高原人群CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性及其與華法林用藥劑量的相關性研究

胡建鵬，李云，熊倩，李宏偉，陳坤前，高連灝，陳一非，李秀萍，王俊玲

（曲靖市第一人民醫(yī)院1.檢驗中心，2.麻醉科，3.心臟血管外科，4.神經(jīng)介入科，云南曲靖 655000）

華法林是一種雙香豆素衍生物[1]，通過抑制維生素K 及其環(huán)氧化物的相互轉化而發(fā)揮抗凝作用。主要適用于預防和治療血栓栓塞性疾病（深靜脈血栓、肺動脈栓塞、腦梗死、心房顫動、瓣膜?。?，心臟瓣膜置換術，以及心腔內血栓形成等抗凝治療。但由于華法林治療窗口窄，劑量變異性大，與其他藥物和食物相互作用，需要實驗室監(jiān)測，血藥濃度過高或敏感性增加可導致嚴重出血事件等，因此在中國的使用率較低[2-3]。

高原地區(qū)的特征為低壓、低氧、高寒及強輻射，在此環(huán)境下長期生活會導致患者機體各系統(tǒng)特別是血液、呼吸、心血管、內分泌等產生一系列病理和生理變化，進而影響藥物的體內代謝過程。高原環(huán)境主要影響高血漿蛋白結合藥物的藥代動力學（PK）[4]。華法林與血漿蛋白（主要是白蛋白）結合率高達98%～99%，但只有游離華法林能發(fā)揮抗凝作用，因此，影響華法林與血漿蛋白結合的因素都可能直接影響華法林的抗凝療效。

在臨床實踐中，如何綜合考慮遺傳與環(huán)境因素，使華法林抗凝治療劑量更加準確，從而降低治療過程中的風險，使患者最大程度受益，是臨床醫(yī)師面臨的共同問題。目前，為了實現(xiàn)華法林精準用藥，國內外已建立了多種華法林給藥劑量預測模型，這些模型大多基于CYP2C9 和VKORCl基因多態(tài)性，部分模型還將CYP4F2、EPHX1及GGCX基因納入考慮，綜合患者種族、性別、年齡、體重、疾病、是否合用肝酶誘導劑、胺碘酮等因素進行多因素回歸分析。所建模型對華法林個體劑量差異的解釋程度為20%～70%不等[5-12]。曲靖地處云貴高原中部，平均海拔2 000 m。本研究旨在分析高原地區(qū)基因組給藥模型預測劑量的準確性及臨床應用價值，供臨床醫(yī)師參考。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器生物安全柜（美國Thermo 公司）；高速離心機（德國Sigma 公司）；伯樂CFX96 實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；MK-20 振蕩恒溫加熱器、OneDrop 紫外分光光度計、立式壓力蒸汽滅菌器（日本Yamato 公司）；凈化工作臺（SWCJ-2FD 蘇州安泰公司）；Eppendorf 可調移液器。

1.1.2 主要試劑天根血液基因組DNA 提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit DP318）、人類CYP2C9& VKORC1 基因多態(tài)性檢測試劑盒購自武漢友芝友公司。

1.2 標本收集

收集曲靖地區(qū)2016年10月—2020年1月375 例行華法林代謝基因多態(tài)性檢測的患者。主要包括深靜脈血栓、肺栓塞、腦梗死、冠狀動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺疾病，經(jīng)及心臟瓣膜置換術后等心腦血管疾病患者。采集EDTA-K2抗凝全血2 mL，2～8℃保存不超過1 個月，檢測后DNA 和全血標本-80℃保存2年以備復查。記錄患者性別、年齡、身高、體重、吸煙史、合并房顫、置換主動脈瓣膜等基本信息，以及臨床合并用藥情況。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（C2018013），患者簽署知情同意書。

1.3 試驗方法

使用離心柱吸附法提取人外周血細胞中基因組DNA，所提取DNA 用OneDrop 紫外分光光度計測定濃度及純度，要求DNA 的A260/280 在1.8～2.0。使 用 qRT-PCR 法 檢 測 CYP2C9*3 （A1075C，rs1057910）和VKORC1（G-1639A，rs9923231）基因多態(tài)性。

