口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)的建立

祁君 王麗

摘要：為提高偶蹄動物口蹄疫O型液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附（LPB-ELISA）免疫抗體檢測效率，優(yōu)化動物疫情監(jiān)測策略，提高動物疫病防控效能。結(jié)合基層一線對免疫質(zhì)量評價實際需求及財力人力等因素，在該試驗通用操作步驟基礎(chǔ)上，特對操作步驟及96孔ELISA板檢測樣品布局進行了技術(shù)改進。改進后的1塊ELISA板可檢測樣品80份，在檢測通量上較試劑盒使用說明書標明1塊ELISA板可檢測樣品10～20份增加到4～8倍，在ELISA板檢測樣品利用率上從10.42%～20.83%提高到83.33%，在檢測費用、檢測時效及人力成本上則可壓縮4～8倍。同時，亦可減少試驗廢棄物產(chǎn)生量，有一定的社會效益及生態(tài)效益。改進后的口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，適用于大樣本情況下以免疫抗體合格率為指標的免疫質(zhì)量評價工作，尤其對檢測數(shù)量多、經(jīng)費人員配置有限，且要求出結(jié)果快的基層一線，具有很好的現(xiàn)實操作性和借鑒性。

關(guān)鍵詞：口蹄疫;LPB-ELISA;免疫抗體;高通量;定性檢測

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動物急性、熱性、接觸性傳染病，對畜牧業(yè)健康發(fā)展危害巨大，該病被世界動物衛(wèi)生組織列入法定上報傳染病[1]。2005年5月—2017年1月，我國共發(fā)布了125次口蹄疫疫情，主要為O型和A型，口蹄疫防控形勢依然嚴峻[2]。目前，我國對口蹄疫采取強制免疫的防控政策，而提高免疫質(zhì)量無疑是對該病防控最有力的措施之一。LPB-ELISA試驗則是目前用于評價免疫質(zhì)量方面普遍采用的技術(shù)，但該試驗通用操作步驟較為繁瑣，尤其是被檢血清倍比稀釋次數(shù)多、ELISA板利用率低，在進行大量樣品檢測時，需要配備較多檢測人員及工作經(jīng)費，開展工作耗時費力。有研究者就基層實驗存在諸多不利的現(xiàn)實條件對獸醫(yī)血清學試驗方法進行了改進，今后如何在諸多不利條件下更加準確快速地開展血清學試驗，仍有不斷努力的空間[3]。本文在LPB-ELISA試驗通過操作技術(shù)基礎(chǔ)上，參照口蹄疫診斷技術(shù)標準（GB/T18935—2018），以定性需求為主要考量目的，合理設(shè)置被檢血清稀釋度（免疫抗體合格滴度），將被檢血清多步倍比稀釋步驟進行一步到位稀釋改進，并對ELISA板檢測布局進行了優(yōu)化，建立起了基于以免疫抗體合格率為評價指標的口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，為基層開展口蹄疫免疫抗體質(zhì)量評價提供一種高效、快速、經(jīng)濟的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

診斷試劑：10塊裝口蹄疫O型LPB-ELISA抗體檢測試劑盒（內(nèi)含：口蹄疫O型病毒抗原、口蹄疫O型豚鼠抗體工作液、兔抗豚鼠IgG-HRP工作液、口蹄疫O型陽性對照血清、口蹄疫陰性對照血清、25倍PBST濃縮液、終止液、TMB底物A溶液、TMB底物B溶液、兔抗包被ELISA板、U型96孔抗原抗體反應(yīng)板、移液槽、封板膜），由蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)，自制去離子水或蒸餾水;主要器材：酶標儀、洗板機、微量振蕩器、生化恒溫培養(yǎng)箱、冷藏柜、96孔血清稀釋板（加樣槽）、量筒（10、100、1，000mL等不同規(guī)格）、微量可調(diào)移液器（5、10、50、100、200、300、1，000μL等不同規(guī)格）、吸水紙巾、錫紙;被檢樣品：偶蹄動物血清。

1.2? 方法

1）試劑準備。稀釋PBST濃縮液：將25倍PBST濃縮液用去離子水或蒸餾水稀釋成1倍PBST（1份濃縮液加24份去離子水或蒸餾水進行稀釋），用于洗板或稀釋血清和病毒抗原。

2）試驗程序。①稀釋被檢血清：被檢血清稀釋布局如圖1所示，在96孔血清稀釋板第1～10列每孔各加315μL的1倍PBST，每孔再各加5μL的被檢血清后混勻，此時每孔被檢血清的稀釋度為1：64。

