納木錯裸鯉染色體組的構成及倍性分析

山谷，郭文軒，李信，周子昱，馬可馨，肖世俊，周賀*，劉海平

(1.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023；2.嘉興市經(jīng)濟菌物新種質資源創(chuàng)制重點實驗室，浙江 嘉興 314000；3.西藏自治區(qū)農牧科學院 水產(chǎn)科學研究所，西藏 拉薩 850000)

納木錯裸鯉Gymnocyprisnamensis隸屬于鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae裂腹魚亞科Schizothoracinae納木錯裸鯉屬Gymnocypris，僅分布于中國海拔4 718 m的西藏納木錯湖及入湖河流各支流中，是納木錯湖內唯一的經(jīng)濟魚類[1]，被稱為中國海拔最高的高原裂腹魚，其對高原惡劣環(huán)境的適應能力較強。在中國脊椎動物紅色名錄中納木錯裸鯉被列為近危(NT)物種[2]。

西藏土著魚類主要由3大類群組成,包括鯉形目鯉科裂腹魚亞科、鰍科條鰍亞科和鯰形目鮡科[3]。據(jù)統(tǒng)計，世界上裂腹魚類有12屬100余種，但部分種類存在同物異名的情況，中國約產(chǎn)11屬76種[4]，主要分布在青藏高原及其周邊水域。西藏裂腹魚亞科魚類存在染色體多態(tài)性這一現(xiàn)象[5]，不僅表現(xiàn)在染色體數(shù)目多樣性，而且還表現(xiàn)在染色體倍性多樣性[6-9]。已有學者發(fā)現(xiàn)，尖裸鯉Oxygyrnnocyprisstewartii存在同種不同個體間的染色體差異，拉薩裂腹魚Schizothoraxwaltoni和異齒裂腹魚Shizothoraxoconnori也存在不同地區(qū)同種染色體的差異情況[5]。此外，已報道核型的22種裂腹魚亞科魚類大多數(shù)為多倍體類型，余祥勇等[10]推測，多倍體是高原裂腹魚亞科核型進化最主要的特征，裂腹魚亞科魚類可能具有共同的祖先。由此推測，高原裂腹魚亞科魚類為適應高原惡劣多變的地理環(huán)境，每個種或種間染色體數(shù)目及倍性發(fā)生了較大變化。因此，裂腹魚亞科魚類是研究多倍體魚類和高原適應性機制的重要材料。西藏裂腹魚亞科魚類染色體的多態(tài)性，更有利于其適應西藏地區(qū)惡劣多變的高原環(huán)境[11]，并成為青藏高原水域的優(yōu)勢魚種。

裂腹魚亞科魚類已經(jīng)確定核型的種類不足全部種類的1/3[12]。有關納木錯裸鯉染色體數(shù)目、核型及帶型等方面的研究尚未見報道。本研究中，采用吉姆薩(Giemsa)、銀染(Ag-NORs)和CMA3/DAPI雙重熒光染色方法對納木錯裸鯉的染色體數(shù)目、核型和帶型等進行分析，以確定納木錯裸鯉的染色體數(shù)目、核型和帶型特點，并對其倍性進行分析，以補充納木錯裸鯉細胞遺傳學方面研究的空白，并為后續(xù)開展裂腹魚亞科魚類分類和進化地位等相關研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用健康納木錯裸鯉雄魚3尾,取自中國西藏自治區(qū)納木錯湖，體長為31.1～36.1 cm，體質量為276.1～682.5 g(表1)，空運至大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院實驗室水族箱中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)溫度為(12±1)℃。

表1 納木錯裸鯉樣本規(guī)格

1.2 方法

1.2.1 腎細胞染色體標本的制備 采用兩次植物血球凝集素(PHA)[13]及一次秋水仙素腹腔注射進行樣品處理，注射劑量均為6 μg/g(魚體質量)，PHA兩次作用時間分別為18～20 h和4～6 h，秋水仙素作用時間為2～3 h。取出魚體完整腎臟，置于濃度為0.075 mol/L KCl低滲液中低滲45 min，用卡諾固定液(甲醇與冰醋酸的體積比為3∶1)固定3次，每次15 min，于-20 ℃冰箱中冷凍過夜。采用常規(guī)冷滴片法進行染色體標本制備，風干后用質量分數(shù)為10%的吉姆薩(Giemsa)染色液處理45 min，在普通光學顯微鏡(Leica DM2000)下鏡檢并拍照。

