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    銅藻褐藻聚糖硫酸酯的分離純化、結(jié)構(gòu)組成及保肝護(hù)肝作用

    2022-05-23 07:09:26卓丹琪張雪楠李雨晴劉詩萌任丹丹何云海汪秋寬
    關(guān)鍵詞:褐藻單糖聚糖

    卓丹琪,張雪楠,李雨晴,劉詩萌,任丹丹,2,何云海,2,汪秋寬,2*

    (1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023;2.國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心(大連),遼寧 大連 116023)

    銅藻Sargassumhorneri為馬尾藻屬海洋植物,別名柱囊馬尾藻、海柳麥、草茜、竹茜菜等[1]。銅藻是來自北太平洋西部地區(qū)的一種暖溫性海藻,在中國(guó)主要分布于浙江、福建、遼寧和廣東等沿海地區(qū)。銅藻富含藻膠、褐藻聚糖硫酸酯、纖維素、半纖維素和礦物質(zhì)等,具有較高的營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)價(jià)值[2],是構(gòu)成潮下帶海藻場(chǎng)的重要種類之一,也是海洋生物(貝類、魚類)的重要繁育藻場(chǎng)[3]。銅藻提取物不僅具有促進(jìn)骨質(zhì)形成及抑制骨吸收的功能,還具有抗輻射、抗過敏、抗菌等生物學(xué)活性。銅藻因其營(yíng)養(yǎng)豐富,許多研究者和相關(guān)企業(yè)將其開發(fā)成方便食品,如朱亞珠[4]研究制作了銅藻罐頭,在日本將銅藻通過加熱煮沸的方式食用和銷售[5]。還有研究者開始關(guān)注銅藻中的褐藻聚糖硫酸酯(fucoidan)。研究發(fā)現(xiàn),褐藻中的褐藻聚糖硫酸酯具有降血糖、抗凝血、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫和保肝護(hù)肝等多種生物活性[6],銅藻多糖能顯著抑制氧自由基的氧化作用,也可用于煙草保潤(rùn)或化妝品等領(lǐng)域[7]。

    目前,對(duì)銅藻研究主要集中在資源調(diào)查及其形態(tài)學(xué)、人工繁殖等方面,而對(duì)其開發(fā)利用的研究尚處于初級(jí)階段[8-9]。許多學(xué)者開展了從馬尾藻屬分離的褐藻聚糖硫酸酯的抗氧化和抗腫瘤活性研究[10-11],但對(duì)其生物活性研究較少。因此,開展銅藻褐藻多糖生物活性的研究對(duì)其開發(fā)利用具有重要意義。本研究中,以銅藻為原料提取分離褐藻聚糖硫酸酯粗多糖,通過陰離子交換柱進(jìn)行分離純化,對(duì)粗品及各純化組分的單糖組成及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,并通過建立動(dòng)物模型,進(jìn)行了各組分的保肝護(hù)肝作用的小鼠灌胃試驗(yàn),以期為銅藻的高效綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    原料:銅藻褐藻聚糖硫酸酯粗品采用酶解結(jié)合的熱水浸提法提取,由大連海洋大學(xué)國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提供。

    試驗(yàn)動(dòng)物:180只SPF級(jí)BALA/C小鼠(體質(zhì)量20.0 g±2.0 g),由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK-2013-0006)。

    試劑:DEAE-Sepharose Fast Flow 為 Pharmacia 進(jìn)口分裝;標(biāo)準(zhǔn)糖購(gòu)于Sigma公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;聯(lián)苯雙脂購(gòu)自北京協(xié)和藥廠;其他試劑均為分析純。

    儀器設(shè)備:主要有安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)和 Nicolet-470型紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 銅藻褐藻聚糖硫酸酯的分離純化 準(zhǔn)確稱量銅藻褐藻聚糖硫酸酯粗品(TF)0.4 g,將其溶解于20 mL濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中,采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱對(duì)粗品TF進(jìn)行分離純化,分別用濃度為0~2.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,利用自動(dòng)收集器對(duì)其純化后的組分進(jìn)行收集,設(shè)定洗脫條件為0.75 mol/L,每管溶液3 mL。純化得到的4個(gè)組分分別記為TF1、TF2、TF3和TF4,用苯酚-硫酸法測(cè)定其總糖含量,以洗脫體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線,然后對(duì)其進(jìn)行反復(fù)收集、透析、冷凍干燥,密封保存,并計(jì)算各組分的回收率。通過明膠-BaCl2法測(cè)定各組分的硫酸根含量。