②平移稀釋后的被檢血清并稀釋陰陽性對照血清。將稀釋度為1：64的被檢血清以50μL/孔的量，從96孔血清稀釋板按次序平移至U型抗原抗體反應(yīng)板上。在U型抗原抗體反應(yīng)板第11列每孔各加50μL的1倍PBST，在第11列A11孔加50μL的陽性對照血清，然后吹打3次，以50μL/孔沿列連續(xù)倍比稀釋至H11孔后棄去50μL液體，由于陽性對照血清在廠家生產(chǎn)時已預(yù)先作了8倍稀釋，此時第11列8個孔的陽性對照血清稀釋度則為1：16～1：2048。在第12列A12到B12兩個孔每孔各加50μL的1倍PBST，在A12孔加50μL的陰性對照血清，然后吹打3次以50μL/孔連續(xù)倍比稀釋至B12孔后棄去50μL液體，此時A12到B12兩個孔陰性對照血清的稀釋度則為1：2～1：4。

③加病毒抗原。將病毒抗原用1倍PBST稀釋至工作濃度后，以50μL/孔的量加入到U型抗原抗體反應(yīng)板上的被檢血清、陰陽性對照血清的稀釋孔內(nèi)。如圖2所示，由于加入了等量的病毒抗原液體，此時被檢血清的稀釋度則從1：64變?yōu)?：128，陽性對照血清的稀釋度則從1：16～1：2048變?yōu)?：32～1：4096，陰性對照血清的稀釋度則從1：2～1：4變?yōu)?：4～1：8。同時，在第12列E12到H12四個孔每孔僅加100μL稀釋至工作濃度的病毒抗原。封板震蕩，4℃靜置過夜或37℃孵育90min。

④平移U型板內(nèi)液體。將U型板內(nèi)各孔液體以50μL/孔的量按次序平移至兔抗包被ELISA板上，封板，37℃孵育60min。

⑤洗板加豚抗。洗ELISA板6次，在吸水紙巾上甩拍干，以50μL/孔的量均加口蹄疫O型豚鼠抗體工作液，封板，37℃孵育60min。

⑥洗板加兔抗。洗ELISA板6次，在吸水紙巾上甩拍干，以50μL/孔的量均加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封板，37℃孵育60min。

⑦洗板加底物溶液。洗ELISA板6次，在吸水紙巾上甩拍干，將TMB底物A溶液和B溶液以1：1比例混勻，以50μL/孔的量均加混勻后的底物溶液，封板，37℃溫育15min進行顯色反應(yīng)。

⑧加終止液并讀值。以50μL/孔的量均加終止液，混勻后在酶標儀上讀取OD450nm值。

3）試驗成立條件。每塊ELISA板設(shè)4孔病毒抗原對照，病毒抗原對照至少兩孔OD450nm值在1.0～2.0范圍內(nèi)，陽性血清對照抗體滴度應(yīng)在1：512～1：2048之間，陰性血清對照抗體滴度應(yīng)小于1：4。

4）結(jié)果判定。以病毒抗原對照OD450nm平均值的50%為臨界值（對照值），被檢血清稀釋孔OD450nm值大于臨界值的為陰性孔，小于或等于臨界值的為陽性孔。被檢血清抗體滴度大于或等于1：128判為陽性（免疫抗體合格），被檢血清抗體滴度小于1：128判為陰性（免疫抗體不合格）。

2 結(jié)果與分析

從表1可看出，在檢測通量上，改進后的1塊ELISA板可檢測樣品份數(shù)較試劑盒使用說明書原有布局增加到4～8倍，在檢測樣品ELISA板利用率上則大幅度提高到83.33%。同時，在檢測試劑盒費用、檢測時效及人力成本上則可壓縮4～8倍，也可減少診斷液及相關(guān)耗材等試驗廢棄物產(chǎn)生量，有較為積極的社會效益及生態(tài)效益。

3 討論

3.1 關(guān)于定性檢測與定量檢測的適用性

就目前基層一線對口蹄疫免疫質(zhì)量評價而言，主要是基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部所要求的免疫抗體合格率這一指標來評價偶蹄動物口蹄疫免疫質(zhì)量的。免疫抗體合格率大于等于70%的畜群，則表明免疫質(zhì)量較高，一定范圍內(nèi)建立起了有效的免疫屏障，在免疫期內(nèi)牲畜對口蹄疫疫病具有較強的免疫持久性和保護力。免疫抗體合格率小于70%的畜群，則表明畜群免疫質(zhì)量較差，存在較大的疫病傳播風險，提示需強化免疫。因此，在此評價指標和實際工作考量下，合格或不合格則是免疫抗體檢測的關(guān)鍵，此評價只需定性結(jié)果，無需具體抗體滴度。本文所建立的口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，則能很好地適用于基于此指標下大樣本的定性檢測需求，也類比適用于A型和亞洲I型LPB-ELISA免疫抗體的定性檢測。一個好的疫病防控路線，一定是綜合權(quán)衡技術(shù)、財力、人力、推行難易程度等社會各個因素來制定的，而不是單純只考慮某一因素，從這個角度來說，本定性檢測技術(shù)也是與基層一線實際情況緊密結(jié)合，是基層用于口蹄疫免疫質(zhì)量評價很好的選擇。也有研究者針對地方外調(diào)畜數(shù)量大、檢測量多的實際情況，以另一個思路對口蹄疫LPB-ELISA方法進行了改進，也取得類似本文改進后的良好效果[4]。湯天元等[5]對5塊裝口蹄病毒O型LPB-ELISA抗體檢測試劑盒操作步驟進行了改進，改進后的每份樣品檢測成本由原來32～16元降低到4元，這也與本文改進后可壓縮檢測費用4～8倍相吻合。而對于研究分析免疫抗體消漲、抗體滴度高低分布及小樣本的檢測等工作時，則適宜選擇試劑盒說明書中的定量檢測技術(shù)。

