表層取樣法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定竹木砧板中19種防腐防霉劑殘留

張 權(quán)，劉利亞，周貽兵，吳玉田，李 磊，林 野，郭 華，周 雪，陳慶園*

（1.貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025）

目前，我國竹木制品尚未納入生產(chǎn)許可管理產(chǎn)品類別，相關的技術(shù)規(guī)范、產(chǎn)品國家標準尚不完善?，F(xiàn)有標準僅包括GB/T 38742-2020《竹砧板》［9］、GB 19790.1-2021《一次性筷子第1部分：木筷》［10］和GB 19790.2-2005《一次性筷子第2 部分：竹筷》［11］，其余的竹木制品標準尚處于空白階段。多數(shù)竹木制品的理化檢測方法是參照GB 19790.2-2005，而該標準中只涉及噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯(lián)苯、抑霉唑等化學指標，未涵蓋五氯酚、苯甲醇、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、百菌清、對羥基苯基酸酯類等高效廣譜的防腐防霉劑。五氯酚及其鈉鹽是效果較佳、價格低廉的植物纖維防腐防霉劑［12］，通常竹木制品經(jīng)2%～5%五氯酚鈉溶液浸泡處理即可。其次，針對竹木制品的多種防腐防霉劑同時快速檢測的方法較少，方法靈敏度較低［13］。因此現(xiàn)階段的竹木產(chǎn)品缺乏快速有效的檢測監(jiān)控手段，因而建立一個準確、快速、高效的測定竹木制品中多種防腐防霉劑的檢測方法具有重要意義。

本研究在參考《2018年國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》［14］的基礎上，針對濫用及非法添加的防腐防霉劑在竹木砧板分布不均勻、取樣缺乏代表性等問題，優(yōu)化樣本制備過程和前處理條件，利用質(zhì)譜多反應監(jiān)測（MRM）模式對貴州省市售竹木砧板中的防霉防腐劑殘留水平進行篩查和確證，發(fā)現(xiàn)其未知風險隱患，為今后竹木制品中防霉防腐劑的溯源分析、風險評估以及標準制定等方向提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

布魯克Scion-TQ三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Bruker公司）；MilliQ去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；HGC-36A氮吹儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；安捷順電動刨木機（捷順工具有限公司）。

苯甲酸、山梨酸（純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；2，4，6-三氯酚（1.01 mg/mL，中國計量科學研究院）；苯噻氰（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；對羥基苯基酸甲酯、對羥基苯基酸丙酯、對羥基苯基酸丁酯（純度99.4%，美國AccuStandard公司）；抑霉唑、噻苯咪唑（100 μg/mL，上海安譜實驗科技有限公司）；鄰苯基苯酚（100 μg/mL，純度99.0%）、富馬酸二甲酯（純度99.7%）、苯甲醇（純度99.8%）、2，4，6-三溴酚（純度99.57%）、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯（純度98.79%）均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；戊唑醇、聯(lián)苯、克菌丹、林丹、百菌清、五氯酚標準溶液（100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）；三氯乙酸（純度99.7%，北京百靈威科技有限公司）；乙酸乙酯（HPLC級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙腈、正己烷（色譜純，默克有限公司）；醋酸酐（分析純，成都金山化學試劑有限公司）；SLC固相萃取柱（500 mg/6 mL，杭州福?？萍挤沼邢薰荆?；竹木砧板、一次性筷子為貴州省2020年食品安全風險監(jiān)測樣品，均購于超市、農(nóng)貿(mào)市場。

混合標準工作液的配制：分別吸取不同體積的單一標準溶液后混合，用丙酮定容至刻度即得，其中聯(lián)苯、鄰苯基苯酚的質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，富馬酸二甲酯、2，4，6-三氯酚、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、百菌清為0.5 μg/mL，苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、對羥基苯基酸甲酯為2.5 μg/mL，對羥基苯基酸丙酯、對羥基苯基酸丁酯、林丹、噻苯咪唑、抑霉唑、戊唑醇、苯噻氰、五氯酚、克菌丹為5.0 μg/mL。標準使用液于4 ℃冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備取砧板，板下放錫箔紙，用電刨在砧板表層從左至右依次刨削，砧板表層深度2 ～3 mm，要全部覆蓋砧板表層（雙面），收集所有木屑于錫箔紙上，用粉碎機低轉(zhuǎn)速粉碎均勻后，裝入聚乙烯塑料袋中。試樣量不少于20 g，貼好試樣編號，室溫下干燥處保存，備用。

