基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的新型聚集誘導(dǎo)熒光探針用于硫化氫的檢測及細胞成像

劉芙蓉，閆 麗，范哲鋒，溫曉燁

（山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

硫化氫（H2S）主要以水溶液形式（HS-）存在，并以其刺激性氣味和有害特性受到關(guān)注。生物系統(tǒng)中的H2S已被公認為是第三種內(nèi)源性氣體遞質(zhì)［1-2］，有助于維持細胞健康的多種生理過程，如參與血紅蛋白的變化、調(diào)節(jié)酶的種類、舒張血管等［3-4］；但H2S 的異常積累也可能導(dǎo)致某些疾病，如阿爾茨海默病、肝病、糖尿病等［5］。另一方面，食品工業(yè)中，如發(fā)酵過程產(chǎn)生的H2S 對葡萄酒的品質(zhì)有負面影響，不僅造成了大量經(jīng)濟損失，甚至?xí)：θ梭w健康［6］。因此，設(shè)計和開發(fā)新穎有效的方法來檢測和跟蹤生物系統(tǒng)和食品材料中的H2S具有重要意義。

目前已報道了多種H2S 的檢測方法，如電化學(xué)法、氣相色譜法、比色法、化學(xué)發(fā)光法（CL）和熒光法［7-10］，但存在樣品制備相對復(fù)雜、操作時間長等缺點。研究者們基于熒光檢測的優(yōu)勢，根據(jù)親核加成反應(yīng)、羥胺、硝基或疊氮化物的還原以及Cu2+置換等不同機理，設(shè)計了多種檢測H2S 的熒光探針［11-12］。然而多數(shù)探針存在其他生物硫化物的干擾以及聚集誘導(dǎo)猝滅（ACQ）等缺陷，限制了其實際應(yīng)用。因此，設(shè)計具有良好性能的H2S 熒光探針（例如可應(yīng)用于水溶液介質(zhì)，克服光漂白的影響等）具有重要意義。2001 年，Tang 課題組提出了聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）的概念［13-14］，相對于傳統(tǒng)的ACQ 分子，AIE 分子因具有高抗光漂白性、發(fā)射波長可調(diào)、可長期實時監(jiān)測等獨特的光物理特性，廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)和食品材料［15-16］。

本文使用4-乙酰氨基苯甲醛和碳酸肼合成了一種具有AIE 特性的高效新型熒光探針1 用于檢測H2S。從探針分子結(jié)構(gòu)（圖1）分析，探針的AIE特性可能歸因于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）效應(yīng)和分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限（RIR）效應(yīng)。進一步研究表明，探針1+Cu2+對H2S 具有高時效、高靈敏的傳感性能，由此成功構(gòu)建了快速靈敏的開啟型H2S熒光探針，并將其成功應(yīng)用于酒液樣品中的H2S檢測以及活細胞中外源性H2S的生物熒光成像。另外，利用探針1制備了實時有效的H2S視覺傳感器，并將其用于構(gòu)建具有熒光強度差異的超靈敏邏輯門。本研究為設(shè)計應(yīng)用于檢測氣體或小分子的新型AIE 熒光材料提供了新思路。

圖1 探針1的檢測機理示意圖Fig.1 Proposed detection principle for the probe 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由高分辨率質(zhì)譜（HRMS）儀器Ultra flex TOF/TOF（德國布魯克）記錄，1H NMR 和13C NMR數(shù)據(jù)在ANAVCE III HD NMR 波譜儀（德國布魯克）上測得，熒光光譜由Cary Eclipse 分光光度計（美國珀金埃爾默）記錄，SEM 圖像由JSM-7500F 顯微鏡（日本電子）獲得，使用TU-1901 分光光度計（北京普析）記錄樣品的紫外吸收光譜。

4-乙酰氨基苯甲醛、碳酸肼、NaHS（作為H2S 的供體）購于阿拉丁化學(xué)試劑公司，乙醇、二甲基亞砜（DMSO）購于天津科密歐試劑有限公司。所有試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 合成過程

合成路線見圖2。將碳酰肼（5 mmol，0.45 g）和4-乙酰氨基苯甲醛（10 mmol，1.93 g）溶于乙醇（25 mL）中，加入幾滴乙酸作為催化劑，反應(yīng)混合物在82 ℃下攪拌8 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻，純化、蒸干，得到黃色固體顆粒（1.42 g，產(chǎn)率73%）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ（ppm）：δ10.36（s，1H），8.20（s，1H），7.33（s，1H），6.24（dd，J=8.8 Hz，1H），6.11（d，J=2.3 Hz，1H），3.34（dd，J=14.0 Hz，4H），1.11（t ，J= 7.0 Hz，6H）。13C NMR（400 MHz，CDCl3）δ（ppm）：δ150.04（s，1H），107.85（s，1H），104.01（s，1H），98.02（s，2H），40.48（d，J= 17.8 Hz，17H），13.03（s，4H）。HRMS（EI）：理論值［probe 1+H］+441.531，計算值441.275。

