基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討炙甘草湯治療心律失常的作用機(jī)制

葉嘉豪　胡志?！＄娚堋∏窈辍⌒芟架?/p>

摘要 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討炙甘草湯治療心律失常的作用機(jī)制。方法：運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出炙甘草湯有效成分及其作用靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出心律失常的疾病靶點(diǎn)，并與中藥靶點(diǎn)合并取交叉靶點(diǎn)，采用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.2篩選關(guān)鍵基因，同時(shí)借助CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?運(yùn)用Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)及RX64 4.0.0軟件對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。利用swissdock在線分子對(duì)接工具對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白與核心化合物分子進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果：篩選出171個(gè)化合物及4 090個(gè)靶點(diǎn)，得到關(guān)于心律失常疾病靶點(diǎn)435個(gè);PPI結(jié)果顯示，Degree值排名前6的基因分別為：INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3;拓?fù)浞治鲲@示Degree排名前5的基因分別為：EGFR、HSPA8、NTRK1、ESR1、HSP90AA1;分子對(duì)接結(jié)果顯示：炙甘草湯的大多數(shù)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合率較強(qiáng)，其結(jié)合能最低為SCN5A與Lysine、KCNH2與Gamma-Aminobutyric Acid;GO富集分析顯示炙甘草湯治療心律失常與心臟收縮、心臟肌肉收縮、心的過(guò)程、橫紋肌收縮、心臟收縮調(diào)節(jié)等有關(guān)。KEGG富集分析顯示心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)、肥厚型心肌病、cGMP-PKG信號(hào)通路、擴(kuò)張型心肌病相關(guān)。結(jié)論：炙甘草湯治療心律失常具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 心律失常;炙甘草湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點(diǎn);通路;分子對(duì)接;作用機(jī)制

Mechanism of Zhigancao Decoction in Treatment of Arrhythmia Based on Network Pharmacology

YE Jiahao，HU Zhixi，ZHONG Senjie，QIU Hong，XIONG Xiajun

（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Zhigancao Decoction in treating arrhythmia based on network pharmacology.Methods：The active ingredients and targets of Zhigancao Decoction were screened out from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and BATMAN-TCM，and the disease targets of arrhythmia were screened out through GeneCards and OMIM.The common targets of the drug and the disease were obtained.String was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network of targets，and Cytoscape 3.7.2 was used to screen key genes，which underwent topological data analysis by CytoNCA plug-in.Bioconductor and RX64 4.0.0 were adopted for GO enrichment and KEGG pathway enrichment analyses of common genes.The core proteins were subjected to molecular docking with core compound molecules in the PPI network using SwissDock.Results：A total of 171 compounds and 4 090 targets were screened out，and 435 targets related to arrhythmia were obtained.PPI results showed that in terms of degree，the top 6 genes were INS，KCNH2，SCN5A，CAV3，GJA1，and TNNI3.Topological data analysis revealed that in terms of degree，the top 5 genes were EGFR，HSPA8，NTRK1，ESR1，and HSP90AA1.Molecular docking results showed that most of the active ingredients and key targets of Zhigancao Decoction had high binding rates，with the lowest binding energy of SCN5A to lysine and KCNH2 to γ-aminobutyric acid.GO enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Zhigancao Decoction was related to heart contraction，heart muscle contraction，heart process，striated muscle contraction，and heart contraction regulation.KEGG enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Zhigancao Decoction was associated with adrenergic signal in cardiomyocytes，hypertrophic cardiomyopathy，cGMP-PKG signaling pathway，and dilated cardiomyopathy.Conclusion：Zhigancao Decoction is characterized by multi-component，multi-target，and multi-pathway in the treatment of arrhythmia.

Keywords Arhythmia; Zhigancao Decoction; Network pharmacology; Target; Pathway; Molecular docking; Mechanism