1.2.2 染色體數(shù)目統(tǒng)計及核型分析 從3尾納木錯裸鯉染色體中期分裂相中各選取30個分散良好、形態(tài)清晰完整的分裂相進行計數(shù)統(tǒng)計，以確定染色體數(shù)目。每尾魚分別選取5個染色體數(shù)目完整、形態(tài)清晰的分裂相，參照Levan等[14]提出的標準進行核型分析。

1.2.3 銀染(Ag-NORs) 采用Howell等[15]的快速銀染法。將納木錯裸鯉腎細胞染色體載玻片置于已預熱至65 ℃的加熱器平面上，取100 μL質量分數(shù)為50%的硝酸銀溶液與50 μL質量分數(shù)為2%的明膠溶液混勻后，均勻滴到染色體載玻片上，蓋上蓋玻片及遮光盒，黑暗條件下處理1～2 min，至染色體被染成金黃色，用超純水(65 ℃)沖洗載玻片后，風干、封片，在普通光學顯微鏡(Leica DM2000)下鏡檢并拍照。

1.2.4 CMA3/DAPI雙重熒光染色 參照Schweizer等[16-17]和Amoyes等[18]的方法并稍加修改。將納木錯裸鯉腎細胞染色體用0.5 mg/mL CMA3染色60 min，再用0.1 mg/mL DAPI染色15 min。每次染色后均用MI緩沖液(pH 7.0)漂洗2 次，用甘油和MI緩沖液(pH 7.0)的混合液(二者體積比為1∶1)處理后封片，于4 ℃冰箱保存并水平放置，一周內在熒光顯微鏡(Leica DM2000)下觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 腎細胞的染色體數(shù)目及核型分析

從3尾納木錯裸鯉腎細胞中期分裂相中各選取30個形態(tài)清晰完整、分散良好的分裂相進行統(tǒng)計。從表2可見：納木錯裸鯉染色體數(shù)目為84～94條，1號個體中92條染色體中期分裂相占比70%，2號個體中92條染色體中期分裂相占比73%，3號個體中92條染色體中期分裂相占比67%；3尾魚合計有90個染色體中期分裂相，染色體數(shù)目為92條的分裂相占比70%。因此，納木錯裸鯉染色體數(shù)目為92條，且3個個體間染色體眾數(shù)一致。

表2 納木錯裸鯉不同個體染色體數(shù)目統(tǒng)計

從3尾納木錯裸鯉中選取染色體數(shù)目完整、形態(tài)良好的5個中期分裂相，測量每條染色體的臂長(長臂及短臂)，計算染色體相對長度及臂比，結果如表3所示。根據(jù)Levan等[14]提出的標準，確定染色體類型并進行配對。結果顯示，中部著絲點染色體(M)共計40條，亞中部著絲點(SM)染色體共計20條，端部著絲點染色體(T)共計32條，其臂數(shù)為152。納木錯裸鯉核型公式為40m+20sm+32t，NF=152(圖1)。

圖1 基于Giemsa染色的納木錯裸鯉染色體中期分裂相及核型

表3 納木錯裸鯉的染色體核型數(shù)據(jù)

2.2 腎細胞的Ag-NORs分析

銀染點數(shù)目在間期核和染色體中期分裂相中均表現(xiàn)出多態(tài)性。觀察統(tǒng)計100個納木錯裸鯉腎細胞銀染間期核，呈現(xiàn)出的銀染點數(shù)目為1～4個(圖2)，含有2個銀染點的頻率最高(46%)(表4)，并能清晰地觀察到最多4個銀染點。觀察統(tǒng)計30個銀染位點清晰、染色體數(shù)目完整的中期分裂相，呈現(xiàn)出銀染點的數(shù)目為1～4個，含有2個銀染點的頻率最高(47%)(表4)，并能夠清晰地觀察到最多4個銀染點(圖3(a))。核型分析顯示，銀染點位于亞中部著絲粒染色體(SM2)短臂的端部區(qū)域(圖3(b))。這表明，納木錯裸鯉是含有4套染色體的遺傳四倍體。

