血栓彈力圖指導(dǎo)下抗結(jié)核藥物對人凝血功能的直接影響：一項體外研究

江山 奚雷 孫楊

結(jié)核性膿胸手術(shù)常存在時間長，術(shù)中易出血，術(shù)后康復(fù)時間長，圍術(shù)期管理相對復(fù)雜的特點[1]。該類患者凝血功能較差，其中抗結(jié)核藥物會損傷肝腎功能，進而會對凝血功能產(chǎn)生影響[2]。但臨床常用的異煙肼和利福平這兩種藥物是否會對患者體內(nèi)凝血功能產(chǎn)生直接影響目前尚無文獻報道。血栓彈力圖可以直觀性的觀察到藥物對凝血功能的影響[3-4]，較傳統(tǒng)凝血功能檢測更具有整體性、動態(tài)性的評估[5-7]。本研究擬通過血栓彈力圖技術(shù)觀察異煙肼和利福平這兩種抗結(jié)核藥物分別對人體凝血功能的直接影響，進一步探討兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時，是否會對人凝血功能產(chǎn)生直接的相加或協(xié)同作用；為臨床上結(jié)核性膿胸患者圍術(shù)期可能存在的凝血功能紊亂的原因提供一定的實驗參考依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象的選擇

本研究獲本院倫理委員會批準(批件號：2019-KL002-01)，所有入組患者均簽署知情同意書。選擇2019年1月至2019年10月招募的64例志愿者。納入標準為：1)年齡在25至60歲之間；2)身高體重指數(shù)(BMI)≤30 kg/m2；3)受試前肝腎功能檢查未見異常；4)無凝血相關(guān)性疾病病史。排除標準為：1)患有嚴重心臟疾病、內(nèi)分泌和代謝疾病、神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)疾病、水，電解質(zhì)，酸堿平衡失調(diào)者；2)肝、腎功能不全者；3)存在嚴重感染者；4)存在血液系統(tǒng)相關(guān)疾病者；5)有腫瘤史或既往接受放化療史；6)糖尿病患者；7)正在接受抗凝治療者。

二、研究流程

采用隨機數(shù)字表法，采集每位志愿者的血樣分配至下列四組：對照組(NS組)，異煙肼組(I組)、利福平組(R組)和聯(lián)合藥物組(C組)。每組各志愿者均采集兩份血樣，一份加入抗凝管中作為基線血樣(分別記為NS-基線、I-基線、R-基線和C-基線)，另一份加入預(yù)處理后的抗凝管中(處理方式見下文，按組別，分別記為NS、I、R和C)。所有抗凝管均用有色紙張覆蓋表面，采血者和進行血栓彈力圖分析的操作者，均不知曉分組情況。

三、志愿者血樣的采集

所有志愿者統(tǒng)一經(jīng)左肘靜脈采集血樣。采用22 G穿刺針和管道，操作者戴無菌手套，常規(guī)皮膚消毒后進行穿刺采血。每位志愿者先采集2 mL靜脈血留作基線血樣；再采集1.9 mL靜脈血樣，加入預(yù)處理后的抗凝管中(預(yù)處理方式見下文)，兩組血樣靜置15分鐘后行血栓彈力圖檢測。

四、抗凝試管預(yù)處理

本研究使用3.2 %檸檬酸鈉負壓管作為抗凝采血管，各組在抗凝管中加入等容量的試劑。其中NS組加入0.1 mL含0.9 %的氯化鈉溶液，I組加入0.1 mL異煙肼試劑(含異煙肼12 μg)；R組加入0.1 mL利福平試劑(含利福平48 μg)；C組加入0.1 mL異煙肼和利福平的混合試劑(含異煙肼12 μg和利福平48 μg)。

五、觀察指標

主要觀察指標包括各組中基線血樣和加入試劑后血栓彈力圖檢測的結(jié)果，包括R時間、K時間、α角度、MA值等參數(shù)，并通過配套軟件計算血塊強度G值和綜合凝血指數(shù)CI。其它觀察指標有志愿者的一般情況，包括年齡、性別、身高體重指數(shù)(BMI)、術(shù)前血小板計數(shù)、血紅蛋白濃度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素氮和肌酐的濃度、鈣離子、傳統(tǒng)凝血功能檢測，包括凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APPT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時間(TT)、國際標準化率(INR)、D-二聚體(D-D)的值。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

