紫蘇caleosin基因克隆及表達分析

王 超，史華平，董書言，邢 志，周雅莉，王計平*，李潤植

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院（作物科學(xué)研究所），太谷 030801； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）果樹研究所，太谷 030815）

紫蘇（Perilla frutescensL. Britt.）是唇形科紫蘇屬的一年生草本植物，又名香蘇、紅蘇等［1］，原產(chǎn)于中國中南部地區(qū)，在我國已有2000多年的栽培歷史，現(xiàn)廣泛分布于全國各地［2］。紫蘇在我國北方主要用作油料作物，少部分作為藥材來使用；在南方地區(qū)，紫蘇以藥用為主，食用為輔［3-4］。紫蘇種子含油率高達45%～55%，其中不飽和脂肪酸含量豐富，占總含油量的90%以上，是日常食用油中不飽和脂肪酸含量較多的一種新型油料作物。

植物種子中儲存著大量中性脂，主要成分為三酰甘油（triacylglycerol，TAG）。TAG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中裝配后向外凸起，磷脂單分子層結(jié)合在其外部形成大小不等的油體，油體融合成一定大小后，油體蛋白對其進行包裹便形成穩(wěn)定的成熟油體，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細胞液中［5］。TAG主要為種子萌發(fā)及幼苗的生長提供碳源和能量，而油體是負責(zé)儲存TAG的一個特殊細胞器［6］。油體蛋白主要分為三類：油質(zhì)蛋白（oleosin）、油體鈣蛋白（caleosin）和油體甾醇蛋白（steroleosin）［6］。caleosin和oleosin均能使油體更加穩(wěn)定。Chen等［7］分析推測，在使用相同含量的TAG時，等量caleosin能比oleosin覆蓋更多的油體面積，表明caleosin可以更有效地結(jié)合油體，是一種高效油體蛋白［8］。目前，在藻類植物［9］、蓖麻［10］、油菜［11］、小麥［12］、芍藥［13］、水稻［14］、擬南芥［15］等物種中，caleosin基因均已被克隆并進行功能分析。

caleosin作為環(huán)化酶催化不飽和脂肪酸，形成環(huán)氧脂肪酸，而環(huán)氧脂肪酸與植物中氧脂素代謝相關(guān)，能調(diào)控植物抗逆性并產(chǎn)生自身免疫［16］。在干旱脅迫時，caleosin N端可以感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)的Ca2+濃度變化，而C端發(fā)生磷酸化修飾，從而在干旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要的調(diào)控作用［14］。在水稻［14］、雨生紅球藻［9］、擬南芥［17］等研究中發(fā)現(xiàn)，caleosin基因參與了植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。本文從紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得PfClo1基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，并對其進行分子克隆及生物信息學(xué)分析，通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）研究PfClo1基因在紫蘇不同組織、不同品種及干旱脅迫處理幼苗中的表達特性，初步探討PfClo1基因的生物學(xué)功能，為進一步深入研究PfClo1基因在紫蘇油脂合成中的功能及對干旱脅迫的響應(yīng)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫蘇品種為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保存的‘晉紫蘇1號’和‘并紫蘇1號’。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理

選取均勻一致、籽粒飽滿的‘晉紫蘇1號’種子放入清洗干凈的小燒杯中，用自來水沖洗20 min，置于10 mL離心管中，用無菌水沖洗3次（每次3 min），然后用75%的酒精消毒處理40 s，無菌水沖洗3次。準(zhǔn)備好鋪有濾紙的培養(yǎng)皿，加入自來水（浸濕濾紙即可），將處理好的紫蘇種子整齊均勻地擺放到濾紙上常溫暗培養(yǎng)。待紫蘇長出2片子葉時光照培養(yǎng)（光照16 h、暗培養(yǎng)8 h、濕度80%），待長出4片真葉時選取長勢良好的幼苗進行20%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）干旱脅迫處理。分別在脅迫處理后0、3、6、9、12、24 h各取5株幼苗全株放入1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記后放入液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在大田中取不同油脂含量的紫蘇品種（‘并紫蘇1號’的含油率為35.6%，‘晉紫蘇1號’的含油率為46.8%）的根、莖、葉、花及不同發(fā)育時期的種子（開花后10、20、30、40 d），液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PfClo1和PfClo2基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

在運用高通量測序獲得的紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（使用根、莖、葉、花、開花后10、20、30、40 d的種子混樣測定）中篩選獲得PfClo1和PfClo2兩個基因片段。

