光學(xué)參數(shù)對(duì)LED光療抑制口腔疾病常見細(xì)菌增殖的影響

胡嘉參，陰慧娟*，董曉曦，方 翔

（1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；2. 安徽恩迪亞智能科技有限公司， 銅陵 244199）

許多口腔炎癥，如牙周疾病、根管感染等，多是由口腔中的細(xì)菌感染所致。細(xì)菌及其產(chǎn)物是導(dǎo)致根管及牙周炎癥發(fā)生、發(fā)展和傳播的主要因素，其中革蘭氏陰性菌的脂多糖和革蘭氏陽(yáng)性菌的磷壁酸在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在這些口腔細(xì)菌中，革蘭氏陰性的牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）和革蘭氏陽(yáng)性的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）最為常見［1-5］。有效減少甚至清除口腔中的這些致病菌對(duì)于治療及預(yù)防口腔感染性疾病至關(guān)重要。傳統(tǒng)減少細(xì)菌載量的方法包括通過(guò)機(jī)械和化學(xué)方法去除根管內(nèi)大部分感染物的根管治療術(shù)，以及通過(guò)局部或全身應(yīng)用抗生素的抗感染治療等，這些方法的效果受到醫(yī)生操作手法和耐藥菌群等多種因素的影響［3-4，6-7］。另外，抗生素等化學(xué)藥物對(duì)細(xì)菌生物膜穿透有限，當(dāng)細(xì)菌以生物膜形式存在時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)這些療法的敏感性降低［8］。

近年來(lái)，一些替代療法逐漸發(fā)展起來(lái)，如激光殺菌術(shù)、光動(dòng)力殺菌以及光療殺菌等。激光殺菌術(shù)利用激光產(chǎn)生的熱能殺傷細(xì)菌。Bergmans等［9］利用1064 nm的釔鋁石榴石晶體（neodymium-doped yttrium aluminium garnet，Nd:YAG）脈沖激光對(duì)糞腸球菌進(jìn)行體外照射，殺菌率可達(dá)99.7%。光動(dòng)力療法利用光敏劑受光激發(fā)后產(chǎn)生的光化學(xué)作用殺傷細(xì)菌［1，10-13］。O’Neill等［10］用632 nm的紅光激發(fā)光敏劑甲苯胺藍(lán)產(chǎn)生光動(dòng)力效應(yīng)，對(duì)多種口腔細(xì)菌形成的生物膜產(chǎn)生殺傷作用，殺菌率達(dá)到97.4%。這些方法不會(huì)像抗生素那樣產(chǎn)生耐藥性，是很有潛力的臨床治療方法，但也存在一定的局限性，如由于較高的功率，激光殺菌可能會(huì)對(duì)正常的口腔組織細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷；而光動(dòng)力治療時(shí)，外源性光敏劑具有潛在的光毒性，且操作復(fù)雜。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌含有內(nèi)源性卟啉［14-15］，可作為內(nèi)源性光敏劑，在光照射下可產(chǎn)生相同的光動(dòng)力效應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到殺菌效果［13，16］。這種利用低功率光照進(jìn)行殺菌治療的方法被稱為光療殺菌。隨著發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）的發(fā)展，從上世紀(jì)90年代開始，陸續(xù)有LED光源等其他光源代替激光用于光療領(lǐng)域的研究。LED光源具有能耗低、光斑大、產(chǎn)熱少、壽命長(zhǎng)、波長(zhǎng)選擇范圍廣、成本低等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，除了半峰寬外，其在輸出功率、峰值波長(zhǎng)等參數(shù)上與激光已相近。除在照明、LED顯示等領(lǐng)域外，在光療領(lǐng)域中利用LED代替激光進(jìn)行光療殺菌效應(yīng)的研究近年來(lái)也有諸多報(bào)道［17-18］。但是在光學(xué)參數(shù)，如波長(zhǎng)、功率密度和能量密度等的殺菌效果上，還未獲得一致性結(jié)果，不同細(xì)菌對(duì)LED光療的敏感性也有明顯爭(zhēng)議［19］。

