基于GEO 數(shù)據(jù)庫篩選慢性乙型病毒性肝炎患者對干擾素α治療無應(yīng)答相關(guān)的關(guān)鍵免疫基因和通路

吳鳳萍，魯 瑞，劉怡欣，李 梅，石娟娟，黨雙鎖

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710004）

慢性乙型肝炎病毒感染仍然是一個主要的公共健康威脅[1]。目前，臨床中用于治療慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B, CHB）的藥物主要有核苷（酸）類似物和干擾素α（interferon alpha, IFN-α）兩大類。IFN-α 治療CHB 具有療程有限、不產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點，對于部分優(yōu)勢患者，甚至可以實現(xiàn)臨床治愈[2]。然而，CHB 患者對IFN-α 治療的總體應(yīng)答率并不高，HBeAg 轉(zhuǎn) 陰 率 為17.7%～38.7%[3-4]，HBsAg 轉(zhuǎn) 陰 率為8.5%～37.4%[3,5-6]，仍有近50%的患者對IFN-α 治療無應(yīng)答。目前，關(guān)于CHB 患者對IFN-α 治療無應(yīng)答的分子基礎(chǔ)及確切機制仍不清楚。

鑒于IFN-α 無細(xì)胞毒作用，它主要通過調(diào)節(jié)免疫功能而發(fā)揮抗病毒作用[2]。我們推測，在IFN-α 治療前，肝臟中某些免疫基因的表達(dá)狀態(tài)可能在IFN-α 治療CHB 無應(yīng)答中發(fā)揮作用。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，高通量基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)在機制探索和潛在生物標(biāo)志物的鑒定方面開始普及。因此，本研究旨在使用生物信息學(xué)方法篩選與IFN-α 治療CHB 無應(yīng)答相關(guān)的免疫基因和通路，以期探索CHB 患者對IFN-α 治療無應(yīng)答的潛在分子機制，以及為IFN-α 治療CHB 的療效預(yù)測提供可靠的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲取與處理

在GEO 公共數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中以“hepatitis B virus”和“interferon alpha”作為關(guān)鍵檢索詞，選取并下載GSE27555 數(shù)據(jù)集（基于GPL6480 平臺）的芯片數(shù)據(jù)，利用R 軟件（Version 4.0.2;https://mirror.lzu.edu.cn/CRAN/）進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)平臺注釋信息將探針轉(zhuǎn)化為基因名以便進(jìn)行后續(xù)分析。GSE27555 數(shù)據(jù)集包含了13 例CHB 患者在使用IFN-α 治療前的肝臟組織基因表達(dá)信息，其中6 例為IFN-α應(yīng)答者（responders,Rs），7 例為IFN-α非應(yīng)答者（non-responders, NRs）。

1.2 差異免疫基因的篩選

運用R 軟件中的“l(fā)imma”包對Rs 和NRs 間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，并按|logFC|＞1.2，P＜0.05 的閾值標(biāo)準(zhǔn)篩選與IFN-α 治療CHB 無應(yīng)答相關(guān)的差異基因。從免疫相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫ImmPort 官網(wǎng)（https://www.immport.org/home）下載包含1 793 個基因在內(nèi)的標(biāo)志性免疫基因集。利用R 軟件中的“merge”函數(shù)提取差異表達(dá)基因中的免疫基因，得到差異免疫基因。應(yīng)用“ggpubr”包和“pheatmap”包繪制差異免疫基因的火山圖和熱圖。

1.3 功能富集分析

為了探索差異免疫基因顯著富集的功能以更好地了解這些差異免疫基因所參與的重要信號通路，使用R 軟件中的“clusterProfile”包進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析。應(yīng)用Fisher 精確檢驗來評估GO 和KEGG 富集的顯著性，q＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及樞紐基因篩選

為了探索與IFN-α 治療CHB 無應(yīng)答相關(guān)的差異免疫基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，將上一步得到的差異免疫基因?qū)氲鞍紫嗷プ饔脭?shù)據(jù)庫STRING11.5（https://string-db.org/）中，以互作評分＞0.4 為條件來構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步利用Cytoscape 軟件中的Cytohubba 插件對差異免疫基因按Degree、MCC、MNC、Closeness 算法計算評分位于前10 的基因，再取交集，得到樞紐基因（Hub 基因）。