1.2.2 樣品前處理稱取2.00 g試樣放入50 mL塑料離心管內(nèi)，加入10 mL水，60 ℃超聲提取10 min，再加入5 mL 5%三氯乙酸溶液，進一步超聲提取5 min，取出冷卻后加入10 mL 乙酸乙酯-正己烷（2∶8，體積比）提取溶劑，振蕩提取2 min，10 000 r/min離心4 min。吸出上層有機相在50 ℃水浴內(nèi)氮氣吹至干，加入1 mL乙腈超聲溶解2 min，10 000 r/min離心2 min，取上層清液待測定。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent DB-5MS 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；分流模式：不分流進樣，進樣口溫度：260 ℃，流速：1 mL/min，進樣量：1.0 μL。程序升溫條件：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至250 ℃，再以50 ℃/min 升至300 ℃保持5 min，共20 min。溶劑延遲3.5 min。

縱觀莫言的“狂歡化”敘事可以發(fā)現(xiàn)，莫言取材于高密東北鄉(xiāng)的歷史與當下的生活，在“高密東北鄉(xiāng)”的這個文學舞臺上不斷地書寫著過去先人的故事和當下人民的生存狀態(tài)，以“狂歡”為聚焦點，表現(xiàn)出了對后代的無能與孱弱的批判，透過游戲戲謔的故事情節(jié)傳達出了深刻嚴肅的立意企圖。莫言作品中呈現(xiàn)出所謂的“狂歡化”現(xiàn)象正是狂歡化理論與文學脫節(jié)或者說是不同文化“雜交”的一種異態(tài)、異形產(chǎn)物，但是反思我們中國的文化背景以及新時期以來文學發(fā)展的特點，莫言式的“狂歡化敘事”算是一種較為成功的“雜交”產(chǎn)物，在精神、文化方面還是有較為深刻的內(nèi)涵，是值得肯定的。

質(zhì)譜條件：電離模式：電子轟擊離子化（EI），電離能量：70 eV，分析模式：多反應監(jiān)測模式（MRM），CID氣：高純氬氣，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過質(zhì)譜全掃描模式，確定各化合物的特征碎片離子作為母離子，進行子離子全掃描，選擇響應強度較大的二級碎片離子作為子離子，確定定量和定性離子對，并優(yōu)化每個離子對的最優(yōu)碰撞能量，最終得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 19種待測物的保留時間和質(zhì)譜分析條件Table 1 Retention times and MS parameters for the analysis of 19 target compounds

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于各目標物的極性不同，實驗分別考察了DB-1701MS 和DB-5MS 色譜柱對19 種防腐劑的分離效果。結(jié)果顯示，當采用DB-1701MS 色譜柱分析時，對羥基苯基酸酯類物質(zhì)的色譜峰拖尾嚴重；而采用DB-5MS 色譜柱分析時目標峰的拖尾現(xiàn)象有所改善，且DB-5MS 色譜柱在質(zhì)譜分析時應用較為普遍，也避免更換色譜柱時影響工作效率。因此，實驗選擇DB-5MS 色譜柱進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)當起始柱溫超過60 ℃時，富馬酸二甲酯的峰形拖尾嚴重，這與文獻報道一致［15］，所以本實驗設置起始溫度為50 ℃，并將測定時間控制在16 min 內(nèi)，通過優(yōu)化色譜條件以降低色譜峰的拖尾程度。19 種目標物混合標準溶液的總離子流色譜圖如圖1 所示，各目標物得到有效分離，可滿足測試要求。

圖1 19種目標物混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the mix standard solution of 19 compounds the peak numbers were the same as those in Table 1

2.3 樣品取樣方法的優(yōu)化

在竹木砧板樣品制備過程中，因為材質(zhì)較硬不易將整塊砧板粉粹，大多采用正反梅花九點式布點法制備樣品。通常竹木砧板中五氯酚的檢出頻次及含量較高［16］，且五氯酚屬于人為添加物質(zhì)，存在分布不均勻問題，如果按照常規(guī)布點法制備樣品，取樣隨機性較大，只有砧板的雙面表層與食物相接觸，其中間部分未能接觸食品。實驗比較了正反梅花九點式布點法和表層取樣法兩種制備方法對檢測結(jié)果的影響（見圖2）。選取16個五氯酚檢出含量較高的代表性樣本，對刨削及鉆孔下的樣品進一步粉粹，按照優(yōu)化后的前處理方法操作后上機檢測，兩種制備方法下的五氯酚測定結(jié)果及比值關系如圖3所示。