圖2 探針1的合成Fig.2 Synthesis route of the probe 1

1.3 測試方法

溶液配制：將探針1 溶解在二甲基亞砜（DMSO）中配制為儲備溶液（1.0 mmol/L）；NaHS（作為H2S的供體）用超純水溶解配制成10 mmol/L 的儲備溶液；其他競爭分析物如F-、Cl-、Br-、I-、S2-、CH3COO-、PO34-、OH-、ClO-、CO23-、HPO24-、HCO-3、谷胱甘肽（GSH）和同型半胱氨酸（Hcy）均在去離子水中制備為儲備液；使用時稀釋至所需濃度。

光譜測量：為探究探針1 的光物理性質(zhì)，在DMSO 和水的混合溶劑（水的體積分數(shù)為0%～99%）中測試了探針的熒光光譜和紫外吸收光譜。除特別說明外，所有光譜測試均在DMSO-H2O（1∶9，體積比），pH 7.4（PBS，0.2 mol/L）的水性介質(zhì)中進行（λex=370 nm，狹縫寬度：5 nm/15 nm）。

1.4 生物成像過程

利用共聚焦顯微鏡探究了探針1 在HeLa 細胞中外源性H2S 的檢測與生物熒光成像中的應(yīng)用。首先在37 ℃，5%CO2條件下，于DMEM 培養(yǎng)基中接種HeLa 細胞并培養(yǎng)24 h，再將探針1 和探針1+Cu2+分別加入HeLa 細胞的DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。將上述HeLa 細胞用PBS（pH 7.4）清洗3 次并進行熒光成像，在加入HS-（作為H2S的供體）后進一步使用PBS（pH 7.4）處理，再次進行熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的光學(xué)特性

首先，在不同溶劑中測試了探針1 的熒光光譜，如圖3A所示，探針1 僅在含有10%DMSO的水溶液中顯示出很強的熒光發(fā)射。這是由于探針1僅溶于常見的有機溶劑，不良溶劑（水）會誘導(dǎo)其產(chǎn)生聚集，導(dǎo)致熒光增強。探針1 在不同比例的DMSO和水的混合溶劑中的熒光光譜顯示（圖3B），隨著混合溶劑中水體積分數(shù)的增加，探針1 在500 nm處的熒光強度逐漸增強，呈綠色熒光。當水的體積分數(shù)達到90%時，探針1的熒光強度最大，是其在純DMSO溶劑中熒光強度的60倍（圖3C），當水的體積分數(shù)超過90%時，熒光強度有所降低，可能的原因是當混合溶劑中水的含量比較高時，導(dǎo)致溶液聚集成較大的顆粒使熒光強度有所降低。以上結(jié)果均說明探針1表現(xiàn)出良好的AIE特性。

圖3 探針1在不同有機溶劑中（A）及在不同比例的DMSO和水的混合溶劑中（B）的熒光光譜；探針1在DMSO中的發(fā)射強度與H2O體積分數(shù)（%）的函數(shù)關(guān)系（C）Fig.3 The fluorescence spectra of the probe 1 in different organic solvents（A）and in mixed solvent with different ratios of DMSO and water（B）；the emission intensity of the probe 1 in DMSO as a function of H2O（%）（C）inset：the fluorescence photograph by a 365 nm UV lamp

以硫酸奎寧（0.1 mol/L 硫酸溶液，ΦF=0.56）為參照物，測量了探針1 在純DMSO 溶劑和混合溶劑DMSO-H2O（1∶9）中的量子產(chǎn)率，基于以下公式進行計算：Φx=Φst（Ix/Ist）（η2x/η2st）（Ast/Ix）（x、st分別為被測物質(zhì)和參照物；Φ、I、A、η分別為量子產(chǎn)率、熒光積分面積、吸光度和溶劑折射率）。結(jié)果表明，探針在混合溶劑DMSO-H2O（1∶9）溶液中的相對量子產(chǎn)率（0.532）明顯高于純DMSO（0.065）。

