核黃素對砷誘導(dǎo)小鼠心、肺、腦毒性損傷的保護(hù)效應(yīng)

付偉祥，宋小超，趙利影，盧怡光，王俊東，張建海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

全球砷污染已成為一個(gè)嚴(yán)重的問題，數(shù)以百萬計(jì)的人通過飲水和食物接觸到高劑量的砷［1］。流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，接觸砷與皮膚病理、心血管疾病、糖尿病、發(fā)育性神經(jīng)毒性和基因毒性有關(guān)［2］。砷暴露會(huì)干擾心肌細(xì)胞代謝，引起心臟線粒體損傷［3］，引起各種呼吸道疾病，增加肺癌的風(fēng)險(xiǎn)［4］。低水平的砷還會(huì)對大腦突觸的神經(jīng)傳遞產(chǎn)生有害影響，進(jìn)一步引起神經(jīng)行為障礙［5］。無機(jī)砷在幾乎所有細(xì)胞和組織中都表現(xiàn)出急性和慢性毒性，會(huì)引起多器官衰竭［6］。因此，探索緩解砷中毒的方法刻不容緩。

核黃素（riboflavin，VB2）是B族維生素中的水溶性成員［7］，補(bǔ)充VB2對各種疾病治療（如敗血癥、缺血等）有輔助作用。同時(shí)，它還有助于降低人類罹患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。VB2因其抗氧化、抗衰老、抗炎和抗癌特性被廣泛研究［8］。最近的研究證明，VB2在小鼠異位心臟移植模型中降低了缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）后心肌的氧化應(yīng)激［9］。我們最近的研究也證實(shí)了VB2對氟化物導(dǎo)致的大腦皮層形態(tài)損傷有明顯的緩解作用［10］。根據(jù)這些結(jié)論，我們推測VB2可能在砷中毒對心、肺和腦的損害中發(fā)揮作用。

因此，本研究建立了VB2干預(yù)砷暴露小鼠模型，對其心、肺和腦進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，探討VB2減輕砷導(dǎo)致器官組織損傷的可能性，進(jìn)一步為砷中毒的機(jī)制和防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

48只5周齡ICR雄性小鼠購于山西醫(yī)科大學(xué)，體重20 g左右。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組及染毒

48只5周齡雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為對照組（蒸餾水）、砷組（20 mg/L As2O3）、核黃素組（20 mg/L VB2）、砷+核黃素組（20 mg/L As2O3+20 mg/L VB2）。17周后，稱取小鼠及其臟器的質(zhì)量，計(jì)算臟體比。臟器系數(shù)＝臟器濕質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色組織切片

采取部分組織于4%多聚甲醛（pH=7.2）固定液中固定48 h后用流水充分漂洗，進(jìn)行修塊（厚度約0.3 cm，切片平整），經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明和浸蠟后，用石蠟包埋組織，于切片機(jī)上切成5 μm的薄片。將其撈至干凈的載玻片上，并于56℃烤片直至蠟融化。梯度酒精脫水后，蘇木精染液染色5 min，自來水藍(lán)化20 min，伊紅染色30 s，最后經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢觀察組織形態(tài)學(xué)變化并采集圖片。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。差異顯著性利用one-way ANOVA（analysis of variance）進(jìn)行分析，*代表P＜0.05差異顯著，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001，****代表P＜0.0001差異極顯著（與對照組相比）。

2 結(jié)果與分析

2.1 VB2干預(yù)砷中毒小鼠心、肺和腦的臟器系數(shù)變化

由圖1a可知，與對照組相比，砷暴露不能改變小鼠心、肺以及腦的質(zhì)量，但核黃素與砷共處理后小鼠肺的質(zhì)量增加，與對照組相比差異極顯著（P＜0.0001）。圖1b結(jié)果顯示：砷暴露不能導(dǎo)致心、肺和腦的臟器系數(shù)改變，但核黃素與砷共處理可使得心、肺的臟器系數(shù)與對照組相比顯著增加（P＜0.05，P＜0.001）；核黃素處理組小鼠腦的臟器系數(shù)增加，與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。

圖1 核黃素對砷中毒小鼠心、肺、腦臟器系數(shù)的影響Fig. 1 Effect of riboflavin on cardiopulmonary organ coefficient in arsenism mice（a）小鼠心、肺、腦質(zhì)量的變化；（b）小鼠心、肺、腦臟器系數(shù)的變化。星號(hào)表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(a) Changes of heart, lung and brain weight in mice; (b) Changes of cardiopulmonary and cerebral organ coefficients in mice. Statistical analysis of invasion capacity. The asterisks indicate a statistically significant difference. *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001, ****P＜0.0001.

2.2 VB2干預(yù)砷中毒小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的變化

從圖2a可以看出，對照組心肌纖維束排列整齊、緊湊，組織結(jié)構(gòu)清晰可見。砷處理組心肌纖維收縮、彎曲，心肌纖維束間隙增寬。同時(shí)，核黃素的添加有效改善了這種現(xiàn)象，減少了心肌纖維的彎曲、紊亂，但沒有完全恢復(fù)至對照組狀態(tài)。核黃素處理組與對照組比較無明顯變化。圖2b結(jié)果顯示：砷處理組心肌細(xì)胞排列紊亂，體積增大，細(xì)胞間隙中纖維分離，甚至出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象；添加核黃素后纖維斷裂消失，間隙增寬現(xiàn)象減輕。

圖2 核黃素對砷中毒小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響Fig. 2 Effects of riboflavin on cardiac histomorphology in arsenism mice（a）小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)圖片（20×）；（b）小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)圖片（40×）。(a) Morphological images of mouse heart tissue (20×); (b) Morphological images of mouse heart tissue (40×).

