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    酶聯(lián)免疫吸附法和免疫親和柱-高效液相色譜法在檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量中的比對(duì)研究

    2022-05-23 10:33:02段春宇
    中國(guó)動(dòng)物保健 2022年5期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜法飼料

    段春宇

    摘要: 為了探討酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性,試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)比對(duì)免疫親和柱-高效液相色譜法(IAC-HPLC法),對(duì)飼料中黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、精密度和樣品加標(biāo)回收率進(jìn)行了分析。ELISA法線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9952,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%~8.1%,平均加標(biāo)回收率為105.6%~111.8%。結(jié)果表明,ELISA法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好;且ELISA法檢測(cè)結(jié)果與IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.4%~19.2%,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的偏差可以接受,表明ELISA法能滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

    關(guān)鍵詞:酶聯(lián)免疫吸附法;免疫親和柱-高效液相色譜法;飼料;黃曲霉毒素B1

    黃曲霉毒素,是黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,主要分為B、G類(lèi),其中黃曲霉毒素B1的含量最多,危害性最大,該毒素具有強(qiáng)致癌性、致畸性、致突變性。黃曲霉毒素B1可以侵害畜禽肝臟,導(dǎo)致肝臟變性、壞死等,進(jìn)而導(dǎo)致畜禽肺臟、腎臟、脾臟、胃、直腸等器官發(fā)生病變;導(dǎo)致畜禽的免疫力降低;導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,采食量降低、食物利用率低;母畜不育或產(chǎn)仔少等問(wèn)題。

    黃曲霉毒素B1主要污染糧食作物及其副產(chǎn)品,其中,花生和玉米及其副產(chǎn)品污染最為嚴(yán)重,幾乎無(wú)法避免,該毒素性質(zhì)穩(wěn)定,持續(xù)高壓滅菌2h僅能降低其25%~33%的毒力,而且只有在282℃的高溫下才能被裂解,所以世界各國(guó)都嚴(yán)格設(shè)定“限量標(biāo)準(zhǔn)”。黃曲霉毒素B1污染飼料主要源于原料污染、儲(chǔ)存條件不當(dāng)飼料霉變污染和加工過(guò)程污染。要預(yù)防黃曲霉毒素B1毒害畜禽,就要及時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定飼料原料及飼料成品中黃曲霉毒素B1含量,因而制定準(zhǔn)確實(shí)用的檢測(cè)方案至關(guān)重要,進(jìn)而加強(qiáng)原料的篩選、飼料的品控,更好的保護(hù)畜禽健康,發(fā)揮畜禽生產(chǎn)性能,將飼料價(jià)值充分發(fā)揮。

    飼料中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法較多,有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條等,本文采用免疫親和柱-高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)飼料原料和成品中黃曲霉毒素B1的含量,并通過(guò)比對(duì)分析,確定ELISA法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性。

    2 免疫親和柱-高效液相色譜法材料與方法

    2.1 試劑與耗材

    甲醇(色譜純,默克公司)、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)、黃曲霉毒素免疫親和柱(ROMER公司)、氯化鈉(分析純)、玻璃纖維濾紙等。

    2.2 主要儀器

    Agilent 1260高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器、光化學(xué)衍生器、高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、高速混勻器、固相萃取儀等。

    2.3 方法

    1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司),原液濃度為20μg/mL,用甲醇溶液逐級(jí)稀釋成100ng/mL的工作液。再用流動(dòng)相分別稀釋成0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    2)樣品前處理 試樣制備參照GB/T 20195—2006,用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)研磨后過(guò)1mm孔篩,混勻,儲(chǔ)存于封閉容器,避光低溫保存,待檢。稱(chēng)取50.0g待檢樣品于250mL具塞錐形瓶中,加入5g氯化鈉和125.0mL的甲醇水(70+30)溶液混勻,振蕩器200rpm/min震蕩30min,定量濾紙過(guò)濾后,準(zhǔn)確移取10.0mL濾液,加入20.0mL超純水稀釋混勻,玻璃纖維濾紙過(guò)濾,至濾液澄清,收集濾液于干凈離心管中做上樣液。