圖2 長方形砧板九點式布點采樣法（A）及表層取樣法（B）示意圖Fig.2 Schematic diagram of nine-point sampling method（A）and surface sampling（B）for rectangular wooden chopping board

由圖3 可知，表層取樣法制備樣品的五氯酚檢出含量均高于九點式布點法，兩種制備方法的檢出含量比值在1.0～56.1 倍之間，推測五氯酚可能是以短暫浸泡的添加方式浸入竹木砧板內(nèi)。本實驗采用表層取樣法制備樣品。

圖3 兩種樣本制備方法下五氯酚的結(jié)果比較Fig.3 Comparison of pentachlorophenol results under two sample preparation methods

2.4 提取溶劑的優(yōu)化

通常竹木制品的化學防腐是將改性劑或防霉防腐等化學藥劑注入到竹木制品中，與竹材中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的活性基團發(fā)生反應形成醚鍵、酯鍵或縮醛聯(lián)結(jié)，改變竹木制品的化學結(jié)構(gòu)［17］。目前提取不同種類防腐劑的溶劑主要有乙酸乙酯、正己烷等，本實驗在空白竹木砧板基質(zhì)中添加不同濃度的混合標準溶液，考察了分別以乙酸乙酯、乙酸乙酯-正己烷（8∶2）、乙酸乙酯-正己烷（6∶4）、乙酸乙酯-正己烷（4∶6）、乙酸乙酯-正己烷（2∶8）、正己烷為提取溶劑時19 種目標物的平均提取效率，提取液體積均為10 mL。結(jié)果顯示：上述6 種提取溶劑的平均提取率分別為51.2%、65.6%、78.2%、81.2%、91.3%、92.5%，以正己烷作為提取溶劑時19 種目標物的平均提取率最高，但鄰苯基苯酚的提取率只有54.6%，而乙酸乙酯-正己烷（2∶8）混合提取溶劑對19 種目標物的提取率均高于65.0%，所以后續(xù)實驗均以乙酸乙酯-正己烷（2∶8）作為提取溶劑。在其他操作相同條件下，分別考察了提取溶劑體積（5、10、15 mL）對提取效率的影響。結(jié)果顯示：當提取溶劑體積為5 mL 時19 種目標物的平均提取率為65.3%，以10 mL 提取時各組分的平均提取率為93.7%，而10 mL 及15 mL 時的提取率無較大差別。為節(jié)省溶劑，實驗選擇以10 mL乙酸乙酯-正己烷（2∶8）為提取溶劑。

2.5 衍生化及凈化操作的討論

含氯酚是竹木制品中一類常用的防腐劑［18］，檢測時需在堿性環(huán)境中將乙酸酐五氯酚衍生成五氯苯乙酸酯，內(nèi)標物2，4，6-三溴酚衍生成2，4，6-三溴苯乙酸酯，然后上機測定。實驗比較了含氯酚類物質(zhì)未衍生化及衍生化后的靈敏度差異。結(jié)果表明：在相同的儀器條件下，五氯酚衍生后的靈敏度約提高了10倍，內(nèi)標物2，4，6-三溴酚約提高了40倍，2，4，6-三氯酚只提高了1.4倍。由于在木砧板中檢出五氯酚的濃度通常較高，所以本方法省略衍生化操作，利用GC-MS/MS 采用二級MS 離子定性，既可排除假陽性，又可提高檢測靈敏度和準確性［19］，方法檢出限也滿足相關要求。

文獻報道中防腐劑的檢測采用SLC 固相萃取柱凈化法［20］。本實驗在空白竹木砧板樣本中添加低濃度的19種防腐劑混標，比較了樣本提取液經(jīng)SLC 固相萃取柱凈化前后的全掃描譜圖及平均回收率，分別在衍生化前、衍生化后進樣分析。結(jié)果表明，無論是在衍生化前還是衍生化后，過SLC 固相萃取柱的凈化效果一般，而且對測定結(jié)果的重現(xiàn)性產(chǎn)生了影響，其次經(jīng)固相萃取法凈化后19種目標物的平均回收率僅為76.2%，且聯(lián)苯等5種防腐劑的回收率低于60.0%。因此，本方法選擇不進行凈化操作。