通過NCBI-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行同源序列比對后，使用在線分析軟件對PfClo基因進行生物信息學(xué)分析。利用ProtParam在線分析軟件（https//web.expasy.org/protparam/）對基因進行基本理化性質(zhì)的分析；利用PSORT在線分析軟件（https://Psort.hgc.jp/form2.html）對基因進行亞細胞定位預(yù)測；利用SOPMA在線分析軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；利用SWISS-MODEL在線分析軟件（https://swissmodel.expasy.org/interactive）構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型；利用NCBI-CDD在線分析軟件（https://www.ncbi.nlmnih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因的保守域和功能結(jié)構(gòu)域；使用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，使用MEGA 7.0、Clustal W軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析。

1.2.3PfClo1和PfClo2基因在紫蘇不同組織中的表達特性分析

使用艾德萊生物公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取-80℃保存的紫蘇材料的RNA，使用ABM反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，稀釋至100 ng/μL后-20℃保存?zhèn)溆谩＠肞rimer 6.0設(shè)計熒光定量引物（表1），以Actin2作為內(nèi)參基因。使用2×RealStar Green Power Mixture試劑盒（購自Genstar公司），通過熒光定量分析儀進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：2×RealStar Green Power Mixture 10.0 μL、PfClo1/2F 0.5 μL、Pf-Clo1/2R 0.5 μL、cDNA模板 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。擴增程序：94℃ 10 min，95℃ 15 s，55℃ 1 min，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。通過表達譜分析，選取PfClo1基因進行后續(xù)研究。

1.2.4 引物設(shè)計

使用Primer 6.0軟件設(shè)計PCR引物（表1）。

1.2.5PfClo1基因的克隆

通過表達譜分析，選取PfClo1基因進行克隆，利用Primer 6.0設(shè)計全長引物（表1），以紫蘇葉片cDNA為模板，按照2íTS-INGKE Master Mix（北京擎科生物公司）試劑盒體系和程序進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用SanPrep柱式DNA回收試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）回收，測定回收產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，連接到Pmd19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板挑取單克隆，菌檢為陽性后送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

表1 引物信息Tab. 1 Primer information

1.2.6PfClo1基因在不同紫蘇品種中的差異表達及對干旱脅迫響應(yīng)分析

提取‘晉紫蘇1號’和‘并紫蘇1號’不同組織的RNA及‘晉紫蘇1號’干旱脅迫處理后的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后通過熒光定量分析儀進行qRT-PCR擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 PfClo蛋白的理化性質(zhì)分析

PfClo1蛋白的分子式為C1841H3075N609O780S121，相對分子質(zhì)量為50100.54，理論等電點為5.19（呈酸性），不穩(wěn)定系數(shù)為40.76，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪酸系數(shù)為26.60，親水性系數(shù)為0.678，屬于疏水性蛋白。PSORT軟件預(yù)測PfClo1蛋白定位于細胞質(zhì)，屬于胞內(nèi)蛋白。PfClo2蛋白的分子式為C1755H2930N582O732S120，相對分子質(zhì)量為47743.23，理論等電點為5.18（呈酸性），不穩(wěn)定系數(shù)為40.28，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪酸系數(shù)為29.73，親水性系數(shù)為0.775，屬于疏水性蛋白。PSORT軟件預(yù)測PfClo2蛋白定位于細胞質(zhì)，屬于胞內(nèi)蛋白。

2.2 PfClo蛋白的結(jié)構(gòu)分析

圖1 紫蘇PfClo蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig. 1 The secondary structure of PfClo protein in perilla藍色線條：α-螺旋；紅色線條：延伸鏈；綠色線條：β-折疊；紫色線條：無規(guī)則卷曲。Blue line: α-helix; Red line: Extended strand; Green line: β-sheet; Purple line: Random coil.

圖2 紫蘇PfClo蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig. 2 The tertiary structure prediction of PfClo protein in perilla（a）PfClo1蛋白；（b）PfClo2蛋白。(a) Pfclo1 protein; (b) Pfclo2 protein.

