不同褐藻來源巖藻多糖理化性質(zhì)及其免疫調(diào)節(jié)作用

太敏瑞，蔡泓瀅，李 瑞,2，賈學(xué)靜，劉曉菲，吉宏武,2，鐘賽意,2

不同褐藻來源巖藻多糖理化性質(zhì)及其免疫調(diào)節(jié)作用

太敏瑞1，蔡泓瀅1，李 瑞1,2，賈學(xué)靜1，劉曉菲1，吉宏武1,2，鐘賽意1,2

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省海洋生物制品工程實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524008；2. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034）

【】探討不同褐藻來源巖藻多糖（Fucoidan，F(xiàn)uc）理化性質(zhì)的差異及其對免疫調(diào)節(jié)活性的影響。以3種不同褐藻來源（裙帶菜、墨角藻、海帶）的5個Fuc樣品為原料，采用高效凝膠色譜、傅里葉紅外光譜儀（FTIR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、納米粒度電位儀和同步熱分析儀（TG-DSC）等測定分子質(zhì)量、微觀形態(tài)、粒徑和電位、熱穩(wěn)定性等指標(biāo)以及對RAW264.7細(xì)胞NO生成量的影響。5個Fuc樣品的總糖含量、硫酸基含量、粒徑與電位、糖醛酸含量及單糖組成和含量存在一定差異。5個Fuc樣品溶液均帶負(fù)電荷，均具有明顯的含硫基團(tuán)紅外吸收特征峰；SEM結(jié)果顯示，裙帶菜來源的Fuc呈球形或片狀形態(tài)，墨角藻來源的呈片狀形態(tài)，而海帶來源的Fuc呈絮狀結(jié)構(gòu)；TG-DSC分析表明，不同樣品分解溫度不同，分別在175 ～ 237 ℃之間；5個Fuc樣品在質(zhì)量濃度0.50 ～ 1.00 mg/mL范圍內(nèi)均具有一定程度的免疫調(diào)節(jié)活性，其中1.00 mg/mL Fuc刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO含量顯著高于脂多糖LPS組（< 0.05），表明3種來源的Fuc在此濃度下均具有強烈的免疫刺激活性，并與其分子質(zhì)量具有明顯相關(guān)性，且以裙帶菜來源的3個Fuc樣品免疫刺激活性最強。不同來源的Fuc其基本組成總糖含量、硫酸基含量、糖醛酸含量、粒徑、單糖組成和種類均存在差異。巖藻多糖的分子質(zhì)量及硫酸基含量對熱穩(wěn)定性和免疫調(diào)節(jié)作用存在一定影響。

褐藻；巖藻多糖；理化性質(zhì)；免疫調(diào)節(jié)作用

巖藻多糖（Fucoidan，F(xiàn)uc）又稱巖藻聚糖硫酸酯，主要來源于海洋褐藻，是一種含巖藻糖的復(fù)雜硫酸化多糖，F(xiàn)uc的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和生物活性根據(jù)其來源、季節(jié)變換和提取方法等而有所不同。Fuc的主鏈由重復(fù)的(1→3)---吡喃巖藻糖或交替的(1→3)和(1→4)連接的--吡喃巖藻糖組成[1]。不同褐藻來源的Fuc硫酸基含量和取代度不同，其單糖組成也存在差異，除了主要的巖藻糖外，不同來源的Fuc還可能含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖糖醛酸[2]。

目前，關(guān)于Fuc的研究主要集中在抗癌[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗血栓[7]、抗凝血[8]、抗氧化[9]、降血糖[10]、降膽固醇[11]、防輻射[12]、抗脂肪生成[13]及免疫調(diào)節(jié)[14]等方面。有學(xué)者提出，多糖調(diào)節(jié)免疫活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，特別是與硫酸基含量、相對分子質(zhì)量、鏈構(gòu)象、糖苷鍵的類型和位置等有關(guān)[15]。目前，不同褐藻來源巖藻多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的差異及其對免疫活性影響的研究鮮見報道。因此，本研究以3種不同褐藻來源的5個Fuc樣品為原料，研究其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差異，分析不同濃度的5個Fuc樣品對免疫活性的影響，以期為不同褐藻來源Fuc相關(guān)功能產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 5種巖藻多糖（裙帶菜來源Fuc I、裙帶菜來源Fuc II購自青島明月海藻集團(tuán)，裙帶菜來源Fuc III和墨角藻來源Fuc購自Sigma公司，海帶來源Fuc購自上海源葉生物科技有限公司）依次記為編號A ～ E；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)；標(biāo)準(zhǔn)品-甘露糖（-Man）、-鼠李糖（-Rha）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）、-乙酰氨基葡萄糖醛酸（Glc-NAc）、-葡萄糖（-Glc）、-半乳糖（-Gal）、-木糖（-Xyl）、-阿拉伯糖（-Ara）、-巖藻糖（-Fuc），上海源葉生物科技有限公司；咔唑、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），Sigma公司；三氯甲烷、甲醇、乙腈（均為色譜純），賽默飛世爾科技公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（相對分子質(zhì)量分別為5 000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800），Sigma公司；RAW 264.7細(xì)胞，中國科學(xué)院干細(xì)胞庫；一氧化氮檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)；DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胎牛血清（FBS），美國生命技術(shù)公司；脂多糖（LPS，大腸桿菌055：B5）購自Sigma公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 Varioskan Flash 全自動酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；Agilent1200 高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），美國安捷倫公司；BRUKER TENSOR-2 傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司；馬爾文納米粒度電位儀，上海馬爾文帕納科公司；同步熱分析儀，德國 NETZSCH公司；N-4000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社。