2.6 基質(zhì)效應

實驗考察了竹木制品中19 種防腐防霉劑檢測時的基質(zhì)效應（ME），通過不同濃度的混合標準溶液在空白樣品基質(zhì)與純?nèi)軇┲行盘枏姸鹊谋戎蛋俜直仍u價ME。比值百分比越接近100%，表明基質(zhì)效應對結(jié)果影響越?。槐戎蛋俜直却笥?00%，表明存在基質(zhì)增強效應；比值百分比小于100%，表明存在基質(zhì)抑制效應。結(jié)果顯示：五氯酚、2，4，6-三氯酚、苯噻氰、富馬酸二甲酯、苯甲醇、鄰苯基苯酚的比值百分比均大于130%，表明存在基質(zhì)增強效應；碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、戊唑醇、抑霉唑、噻苯咪唑的比值百分比為110%～130%。為減少基質(zhì)效應對定量的影響，本實驗采用基質(zhì)匹配工作曲線法進行定量分析。

2.7 線性范圍、檢出限、定量下限及加標回收率

取6 份木砧板空白樣品，按照本方法進行樣品前處理至濃縮近干步驟，分別加入1 mL 6 個不同質(zhì)量濃度的混合標準使用液。在最佳色譜條件下，利用基質(zhì)匹配外標法定量，以目標物的峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X，μg/mL），繪制線性回歸方程。并采用空白樣品中添加目標物的方法，以3 倍信噪比（S/N）對應的質(zhì)量濃度確定檢出限（LOD），10 倍信噪比（S/N）對應的質(zhì)量濃度確定定量下限（LOQ）。另取數(shù)份竹木砧板空白樣品，分別添加100、500 μL 不同質(zhì)量濃度的混合標準使用液，密閉常溫放置24 h 后按照本方法進行樣品前處理，并上機分析，利用基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量，每個加標水平平行測定5次。結(jié)果如表2所示。

由表2可知，19種待測物在0.005～200.0 μg/mL范圍呈良好的線性關系（r2＞0.990），方法LOD 為0.001 ～0.17 mg/kg，LOQ為0.003 ～0.55 mg/kg；在低、高2個不同加標水平下19種目標物的回收率為65.8%～97.2%，相對標準偏差（RSD，n=6）為4.3%～13%。表明本方法具有較高的準確度，能夠滿足檢測要求。

表2 19種待測物的線性關系、檢出限、定量下限及回收率Table 2 Linear relations，LODs，LOQs and recoveries of 19 target compounds

2.8 實際樣品分析

以2020 年貴州省食品安全風險專項監(jiān)測中對貴州省采集的80 批次市售竹木砧板及20 批次一次性筷子為實際樣品，采用本方法進行檢測，結(jié)果在65批次竹木砧板中檢出五氯酚，且非定型包裝竹木砧板中的檢出含量較高，2個批次一次性筷子中檢出對羥基苯基酸丙酯，含量為0.2 ～1.2 mg/kg，未發(fā)現(xiàn)其他防腐防霉劑超限量使用情況。

目前我國未對竹木砧板中五氯酚的殘留量做出限量要求。按照歐盟ResAP（2004）2決議中五氯酚的最大殘留量0.15 mg/kg 限量值［21］，本次監(jiān)測的竹木砧板中五氯酚的超標率為72.5%。其中在農(nóng)貿(mào)市場采集的1 份非定型包裝竹木砧板中的殘留量最高為314.35 mg/kg，根據(jù)2018 年國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測工作手冊［14］中五氯酚的檢測方法進行復核，結(jié)果為（312.23 ± 3.5）mg/kg，超出限量值2 000倍以上，與文獻報道基本相符［22］。陽性樣品的檢測譜圖如圖4所示。

圖4 陽性樣品中五氯酚的MRM總離子流圖Fig.4 MRM total ion chromatograms of PCP in a positive sample

3 結(jié) 論

本研究建立了表層取樣結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定竹木砧板中19 種防腐防霉劑殘留的方法。該樣品制備方法可減少取樣隨機性，使樣品中目標物更均勻，且前處理無需衍生化及凈化操作。方法簡便、高效，為竹木制品中防腐防霉劑的檢測提供了科學基礎。