2.3 PfClo蛋白的多序列比對分析

利用在線軟件進行紫蘇PfClo基因編碼氨基酸的多序列比對及功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖3所示，PfClo蛋白與芝麻（Sesamum indicum，NM_001304394.1）、丹參（Salvia miltiorrhizaXM_042171389.1）、煙草（Nicotiana tabacum，XM_016615461.1）和擬南芥（Arabidopsis，AT4G26740.1）的caleosin家族成員具有相似結(jié)構(gòu)，具有鈣結(jié)合基序、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點等保守結(jié)構(gòu)域。

圖3 紫蘇與其他物種caleosin的氨基酸序列比對Fig. 3 Amino acid sequence alignment of caleosin from perilla and other species鈣結(jié)合基序和酪蛋白激酶II磷酸化位點的片段用紅線標(biāo)出，名稱在底部標(biāo)出。Pf：紫蘇；Si：芝麻；Sm：丹參；Nt：煙草；At：擬南芥。The fragments of calcium binding motif and casein kinase II phosphorylation site are marked with red horizontal line and the names are marked at the bottom. Pf: Perilla frutescens; Si: Sesamum indicum; Sm: Salvia miltiorrhiza; Nt: Nicotiana tabacum; At: Arabidopsis thaliana.

2.4 PfClo蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用Clustal W軟件將紫蘇PfClo蛋白與其他8種植物［芝麻（Sesamum indicum，NM_001304394.1）、丹參（Salvia miltiorrhiza，XM_042171389.1）、煙草（Nicotiana tabacumXM_016615461.1）、擬南芥（Arabidopsis，AT4G26740.1）、蓖麻（RicinuscommunisXM_002528321.3）、向日葵（Helianthus annuus，XM_022185293.2）、甘藍型油菜（Brassica napus，NM_001315834.1）、花生（Arachis hypogaea，XM_025820922.2）］的caleosin序列進行多序列比對，并用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。可以看出，PfClo1與丹參SmClo聚為一支，均屬于唇形科植物，親緣關(guān)系更為接近；PfClo2與蓖麻RcClo聚為一支，親緣關(guān)系更為接近。

圖4 紫蘇與其他物種caleosin的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of caleosin from perilla and other species

2.5 PfClo1和PfClo2基因在‘晉紫蘇1號’不同 組織中的表達特性分析

紫蘇PfClo基因在不同組織中的表達譜分析表明（圖5）：PfClo1基因在根、莖、葉中基本不表達，在花中表達量較高，該基因主要在種子中表達，且隨著種子的發(fā)育表達量不斷增加，在開花后30 d表達量達到最高，是開花后10 d表達量的22.08倍；PfClo2基因僅在葉和花中微量表達，在根、莖、種子中均不表達。因此，本研究選取PfClo1基因進行后續(xù)試驗。

圖5 ‘晉紫蘇1號’不同組織中PfClo1（a）和PfClo2（b）基因的表達特性Fig. 5 Expression characteristics of PfClo1 (a) and PfClo2 (b) genes in different tissues of ‘Jinzisu 1’不同小寫字母代表P＜0.05水平上的差異顯著。R：根；S：莖；L：葉；F：花；10 d：開花后10 d的種子；20 d：開花后20 d的種子；30 d：開花后30 d的種子；40 d：開花后40 d的種子。下同。Different lowercase letters represent significant differences at the level of P＜0.05 . R: Root; S: Stem; L: Leaf; F: Flower; 10 d: Seeds 10 days after flowering; 20 d: Seeds 20 days after flowering; 30 d: Seeds 30 days after flowering; 40 d: Seeds 40 days after flowering. The same below.

2.6 紫蘇PfClo1基因的克隆

從紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選并克隆獲得Pf-Clo1基因（圖6）。紫蘇PfClo1基因的cDNA全長序列為609 bp，編碼202個氨基酸殘基（圖7）。

圖6 PfClo1基因克隆電泳圖Fig. 6 PfClo1 gene cloning electrophoresisM：Marker DL2000。M: Marker DL2000.

圖7 紫蘇PfClo1的核苷酸序列和氨基酸序列Fig. 7 Nucleotide sequence and amino acid sequence of PfClo1起始密碼子用紅色框框出，終止密碼子以星號指示。The start codon is framed in red, the end codon is indicated by an asterisk.