中圖分類號(hào)：R289.5;R541文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.002

心律失常是由于各類心臟疾病所導(dǎo)致心律傳導(dǎo)異常的病變，具體表現(xiàn)為心律過(guò)速或心律不齊、心房顫動(dòng)以及相關(guān)病變引發(fā)的全身性癥狀[1]?；颊叱Ｒ蛐穆墒С３霈F(xiàn)乏力、頭暈等癥狀;嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)抽搐、暈厥、胸痛或氣促等現(xiàn)象，甚至?xí)鹦脑葱遭繹2]。臨床上常用炙甘草湯治療心律失常，炙甘草湯出自《傷寒論》，具有益氣滋陰，通陽(yáng)復(fù)脈之功效[3-4]。主治陰血陽(yáng)氣虛弱，心脈失養(yǎng)證。脈結(jié)代，心動(dòng)悸，虛羸少氣，舌光少苔，或質(zhì)干而瘦小者;虛勞肺痿等。其由炙甘草、生姜、桂枝、人參、地黃、阿膠、麥冬、火麻仁、大棗組成。現(xiàn)代研究表明，炙甘草湯具有效擴(kuò)張血管，從而促進(jìn)患者血液循環(huán)，改善心肌供血，同時(shí)能有效加強(qiáng)心臟收縮力的作用[5-7]。現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，探討炙甘草湯治療心律失常的分子作用機(jī)制，為臨床實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 炙甘草湯化學(xué)成分篩選及潛在靶點(diǎn)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）查找關(guān)于炙甘草湯的主要有效成分及靶點(diǎn)，篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）>30%及類藥性（Drug Likeness，DL）>0.18，檢索關(guān)鍵詞為：甘草、生姜、桂枝、麥冬、地黃、火麻仁、阿膠、大棗、人參;若在TCMSP中找不到相關(guān)中藥，則利用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）查找有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)，篩選條件為SCORE>20。

1.2 心律失常疾病靶基因的篩選 檢索GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）篩選心律失常相關(guān)靶點(diǎn)，以“arrhythmia”為關(guān)鍵詞，Genecard選取相關(guān)性得分>10的靶點(diǎn)，通過(guò)合并去重后，最終獲得心律失?；虬悬c(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病”交集靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)及其網(wǎng)絡(luò)圖 將炙甘草湯潛在靶點(diǎn)與心律失常靶點(diǎn)利用PERL軟件進(jìn)行合并，剔除重復(fù)或無(wú)對(duì)應(yīng)化學(xué)成分的靶點(diǎn)后，獲得炙甘草湯-心律失常共同靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.2（http：//www.cytoscape.org/）對(duì)其進(jìn)行可視化，構(gòu)建出“中藥-活性成分-疾病”基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?將炙甘草湯-心律失常共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），種族選擇Homo sapiens，其置信度設(shè)置為0.4，進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI），按照節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）高低對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行前后排序。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA工具對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治觯凑展?jié)點(diǎn)度值（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality）的數(shù)值高低進(jìn)行排序，在構(gòu)建關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)上以Degree和Betweenness≥中位數(shù)為篩選條件，篩選核心靶基因。

1.5 富集分析 利用Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)及RX64 4.0.0軟件對(duì)核心靶基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，物種選擇為人，閾值設(shè)定為P≤0.5，GO富集分析選擇生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）。

1.6 分子對(duì)接 從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）下載PPI網(wǎng)絡(luò)中得分排名前4的蛋白結(jié)構(gòu)，利用Pymol軟件移除配體和水分子;從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心化合物的sdf文件，利用OpenBabel軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2格式，將靶點(diǎn)蛋白及化合物分子運(yùn)用swissdock（http：//www.swissdock.ch/）進(jìn)行在線分子對(duì)接。配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。當(dāng)結(jié)合能絕對(duì)值>4.25表示分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合能力，>5.0表示結(jié)合能力較強(qiáng)，>7.0表示結(jié)合能力很強(qiáng)[8]。

2 結(jié)果

2.1 炙甘草湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得出171個(gè)化合物，其中大棗16個(gè)、桂枝7個(gè)、火麻仁6個(gè)、人參22個(gè)、生姜5個(gè)、甘草92個(gè)，阿膠3個(gè)、地黃2個(gè)、麥冬18個(gè)，各中藥有效成分見(jiàn)表1。檢索出靶點(diǎn)為4 090個(gè)，其中大棗113個(gè)、甘草2 506個(gè)、桂枝73個(gè)、火麻仁139個(gè)、人參256個(gè)、生姜75個(gè)、阿膠418個(gè)，地黃205個(gè)，麥冬305個(gè)。

2.2 心律失常相關(guān)靶點(diǎn) 利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，以“arrhythmia”為關(guān)鍵詞，Genecard篩選標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)度Score>10，共獲得疾病靶基因435個(gè)，其中Genecard獲得257個(gè)，OMIM獲得178個(gè)。