    1.2.2 高效液相色譜法測(cè)定單糖組成 樣品水解:分別稱取20 mg TF、TF1、TF2、TF3、TF4置于溶脹瓶中,加入1.5 mL超純水溶脹過夜,再加入1.5 mL TFA溶液,放入105 ℃烘箱中水解6 h后,4 ℃下放置12 h,用4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)水解液pH至中性,取上清液避光保存?zhèn)溆?。采用PMP甲醇溶液進(jìn)行衍生,然后用0.45 μm的水系膜進(jìn)行過濾,再用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分析。

    色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C-18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫為30 ℃,流速為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm,進(jìn)樣體積為20 μL;流動(dòng)相A為15%乙腈(體積分?jǐn)?shù))+50 mmol/L KH2PO4(pH 6.0),流動(dòng)相B為40%乙腈(體積分?jǐn)?shù))+50 mmol/L KH2PO4(pH 6.0);流動(dòng)相梯度洗脫流程為 0 min 100%A→10 min 85%A→55 min 50%A→65 min 100%A。

    1.2.3 傅里葉紅外光譜分析 準(zhǔn)確稱量2 mg TF、TF1、TF2、TF3、TF4,加入溴化鉀后壓制成透明均勻的薄片。使用Nicolet型紅外光譜儀掃描4 000~400 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收值。

    1.2.4 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)作用試驗(yàn) 將180只SPF級(jí)BALA/C小鼠隨機(jī)分成18組,每組10只。連續(xù)10 d給小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料,空白對(duì)照組、模型組、陽性組,以及銅藻褐藻聚糖硫酸酯各組分低、中、高劑量組的小鼠每天按表1設(shè)定的劑量進(jìn)行灌胃,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃結(jié)束后 2 h,空白對(duì)照組腹腔注射植物油,其余每組均按 10 mL/kg(體質(zhì)量)腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)為0.2% CCl4的植物油溶液。禁食24 h后,摘除眼球取血,靜置0.5 h,以3 000 r/min離心15 min,取上清液即為血清樣本。之后快速處死小鼠,解剖取出肝臟,固定在體積分?jǐn)?shù)為10%中性福爾馬林溶液中。在肝左葉組織取約0.3 g,放入冰冷的生理鹽水中漂洗,濾紙拭干,用組織勻漿器制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝組織勻漿即為肝組織樣本。

    表1 動(dòng)物分組及飼喂劑量

    用試劑盒測(cè)定小鼠血清中的TNF-α、ALT、AST活力,以及肝組織中的MDA含量、GSH-Px、SOD活力。

    1.2.5 肝組織切片觀察 取出固定在福爾馬林溶液中的肝組織,選出具有代表性的肝臟組織,切下相同位置和大小的組織,用石蠟包埋切片,用蘇木精-伊紅(H.E)染色,于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05,極顯著性水平設(shè)為0.01。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 銅藻褐藻聚糖硫酸酯的分離純化

    銅藻褐藻聚糖硫酸酯粗品經(jīng)陰離子交換柱分離純化,得到4個(gè)純化組分TF1、TF2、TF3、TF4,其中TF1、TF2為流出峰,TF3、TF4為洗脫峰,且4個(gè)純化組分均無拖尾現(xiàn)象(圖1)。收集4個(gè)純化組分透析,然后冷凍干燥備用。4個(gè)純化組分的化學(xué)組成如表2所示,其中,TF2的總糖含量最高(37.97%),TF3中硫酸根含量最高(14.51%)。