2.3 VB2干預(yù)砷中毒小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化

由圖3a可見：對照組肺的結(jié)構(gòu)正常，肺泡完整，大小肺泡清晰可見，由肺泡壁連接成網(wǎng)狀；砷處理組與對照組相比，肺泡壁增厚，多數(shù)肺泡腔縮小，有的肺泡破裂融合在一起，失去網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；核黃素則明顯改善了砷導(dǎo)致的這些病理變化，使肺泡恢復(fù)正常狀態(tài)；核黃素處理組與對照組比較無明顯變化。圖3b結(jié)果顯示：砷處理組支氣管壁增厚，肺泡壁增厚，連接在一起，肺的形態(tài)基本消失；添加核黃素后支氣管清晰可見，與對照組無差異，肺泡壁增厚現(xiàn)象消失不見。

圖3 核黃素對砷中毒小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響Fig. 3 Effects of riboflavin on lung histomorphology in arsenism mice（a）小鼠肺組織形態(tài)學(xué)圖片（20×）；（b）小鼠肺組織形態(tài)學(xué)圖片（40×）。(a) Morphological image of mouse lung tissue (20×); (b) Morphological image of mouse lung tissue (40×).

2.4 VB2干預(yù)砷中毒小鼠大腦皮層組織形態(tài)學(xué)的變化

如圖4a所示，對照組錐體細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞清晰可見，排列緊湊、密集，呈現(xiàn)一定的方向性，細(xì)胞核清晰，染色明顯。砷處理組與對照組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，較多的細(xì)胞核染色變淺，細(xì)胞輪廓模糊不清。添加核黃素后，細(xì)胞數(shù)量有所增加，細(xì)胞核染色清晰可見，但仍排列紊亂。核黃素處理組與對照組無異。由圖4b中可見，砷處理組大腦皮層錐體細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞形態(tài)模糊，很難分辨，細(xì)胞核發(fā)生腫大，染色明顯變淺，有的細(xì)胞溶解、消失。添加核黃素后，仍可見少量腫大的細(xì)胞，但與砷處理組相比有明顯改善。

圖4 核黃素對砷中毒小鼠大腦皮層組織形態(tài)學(xué)的影響Fig. 4 Effects of riboflavin on cortical histomorphology in arsenism mice（a）小鼠大腦組織形態(tài)學(xué)圖片（20×）；（b）小鼠大腦組織形態(tài)學(xué)圖片（40×）。(a) Histomorphological image of mouse brain tissue (20×); (b) Histomorphological image of mouse brain tissue (40×).

3 討論

砷可以廣泛地侵入機(jī)體各個(gè)器官或組織，損傷其結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重受損。砷中毒會(huì)使心臟鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，降低心臟抗氧化功能和激活氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心臟毒性的發(fā)生［11］。同時(shí)，砷暴露可觸發(fā)大鼠肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起膠原纖維的沉積［12］。Amuno等［5］的研究表明，高砷地區(qū)動(dòng)物大腦中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）的活性水平偏高，大腦的抗氧化能力降低。Sharma等［13］的研究也表明，砷處理使白化病小鼠大腦脂質(zhì)過氧化（lipid peroxidation，LPO）水平升高，谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平顯著降低。這些均表明，砷的毒性表現(xiàn)與氧化應(yīng)激有關(guān)，砷進(jìn)入機(jī)體后導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡，有毒的自由基在富含磷脂的膜狀結(jié)構(gòu)（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）中誘導(dǎo)連鎖反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化，如細(xì)胞凋亡、壞死、鐵死亡和自噬等多種生物學(xué)過程，直接損傷細(xì)胞膜并產(chǎn)生許多次級(jí)產(chǎn)物，導(dǎo)致組織廣泛的細(xì)胞損傷［14］。這可能是砷引發(fā)各器官組織損傷的原因之一。

一些抗氧化劑，如紫檀茋、姜黃素、葡萄籽原青花素等也被報(bào)道可通過抗氧化等功能減輕砷中毒導(dǎo)致的某一組織器官損傷。但是否對砷中毒導(dǎo)致的多器官損傷起緩解作用還未可知，且有的抗氧化劑提取繁瑣或價(jià)格昂貴，不能有效地應(yīng)用于臨床與實(shí)踐。VB2廣泛存在于各類食物中［15］，通過黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）和黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）的作用形式，在呼吸鏈的電子傳遞過程和各種酶促反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16］。VB2在多種疾病損傷中有良好的治療作用［17］，可緩解小鼠心肌缺氧/缺血損傷［18］，改善脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥等［19］。

本試驗(yàn)對心臟、肺和大腦的臟器系數(shù)和組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)VB2添加對砷中毒心臟和肺的損傷有顯著的緩解效果。VB2較好地改善了砷導(dǎo)致的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少的情況，這可能與VB2的抗氧化、抗衰老、抗炎、抗傷害等生物學(xué)功能有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。