七、樣本含量的計算

本研究通過預(yù)實驗，結(jié)合血栓彈力圖中的綜合凝血指數(shù)(CI)推算樣本含量。預(yù)實驗共納入8位志愿者，結(jié)果提示，異煙肼聯(lián)合利福平組的CI值均低于生理鹽水組和利福平組(-13.69±7.63vs. -8.63±4.24 ；-13.69±7.63vs. -7.87±3.25)；異煙肼組CI值低于利福平組(-12.82±5.50vs. -7.87±3.25)；而生理鹽水組和利福平組未見明顯差異。根據(jù)預(yù)實驗各組所獲得的CI值，計算得效應(yīng)量為0.48，設(shè)雙側(cè)α=0.05，檢驗效能β為80 %，數(shù)據(jù)缺失率為20 %，采用G-power 3.1.9.2軟件計算樣本大小，計算得共需64例患者。

結(jié) 果

一、四組志愿者的一般情況比較

最終共64位志愿者參與了本次研究，每組志愿者均有16位。四組志愿者受試前的年齡、性別、身高體重指數(shù)(BMI)、術(shù)前血小板(PLT)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、血紅蛋白(Hb)；傳統(tǒng)凝血功能檢測術(shù)前凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原含量(FIB)、D-二聚體(D-D)和鈣離子進行比較，分別進行兩兩比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表1)。

表1 四組志愿者一般資料

二、各組血栓彈力圖的分析

1.基線血樣分析：將各組基線血樣進行血栓彈力圖檢測，結(jié)果中各組的血栓彈力圖各參數(shù)比較均未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見圖1A～F)。

圖1 四組基線血樣的血栓彈力圖結(jié)果

2.預(yù)處理后各組血樣分析：四組血栓彈力圖參數(shù)中R時間組間比較有差異，進一步多重比較，I組時間長于NS組和R組(P<0.05)；K時間組間比較有差異，進一步多重比較，I組和C組的K時間均長于NS組和R組(P<0.05)。α角度組間比較有差異，進一步多重比較，I組和C組的α角度均小于NS組和R組(P<0.05)；最大強度MA值組間比較有差異，進一步多重比較，I組和C組的MA值均小于NS組和R組(P<0.05)；軟件計算所得的血塊強度計算值 G值在組間比較有差異，進一步多重比較，I組和C組的G值均小于NS組和R組(P<0.05)；軟件計算反映綜合凝血功能的計算值CI組間比較有差異，進一步多重比較，I組和C組的CI值均小于NS組和R組(P<0.05)(見圖2A～F)。

圖2 四組加入試劑血樣的血栓彈力圖結(jié)果

討 論

本研究提示，在體外離體血模型下，抗結(jié)核藥物中，異煙肼和異煙肼聯(lián)合利福平可能會對血液有直接的抗凝作用，未見異煙肼和利福平聯(lián)合用藥，會對離體血凝血功能有明顯的相加或者協(xié)同作用。

接受抗結(jié)核治療的患者存在治療周期長、營養(yǎng)狀態(tài)差、肝臟功能受損、結(jié)核菌毒素在體內(nèi)釋放等，患者會存在凝血功能的異常。在導(dǎo)致凝血功能異常的諸多原因中，抗結(jié)核藥物對凝血功能的直接影響尚無相關(guān)研究[8]。目前圍術(shù)期抗結(jié)核藥物的應(yīng)用強調(diào)聯(lián)合、規(guī)律、全程的原則，一般在入院前采用口服四聯(lián)抗結(jié)核藥物治療方案(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇)；入院后患者常將口服四聯(lián)藥物改為靜脈給予異煙肼和利福平強化治療，為防止手術(shù)過程中可能造成的結(jié)核菌播散和術(shù)后結(jié)核耐藥菌的復(fù)發(fā)，故異煙肼和利福平的應(yīng)用常持續(xù)至手術(shù)當(dāng)日[9]。一些文獻提示，異煙肼可能會對凝血階段ⅩⅢ因子的活性有一定的影響，而活化的ⅩⅢ因子對纖維蛋白單體和血小板的交互交織起到重要的作用，其因子活性的降低會直接影響到血凝塊的強度和穩(wěn)定性[4]。本研究中異煙肼和異煙肼聯(lián)合利福平的血栓彈力圖中，K值延長和α角度的降低，提示血凝塊交織的過程緩慢，而MA值和G值的降低反映了血凝塊強度的下降，提示形成的血凝塊的剛度和穩(wěn)定性較差。盡管利福平在臨床研究中提示可能會對一些藥物的抗凝作用產(chǎn)生增強效應(yīng)[10-11]，不過在本研究中，利福平在體外研究中并未發(fā)現(xiàn)存在協(xié)同效應(yīng)。