1.2 方法

1.2.1 巖藻多糖化學(xué)組成測定 Fuc總糖含量采用苯酚-硫酸法，以-巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品[16]；硫酸基含量采用氯化鋇-明膠比濁法，以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品[17]；糖醛酸含量用硫酸-咔唑法，以-葡萄糖醛為標(biāo)準(zhǔn)品[18]；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品[19]。

1.2.2 巖藻多糖的紫外波長掃描 將Fuc粉末以蒸餾水配成0.1 mg/mL的溶液，以蒸餾水為參比，采用紫外-可見分光光度計在190 ～ 400 nm測定樣品的紫外吸收光譜。

1.2.3 巖藻多糖單糖組成分析 稱取Fuc樣品各 3 mg，置于樣品瓶中，加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，于110 ℃烘箱水解8 h，得樣品水解液。單糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品水解液經(jīng)PMP-柱前衍生高效液相色譜法進(jìn)行單糖組成分析。色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX EclipseXDB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-乙腈溶液（體積比83∶17）；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；檢測波長：245 nm紫外檢測器；進(jìn)樣體積10 μL[20]。

1.2.4 巖藻多糖的分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠色譜測定樣品分子質(zhì)量。色譜條件為：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm × 300 mm）；流動相：0.05 mol/L NaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器：示差檢測器RI-10A。

1.2.5巖藻多糖的微觀形態(tài)分析 取適量不同褐藻來源Fuc樣品置于樣品臺，用導(dǎo)電膠固定后進(jìn)行鍍金，在5 kV電場下用掃描電子顯微鏡對Fuc的表面形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.6 巖藻多糖的粒徑與電位測定 將Fuc粉末以蒸餾水配成5 mg/mL的溶液，放置于馬爾文納米粒度電位儀樣品槽進(jìn)行測定，每個樣品掃描3次。

1.2.7 巖藻多糖的結(jié)構(gòu)分析 取1 ～ 2 mg樣品與200 mg溴化鉀混勻，充分研磨后壓制成半透明薄片，利用傅里葉紅外光譜（FTIR）進(jìn)行掃描，掃描波數(shù)范圍為4 000 ～ 400 cm-1，掃描時間為32 s。

1.2.8 巖藻多糖的熱穩(wěn)定性測定 將5 ～ 6 mg干燥Fuc粉末放置于專用鋁坩堝內(nèi)，在氮氣氣氛下升溫速率為5 ℃/min，溫度范圍為30 ～ 300 ℃，用同步熱分析儀對不同褐藻來源Fuc進(jìn)行熱穩(wěn)定性測定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與免疫活性的研究

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7細(xì)胞置于37 ℃用含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的DMEM培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)。

1.3.2 一氧化氮NO生產(chǎn) 將細(xì)胞懸液（1×104mL-1）接種至96孔板（100 μL/孔），使其在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用磷酸鹽PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）洗滌兩次去除非貼壁細(xì)胞，后向96孔分別加入100 μL不同濃度的五種不同來源的Fuc（用新鮮的完全DMEM培養(yǎng)基溶解，終質(zhì)量濃度為0.50、0.75和1.00 mg/mL），孵育12 h。最后收集每個孔的培養(yǎng)上清液分析RAW 264.7細(xì)胞釋放的NO。取上清液用一氧化氮檢測試劑盒檢測，在540 nm處測量光密度。以脂多糖（LPS，終質(zhì)量濃度1 μg/mL）用作陽性對照，不含F(xiàn)uc樣品的DMEM培養(yǎng)基作為空白對照。根據(jù)NaNO2的校準(zhǔn)曲線計算各NO產(chǎn)生量[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以3組平行的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2017軟件作圖，采用SPSS 25.0進(jìn)行顯著性分析（鄧肯分析），顯著性水平= 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻多糖的純度分析