2 結(jié) 果

2.1 差異免疫基因的篩選

運用R 軟件對數(shù)據(jù)集GSE27555 進(jìn)行分析，按|logFC|＞1.2，P＜0.05 的閾值標(biāo)準(zhǔn)共篩選出460 個差異基因，其中上調(diào)基因203 個，下調(diào)基因257 個。從ImmPort 官網(wǎng)下載包含1 793 個基因在內(nèi)的標(biāo)志性免疫基因集。使用R 軟件中的“merge”函數(shù)從上述460個差異基因中提取了88 個差異免疫基因，其中上調(diào)的免疫基因為13 個，下調(diào)的免疫基因為75 個。差異免疫基因的火山圖和熱圖分別見圖1、圖2。從熱圖中可以發(fā)現(xiàn)所篩選的差異免疫基因可以很清楚地將Rs 和NRs 區(qū) 分 開。

圖1 GSE27555 數(shù)據(jù)集差異表達(dá)免疫基因的篩選Fig.1 Screening of differentially expressed immune genes in GSE27555 dataset

圖2 GSE27555 數(shù)據(jù)集差異表達(dá)免疫基因的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of differentially expressed immune genes in GSE27555 dataset

2.2 差異免疫基因的功能富集分析

GO 功能富集分析顯示，上述這88 個差異免疫基因主要富集于T 細(xì)胞活化、細(xì)胞趨化性、細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、粒細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞趨化性、T 細(xì)胞活化的正向調(diào)控、髓系白細(xì)胞遷移、白細(xì)胞趨化性、趨化因子介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞對趨化因子的應(yīng)答、通過MHCⅡ類分子對抗原進(jìn)行加工和提呈等免疫應(yīng)答過程中（圖3）。KEGG 分析顯示，上述這88 個差異免疫基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，Th17、Th1 和Th2 細(xì)胞分化，抗原加工和提呈，病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用，趨化因子信號通路，T 細(xì)胞受體信號通路，IL-17 信號通路，自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，Toll 樣受體信號通路等免疫應(yīng)答信號通路中（圖4）。

圖3 差異表達(dá)免疫基因的GO 分析Fig.3 GO analysis of differentially expressed immune genes

圖4 差異表達(dá)免疫基因的KEGG 富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed immune genes

2.3 差異表達(dá)免疫基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub 基因篩選

使用STRING 在線工具構(gòu)建上述88 個差異免疫基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，在隱藏掉與其他節(jié)點無交互作用的節(jié)點后，所得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)由84 個蛋白節(jié)點和533 條邊組成（圖5）。

圖5 差異免疫基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The PPI network of differentially expressed immune genes

采用Cytoscape 軟件中的Cytohubba 插件中的Degree、MCC、MNC、Closeness 4 種不同算法計算評分位于前10 的基因，再取其交集，最終確定了7 個Hub基因，分別為CD8A、IFNG、CCL2、CCL5、CXCL10、CCL4、FCGR3A（圖6），而這7 個Hub 基因在NRs 中表達(dá)均為下調(diào)（表1，表中展示結(jié)果為按Degree 算法所得到的評分）。

圖6 使用Cytohubba 插件中4 種不同算法所確定的7 個Hub 基因Fig. 6 Seven Hub genes identified by using four different algorithms in the Cytohubba plugin

表1 使用Cytohubba 插件中4 種不同算法所確定的7 個Hub基因Tab. 1 Seven Hub genes identified by using four different algorithms in the Cytohubba plugin

3 討 論

IFN-α 是治療CHB 的一線藥物，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重功效[7]。然而，CHB 患者對IFN-α 治療的總體應(yīng)答率并不高，仍有近50%的患者對IFN-α治療無應(yīng)答，而且IFN-α 治療的副作用多，治療費用較貴。因此，尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測CHB 患者對IFN-α治療應(yīng)答情況的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。本研究旨在運用生物信息學(xué)分析的方法篩選出Rs 和NRs 之間的差異免疫基因，進(jìn)而探索與CHB 患者對IFN-α 治療無應(yīng)答相關(guān)的生物標(biāo)志物及信號通路，從而為IFN-α治療CHB 療效的預(yù)測提供潛在依據(jù)。

