膿毒癥關鍵基因的篩選與生物信息學分析

馬 蘭，胡迎春，張 川，胡 林，梁思雪，彭 淼，何 亞，陳睦虎

1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診醫(yī)學部（瀘州 646000）；2.雅安職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院 內科（雅安 625100）；3.蘆山縣人民醫(yī)院兒科（雅安 625600）

膿毒癥是世界范圍內的主要健康問題[1]，是宿主對感染的反應失調，繼而導致器官功能障礙。病原體觸發(fā)了最初的炎癥-免疫反應，導致多種內皮、激素、代謝、免疫和其他途徑的激活或抑制，繼而產生循環(huán)和代謝紊亂，從而導致器官功能障礙[2]。膿毒癥病情兇險，病死率高，大約有9%的膿毒癥患者會發(fā)生膿毒性休克和多器官功能不全，重癥監(jiān)護室中一半以上的死亡是由膿毒性休克和多器官功能不全引起的，膿毒癥成為重癥監(jiān)護病房內非心臟病人死亡的主要原因[3]。每年有超過75萬人患上敗血癥，其中21.5萬人死于該疾病[4]。目前，對于膿毒癥的治療，主要給予抗感染、液體復蘇、多器官的功能維持等綜合治療[5-6]。然而，即使有體外膜肺氧合（ECMO）這樣的高級支持技術，膿毒癥的預后仍然欠佳[7]。盡管近幾年來膿毒癥的研究已經廣泛，但是與膿毒癥相關的發(fā)病率和死亡率仍在增加。早期診斷和早期治療對膿毒癥患者很重要[8]。因此篩選潛在的生物標志物顯得尤為重要。

RNA測序技術的進步引發(fā)了廣泛的大規(guī)模基因表達研究和海量信使RNA（mRNA）數(shù)據(jù)[9]。準確、高效的讀取比對是RNA 序列分析的基本挑戰(zhàn)之一[10]。通過RNA 測序（RNA-Seq）進行全轉錄組測序，并適當結合生物信息學方法，可提供一種強大的工具對基因進行鑒定，以促進基因組疾病的診斷[11]。本研究通過數(shù)據(jù)集GSE28750 找到了在膿毒癥患者與正常人之間的差異基因，對差異基因進行生物信息學分析并結合臨床資料，找到了關鍵基因，并采用生存曲線預測關鍵基因對疾病的影響。本研究有助于從基因水平深入了解膿毒癥，這些找到的關鍵基因，將可能成為新的藥物靶點或生物標志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

基因表達數(shù)據(jù)集GSE28750 是從基因表達數(shù)據(jù)庫GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載的，它包含10 個膿毒癥患者外周血樣本和20 個正常人外周血樣本。將此數(shù)據(jù)集提交到OmicShare 在線數(shù)據(jù)分析平臺中，采用小提琴圖來判斷數(shù)據(jù)的均一化水平。

1.2 數(shù)據(jù)預處理與差異基因篩選

使用在線軟件GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE28750進行差異基因分析，得到膿毒癥樣本和正常樣本之間差異基因，設置P<0.01，F(xiàn)old Change>2為截取值篩選差異基因，并運用Omic Share Tools的火山圖可視化處理差異基因。

1.3 GO和Pathway分析

基因本體論（gene ontology，GO）涉及的基因和基因產物詞匯分為三大類，涵蓋生物學的生物過程、細胞組分、分子功能，通過GO 富集分析以了解差異基因主要富集在哪些生物學功能、途徑和細胞定位。通過Pathway分析以了解實驗條件下顯著改變的代謝通路。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因（及其編碼產物）間關系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，把基因及表達信息作為一個整體網絡進行研究。本研究中，我們把差異基因提交到DAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）中進行GO以及信號通路富集，并設置P<0.05 且FDR<0.05 為臨界值，篩選出基因富集最顯著10個功能和通路，其結果可視化采用OmicShare工具中制作氣泡圖。