    將免疫親和柱連接于10.0mL的玻璃定量管下,取15.0mL上樣液,過(guò)免疫親和柱,流速1~2drop/s;待柱內(nèi)液體排干后,分別兩次用10.0mL超純水清洗柱子,流速2~3drop/s;待柱內(nèi)液體全部排干后,增大泵壓,抽干免疫親和柱內(nèi)液體,用1.0mL甲醇洗脫柱子,流速自然重力,直至2~3mL空氣通過(guò)柱子,收集全部洗脫液于玻璃定量管中,加超純水定容為2.0mL。定容后的洗脫液用0.22μm的有機(jī)微孔過(guò)濾器過(guò)濾到樣品瓶中,待檢。

    3)色譜條件 色譜柱:Agilent C18色譜柱(規(guī)格:150×4.6mm,粒度5μm);流動(dòng)相:超純水+甲醇+乙腈(60+20+20)等度洗脫;流速:1.0mL/min;FLD波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)360nm,發(fā)射波長(zhǎng)440nm;柱溫40℃;進(jìn)樣量:50μL。

    采用外標(biāo)法,根據(jù)樣品峰保留時(shí)間進(jìn)行定性,峰面積進(jìn)行定量分析。

    3 酶聯(lián)免疫吸附法材料與方法

    3.1 試劑與耗材

    黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒(ROMER公司)、超純水、針式過(guò)濾器。

    3.2 主要儀器

    酶標(biāo)測(cè)定儀:內(nèi)置450nm濾光片、回旋振蕩器、渦旋振蕩器、微量移液器等。

    3.3 方法

    1)樣品前處理 稱(chēng)取20.0g樣品于250mL具塞錐形瓶中,加入100.0mL甲醇水(70+30)溶液提取,置于回旋振蕩器上震蕩萃取3min,靜置樣品,定性濾紙過(guò)濾。用1mol/L的NaOH和HCl微調(diào)濾液pH 6~8,如果樣品酸性比較強(qiáng),可以使用高濃度的酸堿進(jìn)行調(diào)節(jié),盡量減少酸堿的用量。用試劑盒提供分析緩沖液1:1稀釋濾液,于1mL離心管中,用渦旋振蕩器混勻,待測(cè)。

    2)試劑盒操作過(guò)程 實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20~25℃,從冰箱中拿出試劑盒,取出試劑盒中所有試劑回溫2~3h;用八道移液器取(綠色瓶蓋)酶聯(lián)偶合物200μL,放入綠色預(yù)混合板中;單道移液器分別取100μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,放入以上預(yù)混合板中,用八道移液器混合四次(注意溶液不要溢出,防止各孔污染);將孔板進(jìn)行編號(hào),以便記錄標(biāo)準(zhǔn)品、樣品位置,用八道移液器將上述混合液100μL轉(zhuǎn)移至抗體包被的孔中,室溫避光孵育15min,轉(zhuǎn)移過(guò)程中不要有氣泡;蒸餾水清洗4次拍干(清洗時(shí)各孔不要相互污染),用洗瓶沖洗時(shí),不要直接沖洗孔,側(cè)著清洗,防止底部的物質(zhì)沖出,清洗后輕甩一下,在吸水紙上快速拍干孔板,不要大幅度用手甩板,孔板中沒(méi)有液滴即可;拍干后,用八道移液器每孔加入(藍(lán)色瓶蓋)底物100μL;室溫光孵育5min;時(shí)間到后,用八道移液器每孔加入(紅色瓶蓋)終止液100μL,輕輕搖勻后檢測(cè);將孔板轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀450nm(帶630nm示差波長(zhǎng))讀取每孔的吸光度值。