    圖1 銅藻褐藻聚糖硫酸酯分離純化梯度洗脫曲線

    2.2 銅藻褐藻聚糖硫酸酯各組分的單糖組成分析

    單糖的相對(duì)量是通過HPLC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)單糖和測(cè)定單糖的PMP衍生物相對(duì)應(yīng)的摩爾吸光度值(mAU)來確定。TF及其4個(gè)純化組分的HPLC分析及單糖組成如圖2、表2所示。從圖2和表2可見:銅藻TF主要由巖藻糖(Fuc)、葡萄糖(Glu)、甘露糖(Man)和半乳糖(Gal)組成,其中,巖藻糖含量最高(30.81%),其次為Glu、Man、Gal(分別為29.91%、15.05%、13.68%);4個(gè)純化組分的單糖組成含量差異較大,TF1中Man含量最高(73.23%),其次為Fuc含量(18.94%),TF2中Fuc含量最高(33.17%),其次為Gal含量(28.30%),TF3中Fuc含量最高(32.74%),其次為Glu含量(7.48%),TF4中Fuc含量最高(41.95%),其次為Gal、Man(分別為27.96%、12.94%)。TF單糖組成的HPLC色譜圖(圖2(a))顯示,甘露糖左右兩側(cè)分別出現(xiàn)兩個(gè)未知峰,這兩個(gè)未知峰可能是甘露糖的同分異構(gòu)體。

    圖2 銅藻褐藻聚糖硫酸酯及其分離純化組分單糖組成的HPLC分析

    表2 褐藻聚糖硫酸酯各組分的理化性質(zhì)及其單糖組成

    2.3 銅藻褐藻聚糖硫酸酯各組分的紅外光譜分析

    銅藻褐藻聚糖硫酸酯及其分離純化組分的紅外光譜圖分析(圖3)顯示:在3 404~3 449 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰,應(yīng)為糖類共有O-H伸縮振動(dòng);在2 921~2 936 cm-1附近出現(xiàn)的振動(dòng)應(yīng)為C-H伸縮振動(dòng);在1 619~1 633 cm-1附近為酰胺基 N-H 變角震動(dòng);在1 250 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,為S=O(硫酸基)的吸收峰,證明粗品及純化的4個(gè)組分均含有硫酸基;在1 039 cm-1附近均有吸收峰,是由C-O-C中的C-O伸縮振動(dòng)和C-O-H變角振動(dòng)引起的吸收。TF、TF3、TF4圖譜中分別在827、819、830 cm-1處有吸收峰,說明是C-O-S伸縮振動(dòng),這表明TF、TF3、TF4的硫酸基主要連接于Fuc的C-2或C-3位置,TF1、TF2圖譜中分別在838、836 cm-1處也有C-O-S的伸縮振動(dòng),說明二者的硫酸基主要連接于Fuc的C-4位置。

    圖3 銅藻褐藻聚糖硫酸酯及其分離純化組分結(jié)構(gòu)的紅外光譜分析

    2.4 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠臟器指標(biāo)的影響

    從表3可見:與空白組相比,模型組的脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)極顯著升高(P<0.01);灌胃不同劑量的銅藻褐藻聚糖硫酸酯一周后,各組小鼠的脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)均較模型組有不同程度的降低,相較于模型組,灌胃褐藻聚糖硫酸酯各劑量的TF和TF3組分均能極顯著抑制小鼠脾臟指數(shù)的升高(P<0.01),不同劑量的各組分均能極顯著抑制肝臟指數(shù)的升高(除TF4中劑量組外)(P<0.01)。

    表3 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

    2.5 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠肝組織生化指標(biāo)的影響

    從表4可見:與空白組相比,模型組小鼠肝組織MDA含量極顯著升高(P<0.01),SOD、GSH-Px活力極顯著降低(P<0.01);相較于模型組,聯(lián)苯雙酯陽性組MDA含量極顯著降低(P<0.01),SOD和GSH-Px活力極顯著升高(P<0.01),說明肝損傷造模成功;相較于模型組,灌胃褐藻聚糖硫酸酯各組分均極顯著降低了MDA含量(P<0.01),顯著或極顯著提高了SOD和GSH-Px活力(除TF3低劑量組GSH-Px外)(P<0.05或P<0.01)。