2.3 “中藥-成分-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將炙甘草湯靶點(diǎn)與心律失常靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel表進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)心律失常與炙甘草湯潛在靶點(diǎn)有44個(gè)重合。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-成分-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)。靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)44個(gè)，化合物節(jié)點(diǎn)105個(gè)，共計(jì)149個(gè)，620條邊;化合物中度值前5為：Stigmasterol、Lysine、Gamma-Aminobutyric Acid、Fumarine、Licoagrocarpin;中藥-成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1。

2.4 中藥-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將炙甘草湯-心律失常共同靶點(diǎn)導(dǎo)入string中。限定物種為人，設(shè)置置信度閾值≥0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中不相關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)。結(jié)果共涉及44個(gè)節(jié)點(diǎn)，198條邊，平均節(jié)度點(diǎn)為9.0，平均局部聚類系數(shù)為0.619。見(jiàn)圖2。采用RX64 4.0.0描繪出前30個(gè)靶基因的柱狀圖，并進(jìn)行柱狀圖可視化。得到Degree排名前6為INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3。見(jiàn)圖3。

2.5 拓?fù)浞治?將從string數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的疾病與化合物交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape，運(yùn)用Cytoscape中的CytoNCA插件對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選條件為節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）和節(jié)點(diǎn)介度

2.6 GO及KEGG通路富集分析 利用Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)及RX64 4.0.0軟件對(duì)炙甘草湯作用的靶基因進(jìn)行生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）的GO、KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值為P≤0.05。

GO富集分析結(jié)果顯示：得到條目共728個(gè)，其中BP條目612條，CC條目48條，MF條目68條。BP主要與心臟收縮（Heart Contraction）、心臟肌肉收縮（Cardiac Muscle Contraction）、心的過(guò)程（Heart Process）、橫紋肌收縮（Striated Muscle Contraction）、心臟收縮調(diào)節(jié)（Regulation of Heart contraction）相關(guān)。CC主要與陽(yáng)離子復(fù)雜通道（Cation Channel Complex）、收縮纖維（Contractile Fiber）、肌節(jié)（Sarcomere）、收縮纖維部分（Contractile Fiber Part）、肌原纖維（Myofibril）等通路相關(guān)。MF與電壓門(mén)控離子通道活性（Voltage-gated Ion Channel Activity）、電壓門(mén)控通道活動(dòng)（Voltage-gated Channel Activity）、離子通道綁定（Ion Channel Binding）、頻道活動(dòng)（Channel Activity）、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（Passive Transmembrane Transporter Activity）相關(guān)。

炙甘草湯治療心律失常主要富集的KEGG生物學(xué)通路有44條，其與心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)（Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes）、肥厚型心肌?。℉ypertrophic Cardiomyopathy）、cGMP-PKG信號(hào)通路（cGMP-PKG Signaling Pathway）、擴(kuò)張型心肌?。―ilated Cardiomyopathy）等疾病相關(guān)。

對(duì)其結(jié)果進(jìn)行可視化處理。見(jiàn)表2和圖7。條形圖X軸長(zhǎng)度代表富集的基因數(shù)目，Y軸代表名稱，條形圖顏色代表富集程度;氣泡圖顏色代表富集程度，即P值大小;氣泡大小代表富集的基因數(shù)目。

2.7 分子對(duì)接 從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1的蛋白結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Pymol軟件移除配體和水分子，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有搜索到CAV3，故未做分析;從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Fumarine、Gamma-Aminobutyric Acid、Licoagrocarpin、Lysine、Stigmasterin的小分子結(jié)構(gòu)sdf文件，利用OpenBabel軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2格式，將靶點(diǎn)蛋白及化合物分子運(yùn)用swissdock進(jìn)行在線分子對(duì)接。