1.4 基于藥物基因組學的華法林劑量預測公式

使用國家衛(wèi)生健康委員會（National Health Commission，PRC）2015年發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）》推薦的基于中國人群華法林用藥劑量計算公式和國際華法林遺傳藥理學協(xié)會（The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, IWPC）推薦的亞裔人群華法林劑量預測公式計算華法林預測劑量（見表1）。按照中國醫(yī)生華法林用藥習慣，3 mg/片規(guī)格片劑最常用，每次調整劑量1/4 片，因此，當維持劑量與預測劑量相差≤0.75 mg 時，判定為在預測范圍內。

表1 兩種華法林劑量預測公式

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用Excel 和IBM SPSS Statistics 23 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；華法林預測與實際維持劑量的相關性分析采用Pearson 法，并用χ2檢驗驗證CYP2C9*3 和VKORC1 基因型檢測結果是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基本信息

行基因檢測的375 例患者中，182 例未服用華法林，193 例服用了華法林。服用華法林患者收集到初始劑量，其中174 例收集到維持劑量相關數(shù)據(jù)。將服用華法林者、未服用華法林者及收集到華法林維持劑量者的基本信息進行比較，可知患者實際治療過程中是否選擇服用華法林進行抗凝，通常與患者的性別構成、身高、吸煙史、是否合并房顫、是否注射低分子肝素鈣無關（P＞0.05），而與患者年齡、體重、體表面積（BSA）、初始國際標準化比值（INR）、是否置換主動脈瓣膜，以及是否服用阿司匹林、利伐沙班或氯吡格雷相關（P＜0.05）。

表2 受試者基本特征

2.2 所有患者基因分型分布情況

行基因檢測的375 例患者中，CYP2C9基因*1/*1（AA）、*1/*3（AC）及*3/*3（CC）基因型頻率分別為93.07%（349/375）、6.93%（26/375）和0.00%（0/375）。VKORC1-1639基因AA、AG 及GG 基因型頻率分別為82.66%（310/375）、16.27%（61/375）和1.07%（4/375）。因此，CYP2C9*1 等位基因頻率為96.54%，CYP2C9*3 等位基因頻率為3.46%。VKORC1-1639 A等位基因頻率為90.79%，VKORC1-1639 G 等位基因頻率為9.21%。χ2檢驗結果表明，CYP2C9*3A＞C 和VKORC1-1639G＞A 基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=0.021 和0.177，P=0.885 和0.915）。所有患者的基因型分布和預測劑量見表3。

表3 375例患者CYP2C9＊3和VKORC1（-1639 G＞A）基因型分布頻率 例（%）

2.3 所有患者兩種模型預測劑量情況

行基因檢測的375 例患者根據(jù)檢測結果并結合患者基本信息，用兩種模型預測華法林劑量。結果發(fā)現(xiàn)，所有基因型組合PRC 和IWPC 模型預測劑量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因攜帶CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA 基因型患者最多，占77.07%（289/375），以其為對照組。統(tǒng)計結果顯示，無論是使用PRC 還是IWPC 模型，CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AG組、CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG 組和CYP2C9*1/*3& VKORC1 AA 組預測劑量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AG組預測劑量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。經(jīng)多重比較發(fā)現(xiàn)，其他所有基因型組合預測劑量兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 375例患者不同基因型組合預測劑量情況 （mg/d，±s）

表4 375例患者不同基因型組合預測劑量情況 （mg/d，±s）

注：?與CYP2C9（*1/*1）&VKORC1（-1639G＞A）AA比較，P ＜0.05。

基因型組合n 預測劑量CYP2C9*1/*1&VKORC1（-1639G＞A）AA CYP2C9*1/*1&VKORC1（-1639G＞A）AG CYP2C9*1/*1&VKORC1（-1639G＞A）GG CYP2C9*1/*3&VKORC1（-1639G＞A）AA CYP2C9*1/*3&VKORC1（-1639G＞A）AG P 值0.992 0.977 0.171 0.733 0.538 289 56 4 21 5 PRC 2.90±0.49 4.22±0.50?5.61±0.86?2.02±0.34?3.04±0.33 IWPC 2.90±0.71 4.22±0.83?7.39±1.98?1.97±0.46?2.87±0.51 t 值-0.010 0.290 1.644-0.344-0.644