    表4 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠肝臟組織MDA、SOD、GSH-Px活力的影響

    2.6 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠血清免疫指標(biāo)的影響

    從表5可見:與空白組相比,模型組小鼠血清TNF-α活力極顯著降低(P<0.01),而AST、ALT活力極顯著升高(P<0.01);相較于模型組,聯(lián)苯雙酯陽性藥物組AST、ALT活力極顯著降低(P<0.01),TNF-α活力極顯著升高(P<0.01),這進(jìn)一步說明肝損傷造模成功;相比于模型組,灌胃褐藻聚糖硫酸酯各組分均極顯著提高了TNF-α活力(除TF4低劑量組外,P<0.01),極顯著降低了AST、ALT活力(P<0.01)。

    表5 銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠血清免疫指標(biāo)的影響

    2.7 肝組織切片觀察

    在光鏡(×400)下,小鼠正常組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰(圖4A),肝細(xì)胞索狀排列規(guī)則,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)正常。而CCl4模型組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生腫脹現(xiàn)象(圖4 B),肝細(xì)胞索紊亂,細(xì)胞界限不清,有氣球樣變細(xì)胞,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,這說明小鼠肝臟受到損壞,表明造模成功。與模型組相比,TF、TF1、TF2、TF3、TF4低中高劑量組均不同程度降低了對(duì)肝組織的損傷(圖4D~R),肝細(xì)胞病變程度明顯減輕,TF1高劑量組少數(shù)區(qū)域明顯可見碎片狀壞死,壞死灶周邊可見少量雙核再生肝細(xì)胞。從組織切片觀察形態(tài)來看,銅藻褐藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠肝損傷具有顯著地保護(hù)作用。

    A為空白組;B為模型組;C為陽性組;D、E、F為TF低、中、高劑量組;G、H、I 為TF1低、中、高劑量組;J、K、L 為TF2低、中、高劑量組;M、N、O 為TF3低、中、高劑量組;P、Q、R 為TF4低、中、高劑量組。

    3 討論

    3.1 銅藻褐藻聚糖硫酸酯的分離純化

    本研究中,采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱,從銅藻褐藻聚糖硫酸酯粗品中分離純化得到4個(gè)組分TF1、TF2、TF3、TF4。張玉等[12]采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的CaCl2溶液提取銅藻粗多糖,經(jīng)由DEAE-Sephrose Fast Flow分離純化得到銅藻多糖4個(gè)組分SF1~SF4;陳曉曉[13]利用酶解法將銅藻多糖進(jìn)行修飾,并將酶解產(chǎn)物同樣用陰離子交換柱分離純化也得到4個(gè)組分。上述研究分離純化組分?jǐn)?shù)量均與本研究中結(jié)果一致。劉麗佳等[14]使用水提法、超聲法、酶解法優(yōu)化提取銅藻粗多糖,對(duì)銅藻粗多糖進(jìn)行分離純化得到3個(gè)組分;李偉[15]采用醇沉法得到銅藻粗多糖,通過陰離子交換柱層析與分子篩凝膠柱層析結(jié)合純化銅藻粗多糖,獲得2個(gè)主要組分。上述研究分離純化組分?jǐn)?shù)量與本研究結(jié)果有一定差異,可能是粗多糖提取方法不同,導(dǎo)致分離結(jié)果不同。

    3.2 銅藻褐藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)組成特征

    本研究表明,銅藻粗多糖及3個(gè)純化組分TF2、TF3、TF4中單糖組成主要是巖藻糖,而TF1中單糖組成主要為甘露糖。Su等[16]研究表明,裙帶菜孢子葉多糖的單糖組成主要是巖藻糖、半乳糖和少量的其他單糖;孫啟立[17]通過水提醇沉法得到亨氏馬尾藻粗多糖,利用離子交換柱層析得到均一多糖后,其單糖以巖藻糖和半乳糖為主,上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符。本研究中紅外光譜分析表明,銅藻粗多糖及純化的4個(gè)組分在1 250 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,證明均含有硫酸基,這與分離各組分的理化性質(zhì)相對(duì)應(yīng),且純化組分TF1、TF2的硫酸基主要連接于巖藻糖的C4位置,TF3、TF4的硫酸基主要連接于巖藻糖的C2或C3位置,這與劉舒[18]、張海霞等[19]對(duì)馬尾藻褐藻聚糖硫酸酯單糖組成及紅外光譜分析結(jié)果較為一致。