本研究利用GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE27555 數(shù)據(jù)集，對6 例Rs 和7 例NRs 的肝臟組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)免疫基因。最終篩選出88 個差異免疫基因，包括13 個上調(diào)基因和75 個下調(diào)基因。熱圖顯示這些差異免疫基因可以很清楚地將Rs和NRs 區(qū)分開，提示這些基因可能參與了CHB 患者對IFN-α 治療應(yīng)答的過程，可以作為預(yù)測CHB 患者對IFN-α 治療應(yīng)答情況的潛在生物標(biāo)志物。

GO 分析和KEGG 富集分析表明，這些差異免疫基因主要在T 細(xì)胞活化，粒細(xì)胞的趨化、遷移，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞分化，抗原加工和提呈，病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用，趨化因子信號通路，T 細(xì)胞受體信號通路，IL-17 信號通路，NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，Toll 樣受體信號通路等方面顯著富集，提示宿主的免疫反應(yīng)在IFN-α 治療CHB 的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

本研究進(jìn)一步運用Cytohubba 插件中的4 種不同算法（Degree、MCC、MNC、Closeness）對這些差異免疫基因的評分進(jìn)行計算，篩選了7 個Hub 基因（CD8A、IFNG、CCL2、CCL5、CXCL10、CCL4、FCGR3A）。CD8A是編碼CD8α鏈的基因，主要在細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）表面表達(dá)，在NK 細(xì)胞和DC 細(xì)胞中也可檢測到表達(dá)，因此CD8A 的基因表達(dá)可能是免疫細(xì)胞浸潤的可測量指標(biāo)[8-9]。CD8+CTL 在細(xì)胞免疫系統(tǒng)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CCL2、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10 均屬于趨化因子亞家族成員，是一組能夠作用于G 蛋白耦聯(lián)受體的細(xì)胞因子超家族成員，參與淋巴細(xì)胞的活化和游走、白細(xì)胞的吞噬等免疫應(yīng)答過程[10-13]。IFNG 基因編碼生成的IFNγ 蛋白是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14]。FCGR3A 基因編碼Fcγ 受體3A，也稱為CD16，是結(jié)合IgG 抗體Fc 段的受體，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞膜上，像橋梁一樣介導(dǎo)特異性抗體和效應(yīng)細(xì)胞之間的連接，將體液免疫和細(xì)胞免疫緊密關(guān)聯(lián)起來[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Rs 和NRs 中，上述這7 個免疫基因的表達(dá)水平存在顯著差異，表明這些免疫基因具有成為預(yù)測CHB 患者對IFN-α 治療應(yīng)答情況的生物標(biāo)志物的潛能。

本研究使用一系列的生物信息學(xué)技術(shù)來分析Rs和NRs 的肝臟組織基因表達(dá)信息。本研究仍存在一些 局 限 性：一 方 面，GSE27555 數(shù) 據(jù) 集 中Rs 和NRs 的病例數(shù)較少，而且GEO 數(shù)據(jù)庫中關(guān)于IFN-α 治療CHB 的數(shù)據(jù)集較少，因此，本研究所篩選出的Hub 基因有待在后續(xù)研究中擴大樣本量來進(jìn)一步驗證。另一方面，本研究僅篩選出了7 個Hub 基因，以及富集了一些可能的信號通路，而這些Hub 基因影響CHB患者對IFN-α 治療應(yīng)答的具體機制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

總之，本研究基于GEO 數(shù)據(jù)庫運用生物信息學(xué)方法篩選出了Rs 和NRs 肝臟組織的88 個差異免疫基因以及與CHB 患者對IFN-α 治療無應(yīng)答相關(guān)的7 個Hub 基因。這些免疫基因可能成為預(yù)測CHB 患者對IFN-α 治療應(yīng)答情況的潛在生物標(biāo)志物，為個體化、精準(zhǔn)化使用IFN-α 治療CHB 提供了科學(xué)依據(jù)。而這些基因及其確切的分子機制有待在后續(xù)大樣本研究中進(jìn)一步探索和驗證。