結(jié)果顯示：對(duì)接得分均≤-5.0 kcal/mol（1 cal=4.184 J），炙甘草湯與預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)有較好的結(jié)合，其結(jié)合能絕對(duì)值前2名分別為：SCN5A與Lysine、KCNH2與Gamma-Aminobutyric Acid，其結(jié)合能絕對(duì)值均大于8，說(shuō)明其擁有較強(qiáng)的結(jié)合能力。分子對(duì)接分?jǐn)?shù)見(jiàn)表3，分子對(duì)接見(jiàn)圖8～9。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出炙甘草湯有效活性成分及靶點(diǎn)，系統(tǒng)研究了炙甘草湯對(duì)心律失常的干預(yù)作用及作用機(jī)制。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1、TNNI3。SCN5A與心肌動(dòng)作電位的形成相關(guān)，其為心臟鈉離子通道同型異構(gòu)體Nav1.5通道蛋白的基因，該基因與長(zhǎng)QT綜合征、病態(tài)竇房結(jié)綜合征等發(fā)病相關(guān)[9-11]。CAV3具有調(diào)控心血管病發(fā)生發(fā)展的作用，如在膽固醇循環(huán)中，CAV能使膽固醇由包膜向內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)，從而起到抑制冠脈粥樣硬化的作用[12];當(dāng)CAV3高表達(dá)時(shí)，會(huì)破壞心肌的結(jié)構(gòu)與功能，從而引起心肌纖維化。KCNH2對(duì)平滑肌細(xì)胞興奮性調(diào)節(jié)具有重要作用，其突變可能會(huì)導(dǎo)致鉀離子流外流，動(dòng)作電位時(shí)程和不應(yīng)期不均一性縮短，形成短QT間期和增加易損性[13-14]。TNNI3基因編碼cTnI蛋白，而cTnI是組成肌鈣蛋白的成分之一，是心肌組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，研究表明，TNNI3在心力衰竭、心肌肥大、缺血再灌注及心臟電傳導(dǎo)中發(fā)揮一定作用[15-16]。

通過(guò)拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)EGFR、HSPA8、NTRK1、ESR1、HSP90AA1。表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，當(dāng)其被激活時(shí)，其胞內(nèi)酪氨酸激酶功能域發(fā)揮活性，通過(guò)復(fù)雜的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)及信號(hào)傳遞，參與了體內(nèi)許多重要的細(xì)胞生物過(guò)程如生長(zhǎng)、分化、凋亡、黏附、遷移等[17]。研究顯示，EGFR激酶可能通過(guò)心肌例子通道的酪氨酸磷酸化參與心臟電生理的調(diào)控。雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）與雌激素結(jié)合，其結(jié)合物具有調(diào)節(jié)兩類活性物質(zhì)的生成和釋放的功能，如舒張血管物質(zhì)：內(nèi)皮依賴性舒張因子、依前列醇等;縮血管物質(zhì)：內(nèi)皮素、血管緊張素等;起到改善血管內(nèi)皮功能，抑制炎癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[18]。熱激蛋白（Heat Shock Protein，HSP）是在應(yīng)激情況下合成的蛋白。在保護(hù)心肺組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等免受內(nèi)外源性損傷中發(fā)揮巨大作用，并對(duì)炎癥反應(yīng)、腫瘤、自身免疫過(guò)程等具有重要的調(diào)控作用[19]。

分析對(duì)接結(jié)果顯示，INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1與炙甘草湯的物種核心化合物的對(duì)接能量均小于-5 kcal/mol，說(shuō)明炙甘草湯的活性化學(xué)成分可以和INS、KCNH2、SCN5A、CAV3、GJA1蛋白較穩(wěn)定地結(jié)合。對(duì)接能量最低為SCN5A與賴氨酸;KCNH2與γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA）;說(shuō)明炙甘草湯活性物質(zhì)可能與以上3種蛋白結(jié)合，在治療心律失常上發(fā)揮主要作用。

通過(guò)GO富集分析預(yù)測(cè)炙甘草湯對(duì)心律失常作用機(jī)制可能是與心臟收縮、心臟肌肉收縮、心的過(guò)程、橫紋肌收縮、心臟收縮調(diào)節(jié)、陽(yáng)離子復(fù)雜通道、收縮纖維、肌節(jié)、收縮纖維部分、肌原纖維、電壓門(mén)控離子通道活性、電壓門(mén)控通道活動(dòng)、離子通道綁定、頻道活動(dòng)、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等有關(guān)。通過(guò)KEGG分析預(yù)測(cè)出炙甘草湯治療心律失?？赡芘c心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)、肥厚型心肌病、cGMP-PKG信號(hào)通路、擴(kuò)張型心肌病等有關(guān)。本研究說(shuō)明炙甘草湯是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路來(lái)治療心律失常，通過(guò)研究其靶點(diǎn)及信號(hào)通路，今后可為開(kāi)展動(dòng)物或人體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

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（2020-10-27收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81774208）;湖南省教育廳創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2017K070）

作者簡(jiǎn)介：葉嘉豪（1996.08—），男，碩士研究生在讀，研究方向：心血管疾病證本質(zhì)與診治規(guī)律，E-mail：1062940906@qq.com

通信作者：胡志希（1962.12—），男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：心血管疾病證本質(zhì)與診治規(guī)律，E-mail：515800272@qq.com