本研究針對(duì)口腔感染最常見的兩種細(xì)菌，通過(guò)光學(xué)參數(shù)的不同組合方案，探索LED光療抑制口腔細(xì)菌增殖的最佳治療方案，為口腔細(xì)菌感染性疾病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

波長(zhǎng)分別為405 nm和455 nm的高通量LED光源由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自主研制。LED芯片購(gòu)自山東晶泰星光電科技有限公司。高通量LED光源上共有60個(gè)LED照光單元，每4個(gè)為1組。7組的功率密度為10 mW/cm2，另7組的功率密度為40 mW/cm2，每組可設(shè)置不同的照光時(shí)間；另有1組不發(fā)光作為對(duì)照。Lambda35型紫外-可見光分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer公司）、FluoroMax-4型熒光分光光度計(jì)（日本HORIBA科學(xué)儀器事業(yè)部）、全光譜型激光掃描共聚焦倒置顯微鏡（LSM710，德國(guó)ZEISS公司）等儀器用于光譜檢測(cè)和熒光成像。無(wú)菌透明底黑色96孔板（3603，美國(guó)Corning公司）、2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋、2.5 L厭氧產(chǎn)氣包、氯化血紅素、維生素K1、脫纖維羊血、厭氧血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）、腦心浸出液肉湯（brian heart infusion，BHI）、瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）等用于細(xì)菌培養(yǎng)。LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability Kit活/死細(xì)菌染色試劑盒（L7012，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）用于細(xì)菌增殖檢測(cè)。糞腸球菌（ATCC-29212）和牙齦卟啉單胞菌（ATCC-33277）由天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基的配制

BHI液體培養(yǎng)基A：取BHI 38.5 g，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，用于糞腸球菌培養(yǎng)。

BHI液體培養(yǎng)基B：每200 mL的BHI液體培養(yǎng)基A中加入1 mL（0.001 g） 氯化血紅素和1 mL（0.002 g）維生素K1，用于牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)。

BHI固體培養(yǎng)基：取BHI 38.5 g和瓊脂粉20.0 g，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至40～60℃時(shí)倒入無(wú)菌平皿中，待冷卻至室溫，培養(yǎng)基凝固，用于糞腸球菌培養(yǎng)。

厭氧血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：取厭氧菌瓊脂45.4 g，加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，分裝每瓶 200 mL，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至45～50℃時(shí)在每200 mL培養(yǎng)基中加入10 mL脫纖維羊血、1 mL（0.001 g）氯化血紅素和1 mL（0.002 g）維生素K1，混勻，倒入無(wú)菌平皿中，待冷卻至室溫，培養(yǎng)基凝固，用于牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

糞腸球菌接種到BHI固體培養(yǎng)基中，置于37℃，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，挑選出單菌落轉(zhuǎn)移到BHI液體培養(yǎng)基A中，置于37℃，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)繁殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)節(jié)菌液濃度約108CFU/mL用于光照試驗(yàn)。牙齦卟啉單胞菌接種到厭氧血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37℃，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)5～7 d，待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出黑色菌落后，挑選出黑色單菌落轉(zhuǎn)移到BHI液體培養(yǎng)基B中，置于37℃，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)繁殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)節(jié)菌液濃度約108CFU/mL用于光照試驗(yàn)。

1.4 光照處理與分組

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)菌（菌懸液濃度約為108CFU/mL）接種于96孔板，每組4個(gè)復(fù)孔，每孔30 μL，LED光源從96孔板底部向上垂直照射細(xì)菌。照光方案如表1所示，功率密度為10 mW/cm2和40 mW/cm2，光照時(shí)間依次為16、24、32、40、48、56 min（或4、6、8、10、12、14 min），對(duì)應(yīng)的能量密度為 9.6、14.4、19.2、24.0、28.8、33.6 J/cm2。同時(shí)設(shè)置不照光對(duì)照組。