2.7 PfClo1基因在不同紫蘇品種中的表達特性分析

紫蘇PfClo1基因在不同紫蘇品種中的表達特性分析表明（圖8），PfClo1基因在‘并紫蘇1號’種子中特異性表達，且開花后40 d表達量最高，但總體來說，相比高油品種‘晉紫蘇1號’，其相對表達水平較低，可見編碼caleosin的PfClo1基因在不同油脂含量的紫蘇材料中存在正相關(guān)關(guān)系。

圖8 PfClo1基因在‘晉紫蘇1號’和‘并紫蘇1號’中的表達特性Fig. 8 Expression characteristics of PfClo1 gene in ‘Jinzisu 1’ and ‘Bingzisu 1’ varieties

2.8 干旱脅迫條件下 PfClo1基因在‘晉紫蘇1號’中的表達特性分析

PfClo1基因在20% PEG脅迫后的表達情況分析如圖9所示：隨著脅迫處理時間的延長，Pf-Clo1基因的表達量急劇上升，脅迫6 h時表達量是3 h表達量的9.92倍；隨后表達量繼續(xù)升高，12 h時PfClo1基因的表達量達到最高，為0 h表達量的6.78倍，3 h表達量的23.56倍，脅迫處理24 h時表達量開始下降。

圖9 PfClo1基因干旱條件下在‘晉紫蘇1號’中的表達特性Fig. 9 Analysis of the expression characteristics of PfClo1 gene in ‘Jinzisu 1’ under drought conditions不同小寫字母代表P＜0.05水平上的差異顯著。Different lowercase letters represent significant differences at the level of P＜0.05.

3 討論

油體鈣蛋白基因caleosin在油體形成過程中起重要作用。Khalil等［18］、Marine等［19］研究發(fā)現(xiàn)，過表達caleosin基因有利于合成更多數(shù)量的油體。在酵母中過表達caleosin基因會使酵母油脂積累量、油體數(shù)量增加，且油體體積增大［10］，表明caleosin基因超表達可以誘導(dǎo)油脂的合成積累。丁勇等［11］、魏征等［14］的研究結(jié)果表明：油體蛋白N端存在能夠結(jié)合Ca2+的EF-hand區(qū)域，可能發(fā)揮調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能；中間部分存在疏水區(qū)域，能增加油體蛋白的疏水性，提高油體的穩(wěn)定性；C端帶有保守蛋白激酶磷酸化位點,能啟動油體合成途徑。紫蘇PfClo1屬于典型的caleosin家族，其C末端結(jié)構(gòu)域含有酪蛋白激酶II（casein kinase II，CKII）磷酸化位點，可推測其在油體成熟時參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這與上述研究結(jié)果一致。多序列比對及系統(tǒng)進化分析驗證了PfClo1與芝麻、丹參、擬南芥等植物的caleosin具有相似的結(jié)構(gòu)域及較近的親緣關(guān)系，推測該基因在紫蘇中編碼caleosin蛋白，調(diào)控油體合成，增加油體的穩(wěn)定性。

caleosin基因在不同植物中的表達特性不同，在水稻不同組織中均有表達［14］，在芍藥［13］和芝麻［20］種子中其表達量呈先升高后降低的趨勢。本研究通過分析紫蘇不同組織及種子發(fā)育不同時期caleosin基因的表達特性，發(fā)現(xiàn)其在花和種子中均有表達，在種子發(fā)育后期表達量達到高峰，與油體形成時期相符，推測該基因高量表達與油體形成有關(guān)；通過分析不同紫蘇品種的差異表達，發(fā)現(xiàn)低油品種‘并紫蘇1號’的PfClo1基因表達量極低，推測編碼油體鈣蛋白的PfClo1基因的表達與紫蘇油脂的形成存在一定的正相關(guān)關(guān)系。

為豐富滁河左岸堤頂路防浪墻景觀效果，左岸景觀中的防浪墻造型采用異形流線手法，蜿蜒在滁河岸邊，而景墻則采用山水畫卷圖案刻畫在異型混凝土上來顯現(xiàn)。該材料在生產(chǎn)過程中一次成型，后期無需其他工序。所有工作均在工廠完成，只需運輸至現(xiàn)場安裝即可，整個過程實現(xiàn)PC化，即計算機雕刻模型，先做好路徑，然后采用機器雕刻。

向蘭舟等［17］在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽、高溫脅迫及脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)條件下，AtCLO3基因表達均上調(diào)，其中高溫脅迫下表達顯著上調(diào)。魏征等［14］在水稻研究中發(fā)現(xiàn)，PEG6000模擬干旱脅迫時，OsCLO-3和OsCLO-6在各個組織中的表達水平均有所上調(diào)。本研究通過分析紫蘇在干旱脅迫下caleosin基因的表達特性，可以看出在干旱脅迫6 h時表達量已明顯升高，脅迫12 h時達到高峰，表明PfClo1基因具有干旱應(yīng)答功能，能夠快速響應(yīng)干旱脅迫。

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