通過掃描電子顯微鏡對探針的形貌進行表征，如圖4 所示，隨著混合溶劑中水體積分數(shù)的增加，探針1的形態(tài)從片狀變?yōu)槎询B簇狀，這表明不良溶劑（水）誘導(dǎo)探針發(fā)生聚集，導(dǎo)致熒光增強。探針1的分散粒徑圖也證實了其AIE 特性，如圖5A 所示，純DMSO 中探針的粒徑非常小，然而隨著水體積分數(shù)的增加其粒徑顯著增大，這說明探針1發(fā)生了聚集。

圖4 探針1（20 μmol/L）在不同混合溶劑中的SEM形貌圖像Fig.4 SEM images of the probe 1（20 μmol/L）in different mixed solvent A-C：water content were 0%，50%，99%，respectively

圖5 探針1在純DMSO和混合溶劑（DMSO-H2O，1∶9）中的DLS分析（A）；探針1在水溶液中的電子云軌道圖（B）；探針1在不同有機溶劑中的紫外吸收光譜（C）Fig.5 The DLS analysis of the probe 1 in pure DMSO and in mixed solvent（DMSO-H2O，1∶9）（A）；the electronic cloud orbital diagrams of the probe 1 in aqueous solution（B）；the UV absorption spectra of the probe 1 in different organic solvents（C）

從探針分子結(jié)構(gòu)分析，探針的AIE 特性可能歸因于ESIPT 和RIR 效應(yīng)。探針分子本身具有高度平面的剛性結(jié)構(gòu)，在DMSO-H2O（1∶9）混合溶劑中，探針中的鄰羥基和羰基分別作為供體和受體形成氫鍵［17-18］，一方面激活了ESIPT［19］；另一方面，探針1 的剛性和π 共軛進一步增強，探針分子旋轉(zhuǎn)受限，無輻射消耗能量，熒光增強。

為進一步探究探針AIE 特性的發(fā)光機理，采用Gaussian 09 程序包，使用B3LYP/6-31G 基組基于DFT 計算方法對探針1 和探針1 + Cu2+進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。結(jié)果顯示（圖5B）探針1 中最高占據(jù)分子軌道（HOMO）的電子密度位于苯環(huán)和乙氨基上，最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）的電子云位于水楊醛和碳酰肼上，這說明鄰羥基和苯基與亞氨基部分的吸電子作用導(dǎo)致分子內(nèi)電荷從苯乙胺基團轉(zhuǎn)移到鄰羥基和苯基。電子云密度的這種變化與探針1 的紫外吸收光譜（圖5C）變化一致，即探針1 在DMSO-H2O（1∶9）混合溶劑中的吸收峰相較于純有機溶劑中明顯減弱，這歸因于分子聚集態(tài)光散射。

2.2 探針1+Cu2+對H2S的傳感性能及機理研究

探針1是典型的席夫堿化合物，含有N、C和O 等結(jié)合位點，是潛在的金屬離子螯合劑［20］。通過光譜測試觀察探針1與各種金屬離子的結(jié)合情況（圖6A），發(fā)現(xiàn)探針1（20 μmol/L）的熒光僅能被Cu2+猝滅。隨著Cu2+濃度的增加，探針1 的熒光強度逐漸減弱并在Cu2+濃度為20 μmol/L 時達到熒光猝滅平衡（圖6B），表明探針1 與Cu2+的結(jié)合比例為1∶1，猝滅率為85%，這說明探針1 能選擇性地與Cu2+絡(luò)合。通過等摩爾連續(xù)變化法（Job's-Plot）（圖6B 插圖上圖）進一步證明了探針1 與Cu2+以1∶1 的方式配位結(jié)合。從1H NMR 譜（圖7）可以推測其結(jié)合機理：探針1 在水溶液中易形成氫鍵，激發(fā)ESIPT 效應(yīng)使其結(jié)構(gòu)剛性增強，熒光發(fā)射增強。加入Cu2+后，探針1 與Cu2+結(jié)合，羥基的H1（10.37）消失，胺的H2 向高場移動，苯環(huán)對應(yīng)的7.33 ～6.11 處的氫有小幅移動，表明羥基和胺基的氮原子參與了與Cu2+的結(jié)合，導(dǎo)致分子內(nèi)氫鍵破壞，限制了ESIPT 過程從而使熒光猝滅。再添加HS-后，Cu2+與HS-具有更強的結(jié)合力，使H2又移回低場，ESIPT效應(yīng)重新恢復(fù)，熒光發(fā)射恢復(fù)增強。