表1 光照方案Tab. 1 Irradiation scheme

1.5 光療殺菌效果的檢測(cè)

1.5.1 即時(shí)殺菌效果

將光照后的細(xì)菌進(jìn)行活死細(xì)菌熒光染色并涂片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察殺菌效果。具體操作步驟如下：細(xì)菌經(jīng)不同光照處理后靜置30 min，每孔加3 μL染料SYTO9與碘化丙啶（propidium iodide，PI）的混合染液，避光孵育15 min；然后，每孔取5 μL菌懸液涂片；在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，激發(fā)光分別為488 nm和543 nm；隨機(jī)選取4個(gè)視野，按如下公式計(jì)算細(xì)菌存活率。

細(xì)菌存活率（%）=活細(xì)菌數(shù)/細(xì)菌總數(shù)×100%。

1.5.2 抑制菌落生長(zhǎng)效果

光照結(jié)束靜置30 min后，將每孔菌液梯度稀釋104倍，每孔取稀釋后的菌液5 μL進(jìn)行固體培養(yǎng)基平板涂布。將涂布后的平板置于37℃，厭氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)每組4個(gè)復(fù)孔的菌落數(shù)，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=（1-光照組計(jì)數(shù)/對(duì)照組計(jì)數(shù)）×100%。

1.6 細(xì)菌內(nèi)源性卟啉測(cè)定

取糞腸球菌及牙齦卟啉單胞菌液各50 mL，濃度為2×108CFU/mL，以5000 r/min在4℃中離心20 min。向下層菌體中加入20 mL的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA，TE）緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）重懸，重復(fù)2次，往菌體沉淀中加入1.5 mL乙酸乙酯與冰乙酸的混合液（體積比為3∶1），進(jìn)行冰上超聲裂解菌體（超聲30 s，重復(fù)6次），離心20 min。棄去下層菌體碎片，留取上層液體，加入1 mL蒸餾水，渦旋振蕩，離心10 min，重復(fù)1次，棄下層水層，加入100 μL的3 mol/L鹽酸，溶解乙酸乙酯中的卟啉，再渦旋振蕩，離心10 min，收集上層液體進(jìn)行卟啉的光譜分析［20］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件、OriginPro9.1軟件等對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與作圖，各組數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌的光療抑菌效果

2.1.1 光學(xué)參數(shù)對(duì)糞腸球菌的即時(shí)殺菌效果的影響

圖1顯示，在設(shè)定的光學(xué)參數(shù)下，光療干預(yù)對(duì)糞腸球菌均有顯著的殺傷效果（P＜0.05），且隨著光照劑量逐漸增加，細(xì)菌存活率總體呈下降趨勢(shì)。當(dāng)光照劑量到達(dá)28.8 J/cm2時(shí)，殺菌效果均超過(guò)50%（除405 nm波長(zhǎng)40 mW/cm2外）。405 nm波長(zhǎng)10 mW/cm2光照56 min（光照劑量33.6 J/cm2）的即時(shí)殺菌效果最好，可達(dá)（84.29±4.85）%；455 nm波長(zhǎng)40 mW/cm2光照14 min（光照劑量33.6 J/cm2）的即時(shí)殺菌效果可達(dá)（83.88±2.14）%。

圖1 光療對(duì)糞腸球菌的即時(shí)殺菌效果Fig. 1 Immediate bactericidal effect of phototherapy on E. faecalis（a）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下活死細(xì)菌熒光圖像；（b）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下細(xì)菌存活率。*P＜0.05。(a) Bacterial fluorescent staining at different optical parameters; (b) Survival viability at different optical parameters. *P＜0.05.