1.4 PPI網絡的構建

STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫用于搜索已知蛋白質之間和預測蛋白質之間相互作用，該數(shù)據(jù)庫可應用于2031個物種，包含960萬種蛋白和1380萬種蛋白質之間的相互作用。我們將差異基因提交到STRING 中，篩選了所有經過實驗驗證的結果，并去除在網絡中沒有聯(lián)系的點，設置最低要求的互動可信度為0.4，得到蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein inter?action network，PPI network）。通過蛋白質之間的相互作用網絡，預測得到關鍵基因。PPI中核心基因繪制熱圖，很好地展示了所有基因在不同樣本的變化規(guī)律。在熱圖中，基因的表達量做了歸一化的處理，并且表達模式相似的基因會被歸為一類。

1.5 生存曲線

數(shù)據(jù)集GSE65682有800 余例血液樣本數(shù)據(jù)，其中包括400 余例膿毒血癥患者外周血的樣本，每個樣本都有具體的生存時間與預后狀態(tài)。為了進一步研究上述關鍵的基因對膿毒血癥休克患者預后的影響，我們應用GraphPad Prism 7.0 制作生存曲線，進而推測該基因對疾病的影響。

2 結果

2.1 差異基因篩選

獲得預處理的GSE28750數(shù)據(jù)集后，此數(shù)據(jù)集中各個樣本的中位數(shù)基本位于一條直線上，即樣本之間有可比性（圖1）。根據(jù)P<0.01 和|logFC|>2，獲得295 個差異基因，包括188個上調基因和107個下調基因（圖2）。

圖1 樣本基因表達豐度小提琴圖Figure 1 Violin map of gene expression abundance in samples

圖2 差異表達基因的火山圖Figure 2 Volcanic map of DEGs

2.2 GO及Pathway分析

篩選出的差異基因富集最顯著20個功能是：免疫反應、小分子代謝過程、細胞表面受體信號通路、信號轉導、先天免疫反應、T細胞受體信號通路、凝血（圖3）等。最顯著的20 個信號通路包括：造血細胞譜系、HTLV-I 感染、代謝途徑、核糖體、T 細胞受體信號通路、MAPK 信號通路、抗原加工和呈遞、金黃色葡萄球菌感染（圖4）等。

圖3 GO分析氣泡圖Figure 3 GO analysis

圖4 信號通路富集氣泡圖Figure 4 Signal pathway enrichment

2.3 PPI網絡的構建

PPI 網絡圖是根據(jù)既往研究蛋白與蛋白之間的作用，從而推斷哪些基因可能更重要。網絡節(jié)點是蛋白質，蛋白質間的連線表示預測的功能關聯(lián)。理論上說，連線越多越靠近中央?yún)^(qū)域，這些基因就越可能更重要，即所謂的核心基因。同時我們結合不同的GO 分析（不同顏色代表不同功能），還能初步了解這些核心基因的功能。該網絡中CD247、LCK連線多且顏色多，說明相比之下，它們是具有更多的相互作用且更多功能的蛋白質，被我們篩選為核心基因（圖5）。我們通過熱圖進一步查看這些核心區(qū)域的基因表達情況（圖6）。

圖5 PPI網絡圖Figure 5 PPI Network Diagram

圖6 核心基因熱圖Figure 6 Heat map of core genes

2.4 生存曲線

本研究以P<0.05 為截取值，對關鍵基因CD247、LCK進行生存曲線分析，得出它們均與患者預后呈現(xiàn)正相關，即其中兩者表達值越高，生存的時間越長（圖7A-B），我們推測這些核心基因可能促進了膿毒癥患者的免疫功能。