本研究選擇了志愿者的體外離體血模型來監(jiān)測抗結(jié)核藥物對凝血功能的影響，其原因有：一，長期應(yīng)用異煙肼或(和)利福平會產(chǎn)生肝臟或者腎臟的損傷，肝腎功能的異?？赡軙C體的凝血功能產(chǎn)生影響[12]；二，兩種抗結(jié)核藥物在短期應(yīng)用時的血藥濃度個體化差異很大，如在體內(nèi)應(yīng)用后，血藥濃度的變化和代謝產(chǎn)物的影響可能會干擾整個凝血階段的進程，繼而會對血栓彈力圖的結(jié)果產(chǎn)生一定影響[13]；三，該模型可以實現(xiàn)通過采用固定的抗結(jié)核藥的藥物濃度對凝血功能進行觀察；四，采用血栓彈力圖技術(shù)可以反映抗結(jié)核藥物對凝血功能的整體變化，易于發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核藥物對全血凝血功能的階段性的影響[5]。

本研究在藥物濃度的確定中選取了最新版Park J.S.等[14]制訂的異煙肼和利福平在臨床上治療劑量血藥濃度的中位數(shù)。主要考慮是兩種抗結(jié)核藥物在個體的藥代動力學(xué)差異，可能會導(dǎo)致抗結(jié)核藥物血藥濃度的波動范圍較大有時甚至?xí)稣５难帩舛确秶瑫ψ罱K結(jié)果的判讀產(chǎn)生一定影響，選用中位數(shù)濃度可以較好的觀察兩種藥物在臨床相關(guān)濃度中對凝血功能的影響。查閱知異煙肼的血藥濃度范圍為3～6 μg/mL，而利福平的血藥濃度范圍為8～24 μg/mL，本研究中異煙肼選用的濃度為該藥的中位數(shù)4.5 μg/mL，利福平選用的是對應(yīng)濃度的中位數(shù)16 μg/mL[14]。

由于血栓彈力圖操作中會加入的激活劑以提高檢驗效能，臨床上常用高嶺土作為激活劑，其通過激活Ⅻ因子啟動內(nèi)源性凝血通路激活凝血系統(tǒng)，加快凝血塊的形成速率；但其激活方式可能會對血栓彈力圖的輸出結(jié)果產(chǎn)生一定的影響[15]。故本研究中均未采用激活劑對全血進行激活處理，以盡可能的減少激活劑對檢測結(jié)果的影響，保證了實驗的穩(wěn)定性。

本研究的局限性如下：一，本研究為體外研究，而體內(nèi)一些更為復(fù)雜的凝血因子(如蛋白C系統(tǒng)、抗凝血酶系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物等)也可能會對凝血結(jié)果產(chǎn)生一定的影響；二，考慮到抗結(jié)核藥物在體內(nèi)的血藥濃度，可能會有不同程度的差異，因此不同血藥濃度的抗結(jié)核藥物對凝血功能的直接影響尚需進一步研究；三，本研究觀察了圍術(shù)期常用的藥物異煙肼和利福平對凝血功能的直接影響，抗結(jié)核治療中的其它藥物，如乙胺丁醇和吡嗪酰胺是否也會對凝血功能產(chǎn)生直接影響，有待進一步的探究。

總之，在離體血模型中，通過血栓彈力圖提示抗結(jié)核藥物中異煙肼可能會對血樣產(chǎn)生低凝效應(yīng)，而異煙肼聯(lián)合利福平產(chǎn)生的低凝狀態(tài)未見明顯的協(xié)同和相加作用。