2.1.2 光學(xué)參數(shù)對(duì)糞腸球菌的菌落生長(zhǎng)抑制效果的影響

圖2中結(jié)果顯示， 波長(zhǎng)為405 nm時(shí)，光照劑量高于14.4 J/cm2的LED光照干預(yù)的菌落抑制效果與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨著光照劑量增加，抑菌率呈升高趨勢(shì)。在光照劑量相同的條件下，10 mW/cm2效果優(yōu)于40 mW/cm2。10 mW/cm2照射56 min（33.6 J/cm2）抑制菌落生長(zhǎng)效果最好，抑菌率可達(dá)（97.64±2.31）%。

圖2 光療抑制糞腸球菌菌落生長(zhǎng)效果Fig. 2 Inhibitory effect of phototherapy on colony growth of E. faecalis（a）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下細(xì)菌平板計(jì)數(shù)；（b）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下抑菌率。*P＜0.05。(a) Bacterial plate counting at different optical parameters; (b) Bacteriostatic rate at different optical parameters. *P＜0.05.

波長(zhǎng)為455 nm時(shí)，光照劑量高于19.2 J/cm2的菌落抑制效果與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨著光照劑量增加，抑菌率呈升高趨勢(shì)。光照劑量相同的條件下，兩種功率密度效果無(wú)明顯差異。當(dāng)光照劑量達(dá)到28.8 J/cm2時(shí)，兩種功率的抑菌率均可達(dá)50%以上，40 mW/cm2照射14 min（33.6 J/cm2）抑制菌落生長(zhǎng)效果最好，抑菌率可達(dá)（85.03±4.84）%。

2.2 牙齦卟啉單胞菌的光療抑菌效果

2.2.1 光學(xué)參數(shù)對(duì)牙齦卟啉單胞菌的即時(shí)殺菌 效果的影響

所有光照組均有顯著的殺菌效果（P＜0.05），且隨著光照劑量逐漸增加，細(xì)菌存活率呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明光照劑量越大殺菌效果越好（圖3）。功率密度為10 mW/cm2、光照劑量達(dá)28.8 J/cm2時(shí)，殺菌效果均可達(dá)到50%以上。功率密度為40 mW/cm2、光照劑量達(dá)24.0 J/cm2時(shí)，殺菌效果可達(dá)到50%以上。405 nm波長(zhǎng)40 mW/cm2照射14 min（33.6 J/cm2）的即時(shí)殺菌效果最好，可達(dá)（95.55±2.39）%。

圖3 光療對(duì)牙齦卟啉單胞菌的即時(shí)殺菌效果Fig. 3 Immediate bactericidal effect of phototherapy on P. gingivalis（a）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下活死細(xì)菌熒光圖像；（b）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下細(xì)菌存活率。*P＜0.05。(a) Bacterial fluorescent staining at different optical parameters; (b) Survival viability at different optical parameters. *P＜0.05.

2.2.2 光學(xué)參數(shù)對(duì)牙齦卟啉單胞菌的菌落生長(zhǎng)抑制效果的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖4）：波長(zhǎng)為405 nm、功率密度為10 mW/cm2時(shí)，光照劑量高于14.4 J/cm2有顯著的菌落抑制效果（P＜0.05）；功率密度為40 mW/cm2時(shí)，光照劑量高于9.6 J/cm2即有顯著的菌落抑制效果（P＜0.05）；隨著光照劑量增加，抑菌效果呈升高趨勢(shì)；光照劑量相同條件下，40 mW/cm2的抑菌效果略優(yōu)于10 mW/cm2，40 mW/cm2光照14 min（33.6 J/cm2）時(shí)菌落抑制效果最好，抑菌率可達(dá)（96.05±1.80）%。

圖4 光療抑制牙齦卟啉單胞菌菌落生長(zhǎng)效果Fig. 4 Inhibitory effect of phototherapy on colony growth of P. gingivalis（a）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下細(xì)菌平板計(jì)數(shù)；（b）不同光學(xué)參數(shù)LED干預(yù)下抑菌率。*P＜0.05。(a) Bacterial plate counting at different optical parameters; (b) Bacteriostatic rate at different optical parameters. *P＜0.05.