圖7 A-B CD247（A）與LCK（B）的生存曲線Figure 7 A-B Survival Curve of CD247（A）and LCK（B）

3 討論

膿毒癥是感染引起的炎癥反應失調進而導致的危及生命的器官功能障礙[12]，其導致死亡并消耗大量醫(yī)療資源。盡管技術上取得了進步，病理生理學的知識不斷提高，但對疾病的機制仍知之甚少[13]。臨床上，盡管進行了強有力的抗感染治療，但仍有一些膿毒癥患者死亡，尤其是在合并膿毒癥休克時。膿毒癥是病原體與宿主免疫系統(tǒng)之間的一場死亡競賽，促炎癥系統(tǒng)與抗炎癥系統(tǒng)之間的平衡決定了患者的命運，膿毒癥死亡患者T細胞、B 細胞、DC細胞以及KCs細胞出現(xiàn)功能衰竭[14]。有大量證據(jù)表明膿毒癥導致中性粒細胞功能改變，而中性粒細胞通過其產生H2O2是先天免疫的第一道防線[15]。但目前沒有理想的抗菌療法和藥物治療，治療膿毒癥已經達到了一個瓶頸。在臨床實踐中，決定患者預后的關鍵因素及其潛在機制值得我們進行深入研究。我們從基因水平出發(fā)，利用生物信息學方法，通過基因芯片分析，找到了關于膿毒癥的兩個關鍵基因，這兩個關鍵基因有望成為膿毒癥新的生物標志物和治療靶點。我們從基因表達數(shù)據(jù)庫GEO中下載表達數(shù)據(jù)集GSE28750，并通過生物信息學技術篩選出多個核心基因[16]，同時結合臨床預后數(shù)據(jù)，最終確定CD247、LCK與膿毒癥患者的預后呈現(xiàn)正相關。因此，我們推測這兩個基因為膿毒癥潛在的核心基因，為后期的研究靶點。

CD247是T細胞抗原受體（TCR）復合物的重要接頭和信號轉導分子，它與NK 細胞激活受體如NKp46、NKp30 和CD16A（FcγRIII）偶聯(lián)。其表達的非編碼序列的多態(tài)性和變異是一個嚴格調控的過程，與多種健康狀況下的免疫反應改變有關[17]。目前，已經有研究證明，CD247表達量與器官衰竭負相關[18]，胸腺瘤患者獲得的胸腺細胞群中觀察到CD247的存在減少[19]。有研究表明系統(tǒng)紅斑狼瘡與CD247的缺失有關[20]，而它是T細胞受體（TCR）CD3 復合體的一個組成部分，進而影響免疫應答[21]。

LCK 是一種Src 相關蛋白酪氨酸激酶，與CD4 和CD8 分子結合，對T 細胞發(fā)育和T 細胞活化至關重要，已經成為治療癌癥和神經元疾病的新型藥物靶向分子[22-23]。LCK 作為一種56KDa 的蛋白質，可磷酸化各種蛋白質（例如ZAP-70，ITK 和蛋白激酶C）的酪氨酸殘基，其表達和活性的改變可能導致各種疾病，例如癌癥，哮喘，糖尿病，類風濕性關節(jié)炎，牛皮癬，炎癥性腸?。ɡ缈肆_恩氏病和潰瘍性結腸炎）[24]。LCK 是一種通過T細胞抗原受體進行信號轉導所需的非受體蛋白酪氨酸激酶[25]，在T細胞發(fā)育的幾個階段需要基于TCR的信號傳導，每個基于T 細胞抗原受體的信號都需要Src 家族激酶，而LCK 起主要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)LCK與小鼠膿毒癥預后呈正相關[26]。而我們的GO分析結果顯示T 細胞受體通路確實被激活，這也再次支持了我們的推測。

4 結論

CD247，LCK等核心基因可能通過T細胞受體通路促進膿毒癥患者的免疫功能，從而達到殺滅病原微生物的作用，影響患者的預后。研究與膿毒癥相關的CD247，LCK核心基因生物學功能和代謝途徑，有利于從基因水平尋找早期診斷膿毒癥的生物學標志物和治療膿毒癥的藥物靶點，但這些核心基因在膿毒癥中的相關作用，仍需進一步研究和證實。

（利益沖突：無）