圖2 納木錯裸鯉間期核的硝酸銀染色

圖3 基于Ag-NORs染色的納木錯裸鯉染色體中期分裂相及核型(箭頭示銀染點)

表4 納木錯裸鯉中期分裂相銀染點頻率及間期核中核仁頻率

2.3 腎細胞的CMA3/DAPI分析

使用經(jīng)CMA3/DAPI雙重熒光染色處理過的納木錯裸鯉染色體標本制片，置于Leica DM2000熒光顯微鏡下拍照。當用U激發(fā)(藍光λ=360～400 nm)時，在納木錯裸鯉熒光帶型中可觀察到4個淡染的DAPI熒光帶(圖4(a))；當用B激發(fā)(藍光λ=440～480 nm)時，在納木錯裸鯉分裂相中顯示有4個明亮的CMA3熒光帶(圖4(b))，經(jīng)核型分析可知，CMA3陽性位點位于亞中部著絲粒染色體(SM2)短臂的端部區(qū)域(圖4(c))，與銀染點的位置相同,為核仁組織區(qū)(NORs)。這表明，納木錯裸鯉是含有4套染色體的遺傳四倍體。

圖4 基于CMA3/DAPI染色的納木錯裸鯉染色體中期分裂相及核型(箭頭示陽性部位)

3 討論

3.1 染色體數(shù)目及核型

染色體多態(tài)性不僅表現(xiàn)在不同類群、種屬間存在明顯的差異，如鮡科魚類染色體數(shù)目為2n=48，鰍科高原鰍類染色體數(shù)目為2n=50[19]，還表現(xiàn)在同種間不同居群間存在明顯的差異，如洞庭湖大鰭鳠Mystusmacropterus染色體數(shù)目為2n=60，核型公式為20m+12sm+16st+12t，NF=92[20]，嘉陵江大鰭鳠染色體數(shù)目為2n=56，核型公式為20m+16sm+10st+10t，NF=92[21]。已有學者研究發(fā)現(xiàn)，拉薩裂腹魚和異齒裂腹魚等西藏地區(qū)裂腹魚亞科魚類存在同種間不同居群染色體數(shù)目差異的情況[5,10]，尖裸鯉存在同種間不同個體染色體為2n=86[5]和2n=92[10]兩種現(xiàn)象。這一特點體現(xiàn)了西藏裂腹魚亞科魚類染色體的多態(tài)性，也體現(xiàn)出高原裂腹魚亞科魚類具有較強的生命進化和適應高原惡劣環(huán)境的能力[22-23]。武云飛等[5]推測,西藏裂腹魚亞科魚類染色體多態(tài)性的特點，可能與青藏高原地區(qū)曾經(jīng)的地質大變動導致的氣溫驟變、高原氣候惡劣，以及各地海拔上升變化明顯等不穩(wěn)定環(huán)境因素有關。裂腹魚亞科魚類分布較為集中，青藏高原及周邊水域是裂腹魚亞科魚類的主要生活區(qū)域，其中，許多裂腹魚亞科魚類僅存在于西藏地區(qū)，是西藏地區(qū)特有魚種[24-25]，具有地區(qū)代表性及進化特點，其染色體多樣性在自然界中構成十分獨特的系統(tǒng)，具有重要研究意義。但目前西藏裂腹魚亞科魚類染色體的研究相對滯后，70%的裂腹魚亞科魚類核型尚未見報道。

納木錯裸鯉是西藏地區(qū)的特有魚種[1]，但較長時間內對其缺乏系統(tǒng)的生物學研究，在染色體組成方面尚未有報道。本研究結果表明，納木錯裸鯉染色體總數(shù)為92條，核型公式為40m+20sm+32t，NF=152，且不同個體間染色體數(shù)目及核型相同。納木錯裸鯉的染色體數(shù)目與已報道的青藏高原裂腹魚亞科魚類染色體數(shù)目超過1/3均為92條的研究結果一致[12]，與異齒裂腹魚[8]、拉薩裂腹魚[8]和尖裸鯉[5]等裂腹魚亞科魚類染色體數(shù)目相同，均為92條。納木錯裸鯉數(shù)目及核型的確定為探究納木錯裸鯉與其他西藏裂腹魚亞科魚類的親緣關系，以及西藏裂腹魚亞科魚類的演化和起源奠定了良好的基礎。

