NR4A家族蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展*

蔣龍英，陳永恒

[中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科（國(guó)家衛(wèi)健委腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），湖南長(zhǎng)沙 410008]

核受體（nuclear receptor, NR）是一類廣泛分布在細(xì)胞內(nèi)的真核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控多種關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，參與人體炎癥、免疫反應(yīng)，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多種病理生理過(guò)程[1]。迄今為止，在人體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了48 種核受體蛋白。根據(jù)其功能的不同被分為7 個(gè)亞家族（NR0～NR6），這些蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)域，存在于不同的組織和細(xì)胞中，可通過(guò)與配體結(jié)合，招募輔調(diào)節(jié)因子，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮多種不同的功能[2]。在這些蛋白中，有一類特殊的蛋白，因尚無(wú)內(nèi)源性配體的發(fā)現(xiàn)，而被稱為孤兒核受體（orphan nuclear receptor）。 孤兒核受體第4 亞科A 組（nuclear receptor subfamily 4, group A, NR4A）屬于典型的孤兒核受體家族蛋白，包括NR4A1（Nur77、NGFI-B），NR4A2（Nurr1）和NR4A3（NOR-1）3 個(gè)成員[3]。NR4A是一類即時(shí)的早期反應(yīng)基因，可被胞內(nèi)外多種刺激迅速誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和免疫反應(yīng)，參與腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。本文將從結(jié)構(gòu)和功能兩方面綜述NR4A 家族蛋白的研究進(jìn)展。

1 NR4A 的結(jié)構(gòu)組成及功能

NR4A 蛋白的功能域見圖1：配體非依賴的轉(zhuǎn)錄激活域（AF1, TAD），DNA 結(jié)合域（DBD），鉸鏈區(qū)（hinge region, H），配體結(jié)合域（LBD），配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（AF2）[5]。AF1 域主要通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，調(diào)控激活轉(zhuǎn)錄。DBD 域由兩個(gè)高度保守的C4 鋅指結(jié)構(gòu)及C 末端延伸區(qū)（CTE）組成，其中的N 端的螺旋識(shí)別并結(jié)合在DNA 大溝，CTE 識(shí)別DNA 小溝加強(qiáng)對(duì)DNA 的結(jié)合。DBD 域特異性識(shí)別結(jié)合特定的DNA 序列，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[6]。H 域連接DBD 與LBD，主要參與蛋白的核定位。LBD 由12 個(gè)α-螺旋組成（H1～H12），其配體結(jié)合口袋被大量的芳香氨基酸及疏水殘基填充，難以結(jié)合配體[7]。AF2 位于LBD 的C 端，并有大部分的重疊，是依賴配體的轉(zhuǎn)錄激活域。

圖1 NR4A 的結(jié)構(gòu)組成及功能

2 NR4A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

NR4A 是一類不依賴于配體激活的主動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用主要是依賴N 末端的AF1 域。而其本身的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾（磷酸化、泛素化等過(guò)程）可被多種外界刺激激活[8]。激活后的NR4A 以單體或二聚體形式識(shí)別并結(jié)合下游靶基因的啟動(dòng)子調(diào)控其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

