溫經(jīng)湯“異病同治”痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機制研究

楊夢雅，劉 楊，田 野，李瑞明*

（1.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 210009；2.天士力控股集團有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410；3.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津 300410）

溫經(jīng)湯最早出自于張仲景的《金匱要略》，《婦人大全良方》中的溫經(jīng)湯則是根據(jù)《金匱要略》原方加減而來［1］，全方由川芎、當歸、肉桂、白芍、人參、牡丹皮、牛膝、莪術(shù)、甘草9味藥組成。該方具有溫經(jīng)散寒，通利血脈，活血祛瘀，調(diào)經(jīng)止痛的功效［2］。古代經(jīng)典名方目錄（第一批）中包含100首方劑，溫經(jīng)湯是百首之一，同時也是古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表中公布的7首方劑之一。

VOSviewer軟件可用于構(gòu)建和可視化從大量科學(xué)文獻中提取的重要術(shù)語的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)。利用VOSviewer軟件對溫經(jīng)湯的臨床應(yīng)用文獻進行分析，探討其臨床應(yīng)用特點。

“異病同治”思想源自黃帝內(nèi)經(jīng)，中醫(yī)認識疾病和治療疾病的基本原則是辨證論治，異病同治的根本是“證同治亦同”，也是辨證論治的實質(zhì)體現(xiàn)［3］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用多種方法，包括網(wǎng)絡(luò)可視化技術(shù)、高通量技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)等，通過探索與中醫(yī)復(fù)方治療疾病相關(guān)的作用機制，可以從整體上來描述復(fù)方與機體之間的相互作用，從而表明“復(fù)方-多成分-多靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系［4］。復(fù)方中藥具有多途徑、多成分、多靶點等協(xié)同作用的特點，而且由于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用的機制比較復(fù)雜，所以不管是在整體上還是細胞以及分子水平上，都很難進行全面系統(tǒng)的研究［5］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)就是通過藥物-基因-疾病的共模塊分析來說明復(fù)方中藥方劑配伍的，有助于中藥“異病同治”科學(xué)內(nèi)涵的闡釋。

本研究用VOSviewer軟件可視化分析溫經(jīng)湯的臨床應(yīng)用，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析方法，對溫經(jīng)湯治療痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的有效成分、作用靶點、作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平 臺 TCMSP（https://old.tcmspe.com/tcmsp.php）；Uniprot數(shù) 據(jù) 庫（https://www.uniprot.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）；Disgenet數(shù) 據(jù) 庫（https://www.disgenet.org/）；David（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）數(shù)據(jù)庫；CNKI數(shù)據(jù)庫（https://www.cnki.net/）；Cytoscape 3.7.1軟件；STRING數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）；Venny 2.1網(wǎng)頁（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；VOSviewer軟件。

1.2 利用VOSviewer軟件統(tǒng)計分析 檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（CNKI），以“溫經(jīng)湯”“加減溫經(jīng)湯”為主題詞精確搜索，時間范圍限定在2000年—2021年5月，篩除動物實驗、綜述等文獻，統(tǒng)一關(guān)鍵詞表達方式。將題錄信息導(dǎo)入到VOSviewer中繪圖，設(shè)置關(guān)鍵詞出現(xiàn)次數(shù)≥5，計數(shù)方式為“Fractional counting”。

1.3 活性化合物及其作用靶點信息 以肉桂、人參、川芎、當歸、莪術(shù)、牛膝、牡丹皮、白芍和甘草9味藥材名為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺中篩選出溫經(jīng)湯中9味藥材的化學(xué)成分，將藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選檢索到的化學(xué)成分，同時，結(jié)合檢索知網(wǎng)和萬方等中文數(shù)據(jù)庫對有效活性成分進行補充完善。整理已獲得的靶點蛋白將其導(dǎo)入到Uniprot數(shù)據(jù)庫，將已獲得靶點蛋白與基因名進行轉(zhuǎn)換。對靶點進行篩選和校正，選擇物種為“human”，將所有的基因校正為官方名稱。

1.4 溫經(jīng)湯治療痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的共同靶點查詢 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫、Disgenet數(shù)據(jù)庫以及DrugBank數(shù)據(jù)庫，得到痛經(jīng)（dysmenorrhea）、子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）和月經(jīng)不調(diào)（menstrual disorder/irregularities）的潛在靶點。將3種疾病的靶點與溫經(jīng)湯中活性成分所對應(yīng)的靶點取交集，得到溫經(jīng)湯治療痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的共同作用靶點。

1.5 潛在共有靶點的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在共同作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins并限定物種為Homo sapiens，構(gòu)建共同作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。再將其導(dǎo)入到軟件Cytoscape 3.7.1中，實現(xiàn)可視化。