3.2 倍性分析

目前，已報道的22種裂腹魚亞科魚類染色體的組成表明，裂腹魚亞科魚類的進化方式以多倍體化為主且多數(shù)為四倍體[12]。如花斑裸鯉Gymnocypriseckloni、異齒裂腹魚和尖裸鯉等裂腹魚亞科魚類均為四倍體[10]，昆明裂腹魚Shizothoraxgrahami和大理裂腹魚Shizothoraxdaliensis均為六倍體[8]。余祥勇等[10]對8種裂腹魚亞科魚類的染色體核型特征、NF值、紅細胞核大小和核DNA含量進行比較，確認其中4種西藏裂腹魚亞科魚類為四倍體且染色體變化明顯。裂腹魚亞科魚類的進化特點與鲃亞科相似[26]。根據(jù)化石及考古地質學研究，青藏高原未形成前氣候溫暖，隨著青藏高原隆起，氣溫驟降，大部分喜暖的原始裂腹魚被淘汰，少數(shù)適應高原環(huán)境的魚活了下來[27]。余祥勇等[10]推測，青藏高原環(huán)境變化過程中，在核型演化上很可能主要表現(xiàn)在多倍化，推測青藏高原地區(qū)裂腹魚亞科魚類可能是多倍體起源的。

NORs特征是研究物種間染色體變異、物種進化和親緣關系的重要參考依據(jù)[28]。銀染法是指核仁組織區(qū)(NORs)的酸性蛋白成分被硝酸銀特異地染成黑色的方法。但如果NORs失活將不能染上色，而CMA3染色是指核仁組織區(qū)的rDNA被染色，rDNA并不是酸性蛋白成分，因此，NORs的活性不影響CMA3染色結果。這兩種方法均已在生物領域廣泛應用。本研究中，采用不同方法對納木錯裸鯉腎細胞染色體進行帶型分析，發(fā)現(xiàn)染色體經(jīng)銀染及CMA3/DAPI雙重染色后最多具有4個信號位點，CMA3陽性部位和位點數(shù)目與銀染點位置和數(shù)目相同，均位于亞中部著絲粒染色體短臂的端部區(qū)域，證明納木錯裸鯉是含有4套染色體組的遺傳四倍體，這與余祥勇等[10]推測的染色體總數(shù)為90～100條的西藏裂腹魚亞科魚類均為多倍體的觀點一致，且染色體數(shù)目為92條的西藏裂腹魚亞科魚類均為四倍體，進而推測西藏裂腹魚亞科魚類可能具有共同的祖先，在適應青藏高原惡劣多變的生態(tài)環(huán)境過程中，發(fā)生了多倍化[29]。這可能與染色體的著絲點斷裂、融合、缺失和易位等情況相關[30]。

綜上所述，本研究中確認了納木錯裸鯉染色體數(shù)目為92條，核型公式為40m+20sm+32t，NF=152，且未發(fā)現(xiàn)有同種不同個體間染色體數(shù)目的多樣性現(xiàn)象。同時，通過Ag-NORs和CMA3/DAPI雙重熒光染色對其倍性進行分析，確定了納木錯裸鯉為含有4套染色體組的遺傳四倍體。本研究結果為納木錯裸鯉的染色體組成提供了細胞遺傳學證據(jù)，并為今后開展西藏裂腹魚亞科魚類的分類和演化關系研究提供了科學依據(jù)。

4 結論

1)確定了納木錯裸鯉的染色體數(shù)目為4n=92，染色體核型公式為40m+20sm+32t，NF=152,與已報道的青藏高原裂腹魚亞科魚類染色體數(shù)目超過1/3均為92條的研究結果一致。

2)納木錯裸鯉是含有4套染色體組的遺傳四倍體，符合裂腹魚亞科的進化方式以多倍化為主且染色體總數(shù)為90～100條的西藏裂腹魚亞科魚類均為多倍體的推測。