NR4A 通過(guò)單體形式結(jié)合下游基因啟動(dòng)子上的NGFI-B 反應(yīng)元件（NBRE：AAAGGTCA）上（見圖2A），從而發(fā)揮重要的生理作用[6]。NR4A 也可以以同源二聚體結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域的Nur 反應(yīng)元件（NurRE）。PHILIPS 等[9]研究表明NR4A1 和NR4A2可以與一種在類嗎啡樣神經(jīng)肽（POMC）啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)的NurRE 元件（TGATATTACCTCCAAATGCCA）結(jié)合形成同源二聚體（見圖2B）。NurRE 元件是由2 個(gè)半位點(diǎn)（NBRE）的回文結(jié)構(gòu)組成的。NR4A1在體內(nèi)的信號(hào)功能有可能是由于NurRE 形成的二聚體介導(dǎo)的，MARIA 等[10]證實(shí)NR4A1 識(shí)別NurRE 時(shí)，可對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)及淋巴系統(tǒng)的生理刺激有反應(yīng)，而NR4A1 識(shí)別其他靶基因卻沒(méi)有這種反應(yīng)。結(jié)合NR4A1 與NurRE 元件復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)，雖然在DNA 結(jié)合域之間沒(méi)有觀察到蛋白的相互作用，但在其配體結(jié)合域之間可能存在蛋白-蛋白相互作用[11]。這些相互作用可能對(duì)NR4A 家族蛋白發(fā)揮功能起到重要作用。此外，JOLMA 等[12]通過(guò)高通量指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）和芯片測(cè)序（ChIP-seq）對(duì)人類轉(zhuǎn)錄因子的大樣本分析表明，NR4A 可以結(jié)合另外2 個(gè)不同的NurRE基序：一個(gè)名為ER0 的基序由2 個(gè)翻轉(zhuǎn)的8 個(gè)核苷酸半位點(diǎn)（NBRE）組成，沒(méi)有間隔（見圖2C）；另一個(gè)是IR5，由2 個(gè)反向的8 個(gè)核苷酸半位點(diǎn)（NBRE）重復(fù)序列組成，間隔為5 個(gè)核苷酸（見圖2D）。通過(guò)ChIP-seq 數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)諸多重要基因（如Foxo1，Cyp17a1等）的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了這2 個(gè)位點(diǎn)，提示NR4A 家族蛋白在體內(nèi)可通過(guò)結(jié)合NurRE 形成同源二聚體調(diào)控下游基因的表達(dá)，該發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了NR4A 調(diào)節(jié)表達(dá)的靶基因范圍，讓人們認(rèn)識(shí)到NR4A 蛋白參與人體功能的更多可能[13]。

圖2 NR4A家族蛋白的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)模型

NR4A 家族蛋白除了形成單體或者同源二聚體以外，也可以與RXRα 或者RXRγ 結(jié)合形成異源二聚體識(shí)別DR5 元件或者IR5 元件來(lái)激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，這一機(jī)制在大腦多巴胺神經(jīng)元中起到重要作用[14]。RXRγ 與NR4A1 結(jié)合后可以增加RXRγ 的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步增強(qiáng)RXR 配體9-cis-RA 的活性；NR4A1 與RXRα 結(jié)合也會(huì)促進(jìn)9-cis-RA 對(duì)RXRα 轉(zhuǎn)錄激活[15]。前列腺癌細(xì)胞中，在凋亡刺激因子作用下，只有RXRα 存在，NR4A1 才能從胞核轉(zhuǎn)移到線粒體上，并在線粒體中通過(guò)與BCL-2基因相互作用誘導(dǎo)凋亡[16]。

3 NR4A與疾病的關(guān)系

NR4A 家族廣泛表達(dá)于多個(gè)組織中，最早是在神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的。在后續(xù)的研究中，NR4A 被證明在造血系統(tǒng)、脂肪組織、肝臟組織中也至關(guān)重要。在這些組織中，NR4A 家族成員的功能可分為兩類：激活或抑制轉(zhuǎn)錄目標(biāo)的表達(dá)。除了直接調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)以外，NR4A 可通過(guò)與其他蛋白（如BCL-2）相互作用，參與體內(nèi)多條信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖和凋亡，參與神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。

3.1 NR4A與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

NR4A2 在腦組織中廣泛表達(dá)，主要存在于大腦皮質(zhì)和海馬等端腦結(jié)構(gòu)中，其在多巴胺能神經(jīng)元中的作用研究最為廣泛[17]。NR4A2 通過(guò)調(diào)節(jié)多巴胺的合成和代謝，影響多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)。NR4A2-/-小鼠在腦黑質(zhì)/腹側(cè)被蓋區(qū)表現(xiàn)出多巴胺選擇性地丟失，不能產(chǎn)生中腦多巴胺能神經(jīng)元，小鼠生存活性降低，并在出生后早期迅速死亡[18]。帕金森病模型雜合性NR4A2 小鼠的神經(jīng)功能呈現(xiàn)年齡相關(guān)性下降，其中NR4A2 表達(dá)的減少增加了1-甲苯基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）對(duì)中腦多巴胺神經(jīng)元的損傷，表明NR4A2 有神經(jīng)保護(hù)功能[19]。在201 例帕金森病患者和221 例年齡匹配的對(duì)照組的基因篩查中發(fā)現(xiàn)2 個(gè)與帕金森病相關(guān)的突變，存在于NR4A2 的外顯子中（309C-T 突變和-245T-G 突變）。NR4A2 點(diǎn)突變通過(guò)減少酪氨酸羥化酶（多巴胺合成中的限速酶）的表達(dá)導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生[20]，NR4A2 的低表達(dá)也可提高帕金森病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)表明NR4A2 可通過(guò)限制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性介質(zhì)，維持移植神經(jīng)干細(xì)胞的存活，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受神經(jīng)炎癥損傷[21-22]。這表明，NR4A2 是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種生理功能的重要因素，提示NR4A2 在預(yù)防和治療包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中具有強(qiáng)大的潛力。在帕金森病小鼠模型中，NR4A2 的激活劑C-DIM12 通過(guò)調(diào)節(jié)NR4A2 的轉(zhuǎn)錄活性和血腦屏障，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，防止多巴胺神經(jīng)元胞體損失，減少核因子-κB（NF-κB）調(diào)節(jié)的炎癥基因表達(dá)，保護(hù)多巴胺神經(jīng)元，有望用于治療包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病[23]。

