| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品久久久久久久久av| 99久国产av精品国产电影| 亚洲不卡免费看| 成年版毛片免费区| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品久久视频播放| 精品无人区乱码1区二区| 欧美97在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美激情在线99| 麻豆一二三区av精品| 久久久久久伊人网av| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲av电影不卡..在线观看| 永久免费av网站大全| 一个人观看的视频www高清免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 在线观看一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区 | 午夜免费激情av| 不卡视频在线观看欧美| 日韩欧美三级三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| av在线天堂中文字幕| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲精品,欧美精品| 韩国av在线不卡| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品久久国产蜜桃| 在线观看一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 日日撸夜夜添| 国产在视频线在精品| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲av熟女| 免费无遮挡裸体视频| 嫩草影院精品99| 国产色婷婷99| 亚洲精品国产成人久久av| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产不卡一卡二| av线在线观看网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产三级在线视频| 午夜激情福利司机影院| 国内精品美女久久久久久| 国产精品一区www在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 少妇的逼水好多| 亚洲av免费在线观看| 亚洲人成网站在线播| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品熟女久久久久浪| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 熟女电影av网| 青春草亚洲视频在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 九色成人免费人妻av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久久久精品久久久久真实原创| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品一二三区在线看| 久久久精品大字幕| 国产黄片美女视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 极品教师在线视频| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩一区二区视频免费看| av福利片在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 激情 狠狠 欧美| 国产精品一二三区在线看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 丰满少妇做爰视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 日本三级黄在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲人成网站在线播| 欧美精品一区二区大全| videossex国产| 天天一区二区日本电影三级| 免费观看性生交大片5| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线观看美女被高潮喷水网站| 18+在线观看网站| av在线播放精品| 国产探花极品一区二区| 97热精品久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜福利在线观看吧| 身体一侧抽搐| 婷婷色av中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 夜夜爽夜夜爽视频| 18禁在线播放成人免费| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品久久久久久av不卡| 网址你懂的国产日韩在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产黄片美女视频| av卡一久久| 国产极品精品免费视频能看的| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 天天一区二区日本电影三级| 欧美激情在线99| 91狼人影院| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产黄片美女视频| 一级二级三级毛片免费看| 直男gayav资源| 永久免费av网站大全| 国产精品一及| 国产人妻一区二区三区在| a级一级毛片免费在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 国产成人精品婷婷| a级毛色黄片| 高清午夜精品一区二区三区| 综合色av麻豆| 国产精品永久免费网站| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲国产最新在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩一本色道免费dvd| 成人午夜高清在线视频| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩欧美 国产精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美97在线视频| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品影院6| 国产精品伦人一区二区| 国内精品美女久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 国产熟女欧美一区二区| 日本一二三区视频观看| 九九在线视频观看精品| 简卡轻食公司| 国产乱人视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品,欧美在线| 久久久久网色| 欧美高清成人免费视频www| 村上凉子中文字幕在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久a久久爽久久v久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲国产精品合色在线| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久精品大字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜激情欧美在线| 在线观看av片永久免费下载| 毛片一级片免费看久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 少妇丰满av| 69人妻影院| 国产精品电影一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品自拍成人| 婷婷色av中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 成人欧美大片| 久久6这里有精品| .国产精品久久| 一级毛片我不卡| 全区人妻精品视频| 国产高清有码在线观看视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲自拍偷在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 青青草视频在线视频观看| 18+在线观看网站| 色哟哟·www| 天堂网av新在线| 草草在线视频免费看| 久久99热6这里只有精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99热这里只有是精品在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品电影一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲国产精品专区欧美| 国产伦在线观看视频一区| 老司机影院成人| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 久久久久网色| 久久亚洲精品不卡| 中文资源天堂在线| 老司机影院成人| 热99在线观看视频| 秋霞伦理黄片| 日韩高清综合在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产探花在线观看一区二区| 六月丁香七月| 22中文网久久字幕| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲,欧美,日韩| 国产黄色小视频在线观看| 特级一级黄色大片| 久久久精品欧美日韩精品| 免费观看的影片在线观看| 91狼人影院| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久久国产电影| 国产精品一区二区性色av| 男女视频在线观看网站免费| kizo精华| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产精品国产高清国产av| 国产成人91sexporn| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 啦啦啦韩国在线观看视频| www日本黄色视频网| 日韩 亚洲 欧美在线| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看|