2.4 不同CYP2C9&VKORC1 基因型組合的華法林劑量

對CYP2C9 & VKORC1 不同基因型組合PRC 和IWPC 模型預測劑量和維持劑量分析發(fā)現(xiàn)，除CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA 組的PRC 模型預測劑量低于維持劑量以外，其他所有基因型組合的IWPC 和PRC 模型的預測劑量均高于維持劑量，尤其是CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA 和CYP2C9*1/*1 &VKORC1 AG 基因型患者預測劑量均高于維持劑量（P＜0.05），其他基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各基因型兩種模型預測劑量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因攜帶CYP2C9*1/*1& VKORC1 AA 基因型患者最多，占78.16%（136/174），以其為對照組。統(tǒng)計結果顯示，CYP2C9*1/*1& VKORC1 AG 和CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG 組維持劑量分別為（3.41±1.01）mg 和（4.75±0.35）mg，均高于CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA 組（2.59±0.73）mg（P＜0.05）；CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA 組維持劑量為（2.00±0.53）mg，低于所有其他基因型組合（P＜0.05）；CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AG 基因型僅1 例患者收集到維持劑量，不納入比較。本研究中攜帶CYP2C9*3 等位基因的患者預測準確性最高，IWPC和PRC 模型分別為100%（6/6）和83.33%（5/6）。PRC 模型預測準確性為72.99%（127/174），其中CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA 基因型患者136 例，有106 例在預測范圍內，預測準確性為77.94%（106/136）。IWPC 模型預測的準確性為62.64%（109/174），其中CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA 基因型患者136 例，有91 例在預測范圍內，預測準確性為66.91%（91/136）。見表5和圖1。

圖1 不同基因型華法林預測劑量與維持劑量比較（±s）

表5 不同CYP2C9&VKORC1基因型患者華法林劑量情況

2.5 IWPC 和PRC 模型預測劑量與維持劑量相關性分析

將收集到維持劑量的174 例患者維持劑量設置為橫坐標，預測劑量分別設置為縱坐標，繪制散點圖，并添加趨勢線，對兩個模型的預測劑量與維持劑量進行相關性分析，得到PRC 模型Pearson 相關系數(shù)r1=0.546，決定系數(shù)R12=0.298；IWPC 模型Pearson相關系數(shù)r1=0.567，決定系數(shù)R22=0.322。如圖2所示，圖中虛線為理想預測劑量（預測劑量=維持劑量），實線為兩個模型華法林預測劑量趨勢線。

圖2 華法林兩種預測模型預測劑量與維持劑量的相關性

3 討論

自周宏灝院士在國際上首次發(fā)現(xiàn)和闡明了遺傳因素引起藥物種族和個體差異的若干現(xiàn)象和機制及其規(guī)律，建立了有國家和民族特色的遺傳藥理學理論體系，開拓了我國藥物基因組學研究領域，率先提出和推動“量體裁衣”個體化藥物精準治療以來，國內外大量研究將基因型與其他相關影響因素聯(lián)合進行統(tǒng)計分析，建立基于基因組學的華法林劑量預測模型，并對所建模型進行回顧性和前瞻性驗證。