3.2 關(guān)于血清稀釋比例及抗體滴度合格值的設(shè)定

考量到微量移液器精度、吸頭質(zhì)量、血清稀釋板孔容量、基層單位操作人員嫻熟程度等，將被檢血清稀釋設(shè)定為315μL的1倍PBST加5μL的被檢血清，一步將血清稀釋到1：64，此稀釋方案適合于基層普通操作人員和操作設(shè)備。也可將血清的稀釋設(shè)定為157.5μL的1倍PBST加2.5μL的被檢血清，此血清稀釋方案則對操作人員和設(shè)備提出的要求較高，對基層來說不宜采用，而對于各方面條件成熟者，亦可嘗試采用此稀釋方案。對于630μL的1倍PBST加10μL的被檢血清的稀釋方案，則稀釋液體體系過大，對血清稀釋板孔容量有較高的要求，且操作不便，不宜采用。另外，參照國標，將1：128設(shè)定為抗體滴度合格值，對于大樣本下的定性檢測現(xiàn)實工作來說，介于1：128～1：64之間的疑似結(jié)果極少，從統(tǒng)計學的角度來說，極少的疑似結(jié)果對免疫抗體合格率的統(tǒng)計影響可忽略不計，從提高免疫質(zhì)量的角度來說，即使有較多樣品免疫抗體滴度處于疑似區(qū)、游走于合格線附近，表明免疫對象免疫抗體水平衰減厲害，免疫質(zhì)量不高，對疫病起不到很好的保護力，亦需強化免疫。因此，未設(shè)定疑似血清稀釋滴度，對于血清免疫抗體滴度小于1：128的，直接判定為免疫抗體不合格。

3.3 關(guān)于試驗操作注意的關(guān)鍵點

LPB-ELISA試驗操作繁瑣，周期長，需要注意的事項多，操作中稍有不慎就會導(dǎo)致試驗結(jié)果發(fā)生偏差或試驗失敗[6]。在檢測前，要將試劑盒和被檢血清恢復(fù)至室溫狀態(tài)，打開ELISA板真空包裝膜后需盡快用完，在操作中要保持ELISA板底部不被臟物污染，確保酶標儀讀數(shù)準確，要避免同一廠家不同批次、不同廠家的試劑混合使用;有研究者對該試驗的測量不確定度在嚴格控制反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等因素下進行了評估，找出影響檢測質(zhì)量的主要因素為酶標儀的測量和1：128稀釋倍數(shù)下的樣品濃度，其對不確定度影響最大[7]，而本文一步稀釋法所加入的被檢血清只有5μL，量極少，易導(dǎo)致加樣量不準，因此要嚴格加樣操作，且在加入后要充分混勻，保證稀釋比例準確，對于酶標儀要定期檢定校準，加強日常維護管理，規(guī)范操作，在檢測時可提前打開酶標儀運行數(shù)分鐘待穩(wěn)定后再行檢測;TMB底物溶液的保存、配置、加樣等環(huán)節(jié)須做好避光措施，且現(xiàn)用現(xiàn)配，如出現(xiàn)溶液變色則棄之勿用;眼觀底物顯色情況，結(jié)合操作經(jīng)驗，靈活掌握顯色時間，可對其進行適當調(diào)整，顯色時間過長或過短，都可能會導(dǎo)致試驗條件不成立;終止反應(yīng)后，要盡快對ELISA板讀值，一般情況下拖延讀值時間不宜超過30min。

4 結(jié)論

口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，一塊ELISA板可定性檢測樣品80份，能很好地服務(wù)于檢測數(shù)量多、且要求出結(jié)果快的基層一線，對基層技術(shù)人員具有很好的實用性和借鑒性。同時，可大幅度節(jié)約檢測費用、降低人力成本，對保護環(huán)境也具有積極作用。

參考文獻：

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