3.2 NR4A2與免疫相關(guān)疾病

NR4A 家族蛋白調(diào)控多種免疫細(xì)胞的分化過(guò)程，參與多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。NR4A2的抗炎活性主要是通過(guò)影響NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮作用。在NF-κB 信號(hào)通路，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α） 和細(xì)菌脂多糖（LPS） 的炎癥刺激下，NR4A2 能形成共抑制復(fù)合物，起到抗炎的作用[24]。NR4A2 也可以激活負(fù)調(diào)控因子AP-1 的表達(dá)，抑制炎癥因子的表達(dá)，起到抗炎的效果[25]。NR4A2 參與Th17 細(xì)胞的成熟和分化，也可以激活轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 的表達(dá)，激活調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）的分化。有研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，NR4A基因敲除小鼠體內(nèi)的Treg 細(xì)胞顯著減少，這會(huì)引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的自身免疫性反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病。NR4A2 與其他具有抗炎活性的可溶性細(xì)胞表面介質(zhì)（如IL-10、TGF-β、TAM 受體配體）作用，對(duì)調(diào)節(jié)活化的免疫細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥信號(hào)，以及炎癥信號(hào)的分辨非常重要[28]。NR4A2 可促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎，而干擾滑膜細(xì)胞中內(nèi)源性NR4A2 的表達(dá)可以減輕關(guān)節(jié)的損傷程度，提示NR4A2 可能成為關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)[29]。

3.3 NR4A2與心血管疾病

血管壁受損后，參與血管重建細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）的NR4A 受體家族蛋白表達(dá)會(huì)上調(diào)，以應(yīng)對(duì)微環(huán)境變化[30]。動(dòng)脈粥樣硬化病變患者巨噬細(xì)胞中高表達(dá)的NR4A 蛋白是通過(guò)參與NF-κB 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用的。PEI 等[31]研究證實(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞中NR4A1 可通過(guò)直接結(jié)合IKKi基因啟動(dòng)子上的NBRE 位點(diǎn)來(lái)激活I(lǐng)KKi的表達(dá)，激活NF-κB 信號(hào)通路。BONTA 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，在THP-1 細(xì)胞系中，NR4A 受體家族3 個(gè)蛋白過(guò)表達(dá)可使炎癥因子TNF-α，LPS、IL-1β 和趨化因子的表達(dá)降低，減少巨噬細(xì)胞對(duì)氧化低密度脂蛋白的攝取。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的NR4A3 參與多條信號(hào)通路，包括激活蛋白激酶C、鈣動(dòng)員和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展。有研究[33]發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞中的NR4A 受體家族蛋白也會(huì)被外部刺激誘導(dǎo)高表達(dá)，小鼠平滑肌細(xì)胞中的有絲分裂刺激可誘導(dǎo)NR4A3 mRNA 表達(dá)上調(diào)，超過(guò)原來(lái)的600 倍，除此之外，動(dòng)靜脈平滑肌細(xì)胞的周期伸展運(yùn)動(dòng)可以提高NR4A1 的轉(zhuǎn)錄水平；平滑肌細(xì)胞中的NR4A3 參與的是RAS-MEK-ERK1/2 信號(hào)通路，沉默平滑肌細(xì)胞中的NR4A1 通過(guò)減少DNA 合成，增加p27Kip1 蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出抗增殖活性；而miR-145 負(fù)調(diào)控NR4A2，缺乏miR-145的小鼠由于其高表達(dá)NR4A2 而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成具有抵抗作用?？偟膩?lái)說(shuō)，在動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)程中，NR4A3 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，而NR4A1 和NR4A2 可減輕動(dòng)脈粥樣硬化，可能成為預(yù)防和治療心血管疾病的標(biāo)志物。