波長(zhǎng)為455 nm、功率密度為10 mW/cm2時(shí)，光照劑量高于19.2 J/cm2有顯著的菌落抑制效果（P＜0.05）；當(dāng)功率密度為40 mW/cm2時(shí)，光照劑量高于9.6 J/cm2的菌落抑制效果與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨著光照劑量增加，抑菌率呈升高趨勢(shì)。光照劑量相同的條件下，40 mW/cm2的抑菌效果優(yōu)于10 mW/cm2。40 mW/cm2光照14 min（33.6 J/cm2）抑制菌落生長(zhǎng)效果最好，抑菌率可達(dá)（84.32±4.88）%。

2.3 兩種細(xì)菌光療抑菌效果比較

如圖5所示，405 nm波長(zhǎng)40 mW/cm2光照抑制牙齦卟啉單胞菌增殖的效果明顯優(yōu)于糞腸球菌，10 mW/cm2光照抑制兩種細(xì)菌增殖的效果差別并不顯著。

圖5 波長(zhǎng)405 nm LED光療抑制兩種細(xì)菌增殖的效果Fig. 5 Inhibitory effect of 405 nm LED phototherapy on proliferation of both kinds of bacteria（a） 即時(shí)殺菌效果；（b）抑制菌落生長(zhǎng)效果。*P＜0.05。(a) Immediate bactericidal effect; (b) Effect of inhibiting colony growth. *P＜0.05.

如圖6所示，455 nm波長(zhǎng)抑制兩種細(xì)菌增殖的總體效果差別并不顯著（P＞0.05）。

圖6 波長(zhǎng)455 nm LED光療抑制兩種細(xì)菌增殖的效果Fig. 6 Inhibitory effect of 455 nm LED phototherapy on proliferation of both kinds of bacteria（a）即時(shí)殺菌效果；（b）抑制菌落生長(zhǎng)效果。(a) Immediate bactericidal effect; (b) Effect of inhibiting colony growth.

2.4 兩種細(xì)菌內(nèi)源性卟啉的測(cè)定

紫外-可見吸收光譜中，兩種細(xì)菌在381 nm波長(zhǎng)處均出現(xiàn)了較高的吸收峰，且牙齦卟啉單胞菌吸收峰強(qiáng)度為糞腸球菌的3.7倍（圖7）。牙齦卟啉單胞菌在510、539和638 nm處還有3個(gè)小吸收峰，而糞腸球菌則是在510 nm和539 nm處有吸收峰。牙齦卟啉單胞菌在405 nm處峰值強(qiáng)度約為455 nm處的8.0倍。熒光發(fā)射光譜中，在400 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下，兩種細(xì)菌在608 nm和677 nm處均出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，且牙齦卟啉單胞菌熒光發(fā)射峰的相對(duì)強(qiáng)度為糞腸球菌的3.7倍。

圖7 兩種細(xì)菌的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜Fig. 7 Absorption spectra and fluorescence emission spectra（a）吸收光譜；（b）發(fā)射光譜。(a) Absorption spectra; (b) Fluorescence emission spectra.

3 討論

糞腸球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，是難治性根尖周炎、根管再感染的主要致病菌，對(duì)大多數(shù)根管治療藥物和清理消毒的方法都具有一定的抗性，是目前根管治療中的棘手問(wèn)題［21］。牙齦卟啉單胞菌是一種革蘭氏陰性專性厭氧菌，是引起牙周疾病的主要致病菌，感染后可引起牙周組織破壞、牙槽骨丟失，最終牙齒脫落［4，22-23］，其易產(chǎn)生抗生素耐藥性。