    3.3 銅藻褐藻聚糖硫酸酯的保肝護(hù)肝作用

    肝臟是肌體中至關(guān)重要的器官之一,在體內(nèi)具有儲(chǔ)存肝糖、分泌蛋白等功能。脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)與淋巴細(xì)胞的增殖程度有關(guān),脾臟指數(shù)與肝臟指數(shù)增強(qiáng),說明淋巴細(xì)胞增殖程度增強(qiáng),免疫調(diào)節(jié)功能全面提升。本試驗(yàn)結(jié)果表明,模型組脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)顯著增大,這表明肝損傷模型造模成功,解剖時(shí)可明顯觀察到肝臟組織腫大且顏色加深,表明肝臟組織受到損傷,這與蒙田秀等[20]研究的試驗(yàn)現(xiàn)象一致。

    MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,這是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平的重要指標(biāo)。SOD是清除氧自由基的主要酶系之一,GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解酶,其具有保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用,SOD和GSH-Px活力水平反映了機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[21]。本研究中,小鼠試驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組相比,褐藻聚糖硫酸酯各組MDA含量、AST、ALT的活力均顯著降低,且SOD、GSH-Px、TNF-α活力顯著提高。由此可見,主要存在于細(xì)胞漿中的ALT和細(xì)胞漿線粒體中的AST,當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí),ALT首先進(jìn)入血液中,當(dāng)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷危及線粒體時(shí),AST也會(huì)進(jìn)入血液中[22],從而阻止血清中ALT、AST的釋放,對(duì)肝損傷起到了良好的保護(hù)作用。Madkourf等[23]研究發(fā)現(xiàn),馬尾藻乙醇提取物能顯著抑制肝炎大鼠血清ALT、AST、ALP和膽紅素水平的升高,證明馬尾藻的乙醇提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有潛在的保肝作用。Chale-dzul等[24]研究發(fā)現(xiàn),馬尾藻提取物褐藻聚糖硫酸酯對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠毒性肝臟具有保護(hù)作用,馬尾藻提取物可顯著抑制大鼠血清中MDA、ALT、AST活力的升高,對(duì)總蛋白(TP)影響較小。二者研究的馬尾藻與本研究中銅藻均為同一個(gè)屬且研究結(jié)果一致,本研究中銅藻褐藻聚糖硫酸酯各劑量均能提高小鼠SOD、GSH-Px、TNF-α活力,能抑制小鼠MDA、ALT、AST活力,對(duì)CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有一定保護(hù)作用。任丹丹等[25]研究表明,海帶褐藻聚糖硫酸酯各劑量均能抑制肝損傷小鼠血清ALT、AST活性,且顯著提高肝組織中SOD活力,降低MDA的含量,海帶中褐藻聚糖硫酸酯對(duì)CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。Kang等[26]研究發(fā)現(xiàn),裙帶菜孢子葉和海帶提取的褐藻聚糖硫酸酯均可抑制MDA水平的升高,恢復(fù)CCl4損傷大鼠的SOD、過氧化氫酶(CAT),這表明,從裙帶菜孢子葉和海帶提取的褐藻聚糖硫酸酯具有抗CCl4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的抗氧化性能。研究結(jié)果證明,銅藻提取的Fucoidan同樣具有保肝作用。

    4 結(jié)論

    1)從銅藻褐藻聚糖硫酸酯粗品分離獲得4個(gè)組分,分別為TF1、TF2、TF3、TF4,其總糖含量分別為30.97%、32.26%、37.97%、35.97%和37.04%,硫酸基團(tuán)含量分別為10.62%、9.62%、11.51%、14.51%和13.62%,其單糖主要由巖藻糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成,但各純化組分的單糖組成含量差異較大。

    2)銅藻褐藻聚糖硫酸酯粗品及各純化組分均能提高小鼠肝臟或血清SOD、GSH-Px、TNF-α活性,抑制小鼠MDA、ALT、AST活性,具有顯著的抗氧化和抑制肝損傷作用,這表明銅藻中褐藻聚糖硫酸酯具有顯著的保肝護(hù)肝作用。

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