圖6 在PBS緩沖溶液中加入各種離子后探針1的熒光光譜（A）；添加Cu2+離子后探針1的熒光“關(guān)閉”（B）；探針1、探針1+Cu2+、探針1+Cu2++HS-在PBS緩沖溶液中的熒光光譜（C）Fig.6 Fluorescence spectra of probe 1 after adding various ions in PBS buffer solution（A）；fluorescence“turn off”of the probe 1 with the addition of Cu2+ion（B）；the fluorescence spectra of the probe 1，the probe 1+Cu2+，the probe 1+Cu2++HS-in PBS buffer solution（C）inset C：the fluorescence change by a 365 nm UV lamp

圖7 探針1、探針1+Cu2+、探針1+Cu2++HS-在DMSO-D6中的1H NMR分析Fig.7 The1H NMR spectra analysis of the probe 1，the probe 1+Cu2+，the probe 1+Cu2++HS-in DMSO-D6

在PBS（pH 7.4）-DMSO（體積比9∶1）中，探針1（20 μmol/L）可發(fā)出亮綠色熒光，加入等量Cu2+后，熒光幾乎被猝滅。進一步加入HS-，熒光強度明顯恢復(fù)增強。在365 nm 紫外燈下可以清楚地觀察到探針1的熒光變化（圖6C）。此外，在相同條件下添加200 μmol/L 的其它競爭分析物（HS-、F-、Cl-、Br-、I-、S2-、CH3COO-、PO34-、OH-、ClO-、CO23-、HPO24-、HCO-3、SO23-、HSO-3、GSH、Hcy），體系熒光幾乎沒有變化，只有添加HS-后熒光強度明顯增強，表明探針1 + Cu2+對HS-具有高度選擇性（圖8A）。當存在其它競爭分析物時，添加特定量的HS-仍然使得探針熒光增強，證實探針1 具有優(yōu)良的抗干擾性（圖8B）。值得注意的是，I-的存在并不干擾檢測，這可能是因為CuS的KS（P沉淀平衡常數(shù)）小于CuI的KSP［21］。

圖8 在PBS緩沖溶液中加入各種競爭分析物后探針1+Cu2+的熒光光譜（A）；依次添加各種相關(guān)競爭分析物以及HS-后探針1+Cu2+在PBS溶液中的發(fā)射強度變化（B）Fig.8 The fluorescence spectra of the probe 1+Cu2+with addition of various competitive analytes in PBS buffer solution（A）；emission strength changes of the probe 1+Cu2+in PBS solution with sequential adding various relevant competitive analytes and HS-（B）

2.3 探針1+Cu2+對HS-的熒光響應(yīng)

在PBS（pH 7.4）-DMSO（體積比9∶1）體系中，加入等體積不同濃度的HS-，進行探針1 + Cu2+（20 μmol/L）的熒光滴定實驗（圖9）。結(jié)果顯示隨著HS-濃度的增加，探針1+Cu2+的熒光強度在HS-濃度0～25 μmol/L 內(nèi)呈線性增強，線性方程為y=23.32x+99.77，相關(guān)系數(shù)r2=0.991 8。根據(jù)公式D=3σ/k計算得到檢出限為0.27 μmol/L。值得一提的是，將HS-加入探針1+Cu2+后，在30 s 內(nèi)500 nm 處的熒光強度逐漸增強并趨于穩(wěn)定，說明探針1 具有快速實時靈敏檢測HS-的優(yōu)勢。目前能夠快速實時檢測H2S的熒光探針鮮少報道（表1）。

表1 與檢測H2S 的其他熒光探針的比較Table 1 Comparison of other probes for H2S detection

2.4 實際應(yīng)用

2.4.1 H2S 實時檢測試紙的制備基于探針1 對H2S 的快速靈敏檢測，制備了簡單、便攜、經(jīng)濟的檢測試紙。將空白濾紙浸泡在探針1 + Cu2+（0.2 mmol/L）的PBS（pH 7.4）-DMSO（體積比9∶1）溶液中，在室溫下自然干燥，然后浸泡在含有不同濃度H2S（0、 0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.30、 0.40、0.50 mmol/L）的溶液中。隨著H2S 濃度的增加，在365 nm 紫外燈下，觀察到檢測試紙熒光明顯從無色（由于白色濾紙在紫外燈照射下而呈現(xiàn)藍色）變?yōu)榫G色（圖9）?；诖朔椒?，通過熒光圖像和智能電子設(shè)備掃描，可制造視覺傳感器并用于H2S的實時在線高效檢測。

圖9 基于探針1的H2S檢測試紙的熒光圖片F(xiàn)ig.9 The fluorescence photo of the filter paper based the probe 1 to detect H2S