1.6 GO富集和KEGG通路分析 將上述獲得的核心靶點輸入David數(shù)據(jù)庫，Select Identifier選擇為OFFICIAL-GENE-SYMBOL，List Type選擇為Gene List。選擇物種為Homo sapiens進行KEGG通路和GO功能富集分析。

1.7 溫經(jīng)湯“異病同治”活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 把溫經(jīng)湯“異病同治”的KEGG通路和相關(guān)靶點反向?qū)踊钚曰衔?，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 VOSviewer統(tǒng)計分析結(jié)果 對檢索到的文獻進行篩選，去除綜述、動物實驗以及不相關(guān)的文獻，共獲得277篇文獻，統(tǒng)一關(guān)鍵詞表達方式，例如“the wenjing decoction”和“wenjing decoction”統(tǒng)一為“溫經(jīng)湯”，“primary dysmenorrhea”和“dysmenorrhea”統(tǒng)一為“痛經(jīng)”，“寒凝血瘀證”和“寒凝血瘀型”統(tǒng)一為“寒凝血瘀”?！爸嗅t(yī)藥療法”更改為“中醫(yī)藥治療”，“療效觀察”更改為“療效”等。將文獻導(dǎo)入到VOSviewer中繪圖，設(shè)置關(guān)鍵詞出現(xiàn)次數(shù)≥5，計數(shù)方式為“Fractional counting”，結(jié)果如圖1所示。從圖可看出溫經(jīng)湯在臨床上主要用于治療痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥、月經(jīng)不調(diào)和不孕等婦科疾病。

圖1 VOSviewer關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類視圖

2.2 溫經(jīng)湯候選活性化合物的篩選及靶標預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對溫經(jīng)湯中9味中藥進行檢索，篩選條件是OB≥30%和DL≥0.18，去除沒有靶點的化學(xué)成分，同時結(jié)合文獻檢索補充相關(guān)活性成分。共得到173個活性成分，其中白芍8個、莪術(shù)2個、牡丹皮7個、牛膝17個、川芎6個、肉桂14個、人參28個、當歸3個、甘草88個。將整理搜集到候選活性成分的靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫，對搜集篩選得到的靶點蛋白進行篩選和校正，將9味藥材的靶點合并去重共得到302個靶點。見表1。

表1 溫經(jīng)湯經(jīng)篩選獲得的173個候選活性化合物基本信息

續(xù)表1 溫經(jīng)湯經(jīng)篩選獲得的173個候選活性化合物基本信息

續(xù)表1 溫經(jīng)湯經(jīng)篩選獲得的173個候選活性化合物基本信息

續(xù)表1 溫經(jīng)湯經(jīng)篩選獲得的173個候選活性化合物基本信息

2.3 溫經(jīng)湯“中藥-活性化合物-靶標”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將9味中藥、173個活性化合物與對應(yīng)的302個基因靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，繪制“藥材-活性化合物靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。網(wǎng)絡(luò)共466個節(jié)點，3 370條邊。

圖2 溫經(jīng)湯“中藥-活性化合物-靶標”網(wǎng)絡(luò)

2.4 溫經(jīng)湯治療痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的潛在靶點分析 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫、Drug－Bank數(shù)據(jù)庫以及Disgenet數(shù)據(jù)庫，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索出子宮內(nèi)膜異位癥1 783個靶點，取相關(guān)性得分大于中位數(shù)的靶點有906個。月經(jīng)不調(diào)有2 720個靶點，取相關(guān)性得分大于中位數(shù)的靶點有1 360個。痛經(jīng)有240個靶點。合并3個數(shù)據(jù)庫檢索到的疾病靶點去重后分別獲取痛經(jīng)373個靶點、子宮內(nèi)膜異位癥1518個靶點和月經(jīng)不調(diào)1 382個靶點。通過使用Venny軟件工具把上面3個疾病靶點分別與溫經(jīng)湯活性化合物調(diào)控的靶標取交集，繪制出韋恩圖（圖3），得到了61個溫經(jīng)湯調(diào)控3種疾病的共有靶標。另外，80個與痛經(jīng)調(diào)控相關(guān)的潛在靶標，151個與子宮內(nèi)膜異位癥調(diào)控相關(guān)的潛在靶標，157個與月經(jīng)不調(diào)調(diào)控相關(guān)的潛在靶標。