本研究選擇與口腔感染性疾病密切相關(guān)的兩種具有代表性的細(xì)菌作為研究對(duì)象，采用光療方法對(duì)兩種細(xì)菌進(jìn)行體外殺菌試驗(yàn)，觀察光療對(duì)兩種細(xì)菌的體外殺傷效果。研究結(jié)果顯示，兩種細(xì)菌都是在405 nm波長(zhǎng)光照下抑菌效果最佳，這可能與兩種細(xì)菌中存在卟啉這種內(nèi)源性光敏劑有關(guān)［20］。我們對(duì)這兩種細(xì)菌內(nèi)的卟啉進(jìn)行了光譜測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌的吸收峰與原卟啉Ⅸ有相似之處，但位置存在一定的差異。原卟啉Ⅸ的最大吸收峰在400～410 nm，兩個(gè)小吸收峰分別在550 nm和600 nm附近［20］。而本研究中兩種細(xì)菌的最大吸收峰在381 nm處，其他小吸收峰則在510、539和638 nm處，有明顯的藍(lán)移現(xiàn)象。兩種細(xì)菌在400 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下的發(fā)射峰與原卟啉Ⅸ一致，均在608 nm和677 nm處［17］。我們認(rèn)為，兩種細(xì)菌中存在的可被光激發(fā)的物質(zhì)除原卟啉Ⅸ外，可能還含有其他具有相似結(jié)構(gòu)的卟啉類化合物，如糞卟啉等［20］。405 nm處光吸收度約為455 nm處的8.0倍，因此，在相同的光照劑量下，殺菌效果更加明顯。我們還發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌的最大吸收峰和兩個(gè)發(fā)射峰均約為糞腸球菌的3.7倍，說(shuō)明與糞腸球菌相比，牙齦卟啉單胞菌中含有更豐富的卟啉類化合物，這也解釋了405 nm對(duì)牙齦卟啉單胞菌殺傷效果更好的原因。

雖然兩種致病菌都在405 nm波長(zhǎng)33.6 J/cm2照射劑量下治療效果最佳，但功率密度和照射時(shí)間存在差異，牙齦卟啉單胞菌功率密度大，照射時(shí)間短，糞腸球菌功率密度小，照射時(shí)間長(zhǎng)。其可能原因是牙齦卟啉單胞菌內(nèi)存在更豐富的卟啉類化合物，在405 nm高功率密度下大量卟啉類化合物同時(shí)被激發(fā)，在較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，并發(fā)生氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)殺傷細(xì)菌；糞腸球菌內(nèi)的卟啉類化合物相對(duì)較少，在405 nm低功率密度光照下，需經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間積累，產(chǎn)生足夠的活性氧以觸發(fā)氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生明顯的抑菌效果。

本研究中即時(shí)殺菌效果與菌落抑制效果結(jié)果相似。其中個(gè)別光照組的抑制菌落生長(zhǎng)效果略優(yōu)于即時(shí)殺菌效果，這可能是由于活死細(xì)菌染色時(shí)，有些受到光損傷的細(xì)菌細(xì)胞膜還保持完整，可被染成綠色，但功能受損無(wú)法繼續(xù)分裂繁殖形成菌落。這提示，在臨床治療中可綜合考慮即時(shí)殺菌效果和長(zhǎng)期抑菌效果來(lái)選擇合適的治療方案。

405 nm波長(zhǎng)光照對(duì)牙齦卟啉單胞菌殺傷作用已有相關(guān)研究證明［24-27］。Hope等［24］研究了405 nm光對(duì)牙齦卟啉單胞菌殺傷作用。與本研究不同，該研究采用功率密度更大（328.5 mW/cm2）的激光筆對(duì)細(xì)菌進(jìn)行照射，照射30 s時(shí)，盡管光照劑量只有9.86 J/cm2，但已有90.2%的細(xì)菌死亡，當(dāng)照射時(shí)間繼續(xù)增加至5 min（98.55 J/cm2），細(xì)菌死亡率達(dá)94.5%，并沒(méi)有比30 s時(shí)明顯增加。對(duì)比本研究，同為405 nm波長(zhǎng)，功率密度更大的激光雖短時(shí)間內(nèi)可達(dá)到明顯的殺菌效果，但治療結(jié)束時(shí)的最終殺菌效果并不優(yōu)于LED，這與細(xì)菌內(nèi)卟啉類內(nèi)源性光敏劑含量有限有關(guān)，單純?cè)黾庸庹談┝坎粫?huì)持續(xù)增加殺菌效果。Fukui等［25］采用了與本研究光學(xué)參數(shù)（405 nm，50 mW/cm2）相近的LED對(duì)牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行研究，得出的結(jié)果也與本研究相似，照射1～5 min（光照劑量3～15 J/cm2）時(shí)，抑菌率在20%～40%。該研究還采用了405 nm、100 mW/cm2照射5 min（30 J/cm2）的光學(xué)參數(shù)，抑菌率約50%，明顯低于本研究405 nm波長(zhǎng)40 mW/cm2照射14 min（33.6 J/cm2）的抑菌率，這可能與照射時(shí)間較短，總照射劑量未至飽和有關(guān)。