3.4 NR4A2與腫瘤

腫瘤的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)程非常復(fù)雜，一直是科學(xué)研究的重點(diǎn)。NR4A 受體表達(dá)改變已在許多實(shí)體瘤中被發(fā)現(xiàn)。NR4A1 和NR4A3 受體表達(dá)的減少與血液惡性腫瘤包括急性髓性白血病和慢性骨髓增生性疾病相關(guān)。NR4A 受體在多種腫瘤組織中通過(guò)上調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控的細(xì)胞周期素D2（Cyclin D2）、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制的轉(zhuǎn)錄因子E2F1、介導(dǎo)活性氧類物質(zhì)生成的硫氧還蛋白5（TXNDC5）等多種靶基因促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，針對(duì)NR4A 受體的抗腫瘤藥物也一直都是研究的重點(diǎn)。目前針對(duì)NR4A 受體藥物的開發(fā)策略包括靶向NR4A 受體的表達(dá)、核輸出，以及與輔因子的相互作用。針對(duì)NR4A 受體的靶向藥物有助于提高腫瘤對(duì)放化療的敏感性。Csn-B 是從真菌中分離出來(lái)的化合物，是NR4A1 的配體，通過(guò)激活NR4A1 靶基因，誘導(dǎo)NR4A1 的表達(dá)，將NR4A1 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體引起細(xì)胞色素C 的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，延緩異種移植瘤的生長(zhǎng)，Csn-B 可能是治療癌癥的新的候選或者先導(dǎo)化合物[34]。從化合物庫(kù)中篩選出的靶向NR4A1 的化合物THPN，誘導(dǎo)NR4A1 從胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移，在黑色素瘤細(xì)胞系中證實(shí)NR4A1/THPN 結(jié)合后，NR4A1 可結(jié)合線粒體外膜上的NIX 及腺嘌呤核苷酸移位酶1，通過(guò)線粒體外膜通道上的轉(zhuǎn)位酶進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過(guò)程導(dǎo)致細(xì)胞死亡[35]。在胰腺癌細(xì)胞中的Nur77 受體激動(dòng)劑（DIM-CpOPHCH3）是潛在的NR4A1 激動(dòng)劑；然而，該化合物對(duì)人NR4A1 僅是弱激動(dòng)劑，并且大多數(shù)CDIMs 表現(xiàn)出抑制效果。高活性的NR4A1 拮抗劑（DIM-C-pPhOH）與NR4A1-LBD 獨(dú)特的相互作用，直接作用于核NR4A1 并表現(xiàn)出NR4A1 拮抗活性，在癌細(xì)胞系和腫瘤中顯示DIM-C-pPhOH 是一種高效抗癌劑，提示NR4A1 拮抗劑是新一類重要的抗癌藥物[36-37]。結(jié)直腸癌中，PGE2 以cAMP/蛋白激酶a 依賴的方式誘導(dǎo)NR4A2 表達(dá)，這一機(jī)制可促進(jìn)鱗狀細(xì)胞癌對(duì)氟尿嘧啶的耐藥性[38-39]。NR4A 受體的DNA 修復(fù)作用也可能有助于放化療的耐受（如博萊霉素）。紫杉醇能夠模擬NR4A1 的功能活性，直接靶向結(jié)合線粒體膜蛋白Bcl-2，改變Bcl-2 構(gòu)象，使其從抗凋亡蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龅鞍祝|發(fā)凋亡進(jìn)程。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，NR4A 家族蛋白是一類孤兒核受體，是由多種應(yīng)激源誘導(dǎo)的早期基因，在腫瘤中的作用越來(lái)越被重視。針對(duì)NR4A 蛋白的結(jié)構(gòu)研究為更好地了解NR4A 受體識(shí)別結(jié)合不同的靶基因的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，尤其是針對(duì)其二聚體的結(jié)構(gòu)研究有助于了解基因協(xié)調(diào)表達(dá)的分子機(jī)制。而針對(duì)NR4A 蛋白的功能研究為了解腫瘤發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制及抗腫瘤治療提供了新的思路，在開發(fā)新的抗癌策略方面具有潛力。