本研究通過回顧性分析，利用權威報道的PRC和IWPC 模型，對高原人群基于基因組學的華法林劑量預測模型進行有效性驗證。通過檢測CYP2C9*3（A1075C， rs1057910） 和 VKORC1 （G-1639A，rs9923231）基因多態(tài)性，綜合患者的性別、年齡、身高、體重、合并用藥、房顫和置換主動脈瓣膜與否，以及合并用藥等因素，發(fā)現(xiàn)PRC 和IWPC 模型分別可解釋29.8%和32.2%的給藥劑量個體差異，且預測劑量與實際維持劑量呈正相關（r1=0.546，r2=0.567），與已有文獻報道符合[13]。但總體上華法林預測劑量與實際維持劑量存在偏差，CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA 和CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AG 基因型患者預測劑量均顯著高于維持劑量。經(jīng)分析，導致預測劑量高于實際維持劑量的原因主要有以下幾個方面：①建立模型時病例來源人群與該研究納入人群的基本特征背景存在差異。②建立模型時未將高原特殊環(huán)境影響因素納入考慮，高原地區(qū)因其低壓、低氧、高寒、強輻射及血氧飽和度較低等特點，影響華法林與血漿蛋白（主要是白蛋白）結合，血液中游離華法林含量增加，對華法林的需求量降低。③樣本量較小，實驗結果存在一定局限性。④我國機械瓣膜置換術后的抗凝強度標準低于指南推薦范圍[14]。⑤華法林治療窗口窄，起效緩慢，醫(yī)生在使用過程中極為謹慎。

預測模型的解釋性低也提示可能還存在其他遺傳和非遺傳因素的影響[15]。已有文獻報道，華法林的劑量還受APOE、EPHX1、CYP4F2、GGCX、CYP3A4、CYP1A2、UGT1A1、CYP2C19、NQO1等基因的影響[16-17]。另外，生活方式、飲食習慣、聯(lián)合用藥、病理生理狀態(tài)等非遺傳因素對華法林抗凝療效也有顯著影響。如胺碘酮、甲硝唑、環(huán)丙沙星、吡羅昔康、奧美拉唑、龜苓膏等藥物可增強華法林抗凝作用，而利福平、利巴韋林、灰黃霉素、奈夫西林、消膽胺、美沙拉嗪、巴比妥類、卡馬西平、維生素K 等藥物可抑制華法林抗凝作用[3]。吸煙、發(fā)熱、飲酒、腹瀉等也可抑制華法林抗凝作用[18]。

本研究置換了主動脈瓣膜的20 例患者中18 例選擇服用華法林進行抗凝，占90%，說明臨床醫(yī)師在選擇抗凝藥物時，患者是否置換主動脈瓣膜是一個極其重要的決定指標。此外，服用華法林組患者體重、BSA 及年齡均低于未服用華法林組，說明臨床醫(yī)生可能對預測劑量偏低且年齡較小的患者更偏向選擇華法林，而對于預測劑量較高、年齡偏大的患者使用華法林時會更為謹慎。同時，使用氯吡格雷的患者主要來自于神經(jīng)介入科，通常不合并使用華法林。而使用利伐沙班和低分子肝素鈣的患者主要來自于心臟血管外科，因華法林達到有效血藥濃度需要72 h 左右，因此通常需要先用低分子肝素鈣重疊3 d。對于未服用華法林的患者，通常會選擇利伐沙班、阿司匹林或氯吡格雷進行治療。

本研究目前仍在繼續(xù)對不同病歷資料和臨床終點事件進行收集，雖然可解釋性有限，但獲取遺傳和非遺傳信息可以為臨床醫(yī)生在使用和調整藥物劑量時提供參考，對于攜帶VKORC1-1639 G等位基因的患者可從更高劑量開始，調整劑量時也可更加大膽，縮短達到目標INR 值所需時間。而對于攜帶CYP2C9*3 等位基因的患者，則需更加謹慎，從更小劑量開始服用以降低出血風險。研究結果已經(jīng)提示使用華法林前先對患者進行相關基因檢測可對臨床抗凝治療的有效性和安全性產生積極影響。鑒于已有報道不同海拔健康人群凝血功能隨著海拔高度的升高而發(fā)生改變[凝血酶原時間（PT）、部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）逐漸延長，而纖維蛋白原（Fib）含量逐漸下降][19-20]，在進一步的研究中，本課題組將構建更大的樣本數(shù)據(jù)庫，納入患者長期居住地海拔、血氧飽和度、凝血指標、民族、同型半胱氨酸（Hcy）、聯(lián)合使用氯吡格雷、低分子肝素鈣或利伐沙班等遺傳和非遺傳信息，以建立適合于高原民族地區(qū)的華法林劑量預測模型，同時為發(fā)掘新的適合中國人的華法林劑量預測公式奠定基礎，使研究成果惠及更多患者。