405 nm波長(zhǎng)光照對(duì)糞腸球菌殺傷作用報(bào)道較少，且目前研究認(rèn)為405 nm波長(zhǎng)光照對(duì)糞腸球菌殺傷作用不明顯［1，24，28-29］，這與本研究結(jié)果存在差異。我們認(rèn)為可能有兩個(gè)原因：一是這些研究中光照時(shí)間均較短，最長(zhǎng)不超過(guò)5 min，雖然光照劑量達(dá)200 J/cm2，但短時(shí)間內(nèi)光照過(guò)飽和，內(nèi)源性卟啉激發(fā)效果有限，導(dǎo)致殺菌不明顯；二是在LED光照對(duì)糞腸球菌殺傷作用中，由卟啉類化合物激發(fā)產(chǎn)生的光動(dòng)力效應(yīng)可能不是唯一效應(yīng)，存在其他機(jī)制共同參與完成殺菌［30］，故LED光療對(duì)糞腸球菌的殺傷機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

除400～500 nm的藍(lán)光外，紅光也有殺菌效果。K?nig等［31］用632.8 nm紅光（功率密度100 mW cm2， 能量密度360 J/cm2）進(jìn)行照射，痤瘡丙酸桿菌存活率為（58±9）%，牙齦卟啉單胞菌存活率為（59±10）%，殺菌效果不佳，且光學(xué)參數(shù)明顯高于藍(lán)光。從細(xì)菌內(nèi)源性光敏劑的吸收光譜來(lái)看（圖7），藍(lán)光的吸收率明顯高于紅光。相同的輸出功率下，藍(lán)光的有效劑量高于紅光，但是考慮到藍(lán)光對(duì)人眼的傷害和波長(zhǎng)對(duì)光在組織中的穿透深度的影響，有學(xué)者認(rèn)為紅光更適合臨床［32］。我們認(rèn)為對(duì)于牙周表面的感染性疾病，藍(lán)光在組織中的穿透深度（1～2 mm）已可滿足要求，但是對(duì)于牙周袋內(nèi)的感染，可能紅光的殺菌效果更好。在下一步的研究中，我們將進(jìn)行藍(lán)光和紅光殺菌效果的對(duì)比研究，為臨床治療提供更詳實(shí)的證據(jù)。由于紅外光不在卟啉類化合物的吸收峰值上［20］，因此目前尚無(wú)單獨(dú)應(yīng)用紅外光的殺菌效果的研究。但紅外光聯(lián)合外源性非卟啉類光敏劑的殺菌效果的研究已見報(bào)道［33］，紅外光在口腔非感染性炎癥的治療上也有好的效果［34］。

綜上所述，LED光療對(duì)口腔常見致病菌牙齦卟啉單胞菌和糞腸球菌有顯著的抑菌效果，光學(xué)參數(shù)對(duì)其有顯著的影響，波長(zhǎng)為405 nm、照射劑量為33.6 J/cm2時(shí)治療效果最佳。LED作為一種新型低成本光源，在口腔細(xì)菌感染的臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。