圖3 溫經(jīng)湯與痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的靶點交集韋恩圖

2.5 溫經(jīng)湯調(diào)控3種疾病的共有靶標PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 把這61個溫經(jīng)湯調(diào)控3種疾病的共有靶標導(dǎo)入STRING來進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，再使用Cytoscape 3.7.1可視化圖像（圖4）。61個節(jié)點，860條邊在圖中。以節(jié)點表示蛋白，節(jié)點間的相互作用用邊表示。圖示中節(jié)點度值與顏色和節(jié)點有關(guān)，顏色越深，節(jié)點越大，表示的節(jié)點值就越大，得到這些共有靶標的平均節(jié)點度值是30，有28個蛋白靶標超過該值。其中ESR1、MAPK3、TP53、PTGS2、VEGFA、TNF、AKT1、IL6，degree值顯著高于其余靶點，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要的紐帶作用。

圖4 共有靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO與KEGG富集分析 將上述獲得的溫經(jīng)湯治療痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)不調(diào)的潛在核心靶點輸入David數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路和GO功能富集分析。KEGG通路共有98條，溫經(jīng)湯“異病同治”的主要信號通路選擇P值最小的前15條信號通路，見圖5A。這些通路主要包括癌癥（pathwaysin cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNFsignaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、子宮內(nèi)膜癌（eEndometrial cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）等。生物過程（BP）條目計284項，將其中P值最小的前15項進行氣泡圖繪制，見圖5B。生物過程主要涉及炎癥反應(yīng)、血管再生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素應(yīng)答等。

圖5 GO功能（A）與KEGG通路（B）富集分析

2.7 溫經(jīng)湯“異病同治”活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將溫經(jīng)湯“異病同治”的活性成分、潛在作用靶點及KEGG篩選出來的前15條信號通路一一對應(yīng)，制作溫經(jīng)湯“異病同治”活性成分-靶點-信號通路圖（見圖6）。根據(jù)通路圖中排名前15的活性化合物度值，篩選出活性成分槲皮素、山柰酚、黃芩素、柚皮素、芹菜素等可能是溫經(jīng)湯“異病同治”的主要活性成分。主要涉及的靶點包括PTGS2、ESR1、PPARG、NOS3、AKT1、CASP3、TNF等。

圖6 活性成分-核心靶點-通路圖

3 討論

溫經(jīng)湯是治療婦科疾病的經(jīng)典名方，通過VOSviewer軟件可視化分析，總結(jié)出在臨床應(yīng)用中，主要用于治療痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、子宮內(nèi)膜異位癥和月經(jīng)病等婦科疾病。

在臨床上子宮內(nèi)膜異位癥的癥狀為痛經(jīng)和月經(jīng)不調(diào)［6］。子宮內(nèi)膜異位癥、痛經(jīng)和月經(jīng)不調(diào)三者病理狀態(tài)相互聯(lián)系，病證相互促進，三者在治療方案上也有著一定的相似性。因此，研究溫經(jīng)湯對子宮內(nèi)膜異位癥、痛經(jīng)和月經(jīng)不調(diào)三者的異病同治機制，為后續(xù)深入研究溫經(jīng)湯發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)，同時為中醫(yī)“異病同治”提供理論依據(jù)。

溫經(jīng)湯“異病同治”的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、黃芩素、柚皮素、芹菜素等。槲皮素最有效的作用之一是調(diào)節(jié)炎癥。槲皮素的抗炎作用是通過抑制炎癥酶環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶，從而減少炎癥介質(zhì)［7］。在體外，利用槲皮素處理脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞瘤系細胞炎癥模型，槲皮素顯示出較好的抗炎效果，是通過降低炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10的表達量［8］。山柰酚可降低促炎細胞因子的產(chǎn)生和mRNA表達，在細胞層面此抗炎作用也得到了證實［9］。黃芩素的藥理作用是抗炎，增強免疫和抗腫瘤。研究表明，黃芩素可抑制炎性遞質(zhì)前列腺素E2（PGE2）、NO的凋亡，改善環(huán)氧化物酶-2（COX-2）蛋白表達水平，且抗炎效果和藥物濃度呈一定程度的正相關(guān)。并且黃芩素也可對腫瘤增殖、生長等機制產(chǎn)生抑制作用。