    4 結(jié)果與分析

    4.1 結(jié)果

    本研究選用空白玉米進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),樣品名稱(chēng)加標(biāo)1、加標(biāo)2和加標(biāo)3,黃曲霉毒素B1添加濃度分別為10.0、20.0和50.0μg/kg,選取花生粕、玉米胚芽粕、奶牛配合飼料樣品各一個(gè),分別用IAC-HPLC法和ELISA法各重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

    1)免疫親和柱-高效液相色譜法的工作曲線、準(zhǔn)確度、精密度 標(biāo)準(zhǔn)系列經(jīng)上機(jī)檢測(cè),以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),得到黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(Y)的線性方程Y=10.00282X-1.71180,相關(guān)系數(shù)為0.99976,表明在0.10 ~50.0ng/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。加標(biāo)回收試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)是驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度和精密度的重要手段。按上述IAC-HPLC法試驗(yàn)方法,測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。本結(jié)果的平均加標(biāo)回收率為93.0%~99.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%~4.8%。說(shuō)明此方法準(zhǔn)確度高,穩(wěn)定性好。黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖及待檢樣品色譜圖分別見(jiàn)圖1和圖2。

    2)酶聯(lián)免疫吸附法的準(zhǔn)確度、精密度 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)系列經(jīng)上機(jī)檢測(cè),在ROMER公司提供計(jì)算軟件上計(jì)算結(jié)果,線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9952,表明在0.10 ~50.0ng/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。按上述ELISA法試驗(yàn)方法,測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。本結(jié)果的平均加標(biāo)回收率為105.6%~111.8%,RSD為1.6%~8.1%。ELISA法的準(zhǔn)確度高,穩(wěn)定性可以接受。ELISA法檢測(cè)結(jié)果與IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果的RSD為5.4%~19.2%,兩種方法結(jié)果的偏差表明ELISA法準(zhǔn)確度可以接受。

    4.2 分析

    使用IAC-HPLC法和ELISA法分別對(duì)飼料樣品進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)表1數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出,IAC-HPLC法測(cè)值均小于ELISA法,IAC-HPLC法前處理過(guò)程需要過(guò)免疫親和柱,在過(guò)柱過(guò)程中,黃曲霉毒素B1沒(méi)有全部收回,有微量損失,從而導(dǎo)致整體檢出率偏低。ELISA法檢測(cè)結(jié)果與IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果的RSD為5.4%~19.2%,其中當(dāng)樣品中黃曲霉毒素B1含量≥10μg/kg時(shí),兩種方法結(jié)果的RSD為5.4%~9.0%,只有奶牛配合飼料黃曲霉毒素B1含量較低時(shí),兩種方法結(jié)果的RSD值偏差較大,分析原因一是IAC-HPLC方法在過(guò)柱過(guò)程中,黃曲霉毒素B1有損失對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大,二是ELISA法檢測(cè)低含量黃曲霉毒素B1時(shí),存在假陽(yáng)性的情況。而且隨著黃曲霉毒素B1濃度增加,兩種方法結(jié)果的重復(fù)性呈現(xiàn)良好趨勢(shì)。因此,ELISA法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量準(zhǔn)確度較高,可以用于飼料中黃曲霉毒素B1批量檢測(cè)。

    5 結(jié)論

    綜上所述,ELISA法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好,能夠滿(mǎn)足日常監(jiān)測(cè)的需求。與IAC-HPLC法相比,ELISA法不需要對(duì)樣品進(jìn)行免疫親合柱過(guò)柱等復(fù)雜的前處理,且ELISA法可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品,有效的提高了檢測(cè)效率,節(jié)省了檢測(cè)成本,可以作為日常批量監(jiān)測(cè)的首選方法。因IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果可靠性強(qiáng)、可以有效避免樣品檢測(cè)的假陽(yáng)性情況,因此,在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可以采用ELISA法對(duì)大批量飼料樣品中黃曲霉毒素B1進(jìn)行初篩快速測(cè)定,再采用IAC-HPLC法對(duì)疑似超標(biāo)陽(yáng)性樣品進(jìn)行定量確認(rèn)檢測(cè)。

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