2.4.2 探針1 + Cu2+檢測實際酒液樣品中的H2S據(jù)報道，H2S 不僅會影響白酒質(zhì)量，甚至?xí)?dǎo)致白酒變質(zhì)。采用探針1檢測酒中的H2S濃度。酒液樣品從臨汾便利店購買。將樣品稀釋100倍，即可制備DMSO-酒（1∶9，體積比）溶液。將探針1+Cu2+添加到處理過的實際樣品中，添加不同濃度的H2S（分別為0、5.00、10.00 μmol/L）。如表2所示，所有樣品中均檢測到H2S，包括白酒（1.24 μmol/L）、蘋果酒（5.05 μmol/L）、啤酒（1.73 μmol/L）。根據(jù)標準回收方法，3 種樣品的回收率為95.2%～113%，表明探針1可用于實際酒液樣品中H2S的檢測。

表2 白酒、蘋果酒和啤酒中H2S含量的測定Table 2 Detection of H2S levels in spirit，cider and beer

2.4.3 生物熒光成像首先，通過3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）實驗評估探針1的細胞毒性。以正常細胞為對照，將探針1與細胞孵育20 h以上，細胞存活率超過85%，表明探針1對細胞的毒性非常低，可進一步用于細胞成像。HeLa細胞與探針1（50 μmol/L）孵育1 h后，在共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)亮綠色熒光。將上述HeLa 細胞立即與Cu2+（50 μmol/L）孵育1 h，細胞內(nèi)熒光消失，表明探針1的熒光強度因探針1與Cu2+的結(jié)合而猝滅。為檢測細胞內(nèi)的H2S，在上述細胞中加入50 μmol/L HS-，于顯微鏡下觀察到亮綠色的細胞內(nèi)熒光（圖10）。由于生物體內(nèi)的內(nèi)源性H2S 均來源于半胱氨酸蛋白水解酶或其衍生物，因此將生物硫醇抑制劑N-乙基馬來酰亞胺（NEM，50 μmol/L）加入上述細胞中作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞熒光消失，進一步證實細胞內(nèi)的硫醇被NEM 抑制和破壞。以上結(jié)果表明探針1可以選擇性地檢測細胞中的外源性硫化氫。

圖10 活HeLa細胞與探針1（A）、探針1+Cu2+（B）、探針1+Cu2++HS-（C）、探針1+Cu2++HS-+NEM（D）的熒光成像Fig.10 The fluorescence imaging of living HeLa cells incubated with the probe 1（A），the probe 1+Cu2+（B），the probe 1+Cu2++HS-（C），the probe 1+Cu2++HS-+NEM（D）light field images（a，d，g，j）；fluorescence images（b，e，h，k）；overlay images（c，f，i，l）

2.5 邏輯門的設(shè)計與應(yīng)用

基于探針1 檢測H2S 的優(yōu)越性，將探針1 應(yīng)用于邏輯門領(lǐng)域。設(shè)置兩個輸入信號：H2S（input 1）和HSO-3/SO2-3/S2-（input 2），探針1 在500 nm 處的熒光信號被定義為輸出信號。共進行4 種不同的設(shè)置（圖11）：H2S 存在（賦值1），但HSO-3/SO2-3/S2-不存在（賦值0）；H2S 存在，HSO-3/SO2-3/S2-存在；H2S 不存在，HSO-3/SO2-3/S2-不存在；H2S 不存在，HSO-3/SO2-3/S2-存在。當（input 1，input 2）為（1，0），（1，1）時，550 nm 處的輸出發(fā)射強度為“1”；當（input 1，input 2）為（0，1），（0，0）時，550 nm 處的輸出發(fā)射強度為“0”，說明H2S是唯一能激活探針1熒光發(fā)射的因素。

圖11 探針1+Cu2+加入S2-、SO23 -、HSO-3、H2S后的熒光光譜（A）；兩個輸入系統(tǒng)的邏輯門行為（B）；邏輯門的真值表（C）Fig.11 The fluorescence spectra of the probe 1+Cu2+upon addition of S2-，SO2 -3 ，HSO-3，H2S（A）；logic gate behavior from two input systems for constructed（B）；the truth table for the logic gate（C）

3 結(jié) 論

本文基于聚集誘導(dǎo)熒光增強以及ESIPT 效應(yīng)設(shè)計了一種新型活性探針1，并將其用于H2S的高靈敏度、選擇性檢測。首先對探針1 的光化學(xué)性質(zhì)及其發(fā)光機理進行了詳盡地討論，并將該探針成功應(yīng)用于酒液樣品中H2S 以及活HeLa 細胞中外源性H2S 的檢測，同時將其用于構(gòu)建邏輯門。基于探針的靈敏性，設(shè)計了簡單便攜的H2S檢測試紙。該研究為設(shè)計基于AIE的新型氣體分子傳感器提供了新思路。