本研究篩選出溫經(jīng)湯異病同治的潛在作用靶點包括PTGS2、ESR1、NOS3、AKT1、CASP3、TNF等，其中雌激素受體（ESR1），介導(dǎo)大部分的雌激素反應(yīng)。子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis）是一種常見的婦科疾病，其依賴于雌激素，雌二醇（estradiol，E2）作為一種雌激素，能夠促進異位病灶細胞的黏附、侵襲、增殖、抑制凋亡以及維持炎性反應(yīng)［10］。因此通過調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素的水平可有效治療子宮內(nèi)膜異位癥、痛經(jīng)和月經(jīng)不調(diào)［11-12］。腫瘤壞死因子（TNF）是一類能夠參與多種生物效應(yīng)的細胞因子，其通過結(jié)合細胞膜上的受體來激活TNF信號通路，以此來調(diào)控細胞的生長、分化、調(diào)亡及誘發(fā)炎癥等過程，另外對新生血管生成也有一定的潛在誘導(dǎo)作用［13］。研究表明，內(nèi)膜異位有可能會刺激機體產(chǎn)生相關(guān)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腹腔液白細胞中的巨噬細胞大量增加，從而誘發(fā)其產(chǎn)生較多的TNF-α因子，促進間質(zhì)細胞的黏附和增殖，最終導(dǎo)致異位病灶［14］。

溫經(jīng)湯中中醫(yī)異病同治主要涉及到癌癥信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll樣受體信號通路、子宮內(nèi)膜癌、HIF-1信號通路、雌激素信號通路等。子宮內(nèi)膜異位癥雖然在病理組織學(xué)上呈現(xiàn)出良性腫瘤的狀態(tài)，但其具有惡性腫瘤的特點，如調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞的遷移、黏附和生成新生血管等［15］。病理學(xué)研究認為，非典型的子宮內(nèi)膜異位癥是良性的子宮內(nèi)膜異位癥到癌癥的一個過渡，所以子宮內(nèi)膜異位癥其實就是卵巢癌的癌前狀態(tài)［16］。有研究［17］發(fā)現(xiàn)EMT患者異位子宮內(nèi)膜以及血清中腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β等炎癥因子水平升高，通過控制這些炎癥因子水平有利于EMT的治療。Toll樣受體信號通路可能參與調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生、發(fā)展［18］。

Rashidi等［19］通過分析15例患者體內(nèi)的子宮內(nèi)膜組織，證明了TLR4蛋白在子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細胞及內(nèi)膜上皮細胞中都有表達，而且子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細胞中蛋白表達水平比子宮內(nèi)膜上皮細胞要高，表明TLR4蛋白可能參與對子宮內(nèi)膜中的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。在分子細胞方面，Khan等［20］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液白細胞中的巨噬細胞分泌的炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-6等）在雌激素和LPS的聯(lián)合作用下顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)在該作用下使得培養(yǎng)的在位和異位子宮內(nèi)膜細胞顯著增多。但是當阻斷了雌激素受體與TLR4的作用后，明顯抑制了炎癥細胞因子的分泌及子宮內(nèi)膜細胞的生長。這表明了雌激素和TLR4信號通路的聯(lián)合有助于促進盆腔炎性反應(yīng)，促進子宮內(nèi)膜異位細胞的生長。缺氧誘導(dǎo)因子-1α是HIF-1信號通路中在機體缺氧條件下關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控血管生成素、血管內(nèi)皮生長因子、血小板生長因子等的表達，對異位子宮內(nèi)膜的血管生成發(fā)揮重要作用［21］。

Goteri等［22］通過對子宮內(nèi)膜異位癥患者異位灶局部的檢測，發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織。結(jié)果表明內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展和血管的生成及促血管因子表達的上調(diào)密切相關(guān)，HIF-1α可能參與了其中的一些促進作用。相關(guān)研究［23］證實HIF-1α在多種病理過程中發(fā)揮很大作用，如腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等。子宮內(nèi)膜異位癥即使屬于良性的疾病，但是其增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等病理學(xué)行為與惡性腫瘤極為相似，所以HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用也得到更多的關(guān)注。在黃體中期雌二醇高峰能夠促進月經(jīng)前期子宮內(nèi)膜中PGF2α的生成；孕激素（progesterone，P）可以把雌二醇轉(zhuǎn)化為沒有活性的雌酮，通過降低PG的合成和子宮平滑肌的舒縮活性來緩解痛經(jīng)。國內(nèi)有相關(guān)研究表明雌激素和孕激素與其受體結(jié)合，可以激活血清中的肥大細胞釋放致痛的物質(zhì)，與痛經(jīng)的發(fā)生相關(guān)［24］。病灶局部中高雌激素和雌激素受體會導(dǎo)致異位組織的細胞在增殖、凋亡、黏附、侵襲、血管新生和炎性反應(yīng)等多方面發(fā)生異常，對發(fā)生發(fā)展子宮內(nèi)膜異位癥十分有利［25］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)直觀表現(xiàn)了溫經(jīng)湯“異病同治”作用是通過多成分、多靶點的方式發(fā)揮其功效，為進一步實驗驗證和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。