5個樣品進(jìn)行紫外波長掃描結(jié)果表明，僅在190 ～ 220 nm處具有糖類特征吸收峰，在260 nm未見核酸吸收峰，在280 nm未見明顯的蛋白質(zhì)吸收峰，其他紫外區(qū)域也無明顯吸收峰，說明樣品中基本不含蛋白質(zhì)等化合物[22]，樣品較純。

2.2 巖藻多糖的化學(xué)組成

3種不同褐藻來源的5個Fuc樣品的總糖、蛋白質(zhì)、硫酸基和葡萄糖醛酸含量如表1所示。5個Fuc樣品中，裙帶菜來源的3個Fuc樣品總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為89.09% ～ 94.52%，顯著高于海帶來源Fuc樣品（86.93%）和墨角藻來源Fuc樣品（76.53%）（< 0.05）。5個樣品均幾乎不含蛋白質(zhì)，與2.1節(jié)結(jié)果一致，說明5個Fuc樣品純化效果較好。5個樣品的硫酸基含量有所差異，其中以樣品C硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為57.54%，顯著高于其他四個樣品（< 0.05），而樣品A（42.30%）和D（47.44%）硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)又顯著高于樣品B（38.5%）和E（38.95%）（< 0.05），樣品A、D之間，B、C之間硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異（> 0.05）。多糖的硫酸基團(tuán)是影響其生物活性的關(guān)鍵因素[23]，而硫酸基團(tuán)含量受提取工藝如酸[24]、提取時間[25]等的影響。5個Fuc樣品中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（< 0.05），以樣品E最高（20.91%），而同為裙帶菜來源的樣品A、B和C次之，樣品D糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為11.32%。3種不同褐藻來源的5個Fuc理化性質(zhì)分析表明，不同褐藻來源Fuc樣品的總糖、蛋白質(zhì)、硫酸基和葡萄糖醛酸含量存在差異。

表1 不同褐藻來源巖藻多糖理化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：同列數(shù)據(jù)凡含一個相同字母表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

Note: The same letter in the samecolumn indicates that the difference is not statistically significant（> 0.05）.

2.3 巖藻多糖的單糖組成

采用PMP-柱前衍生高效液相色譜法，對5個樣品的單糖組成進(jìn)行分析，5個樣品的單糖摩爾百分比如表2所示。5個樣品都含有-巖藻糖和-甘露糖，其中-巖藻糖摩爾百分比最高；5個樣品均不含半乳糖醛酸、-乙酰-氨基葡萄糖和-半乳糖。結(jié)果表明，不同F(xiàn)uc樣品單糖組成及摩爾分?jǐn)?shù)有所差異，可能是由于樣品來源，提取方法、采收季節(jié)和地理位置等因素不同而引起的[26]。

表2 不同褐藻來源巖藻多糖的單糖摩爾分?jǐn)?shù)

注：—表示未檢出。Note: —means not detected.

2.4 巖藻多糖的分子質(zhì)量

圖1所示，多糖樣品A、B、D和E除了含有一個峰面積占比較大的峰以外，還含有一個占比較小的峰，而多糖樣品C為單一色譜峰，說明純度較高。多分散系數(shù)（重均分子質(zhì)量m/ 數(shù)均分子質(zhì)量m）是用于衡量分子質(zhì)量的分布廣度，m/m值越低，表明其分子質(zhì)量分布較窄，反之，m/m值越大，說明體系的分子質(zhì)量分布越寬[27]。由表3可知，樣品A和C分散系數(shù)約為1.6，樣品B、D和E分散系數(shù)為1.5，說明5個Fuc分子質(zhì)量分布差異不大；結(jié)果表明，不同褐藻來源的5個Fuc分子質(zhì)量各不相同。本研究中裙帶菜來源的樣品A、B、C的重均分子質(zhì)量分別為23 909、10 331、19 516 u，與Yu等[28]從山東威海市場購買的裙帶菜提取的Fuc分子質(zhì)量明顯不同（為103 552 u），可能是因為來源不同[29]；海帶來源的多糖樣品E分子質(zhì)量為78 580 u，與湯順清[30]報道的海帶巖藻多糖分子質(zhì)量為69 518 u存在差異，這可能與提取和純化方法等因素有關(guān)。另外，Benslima等[31]研究在4個收獲期（12月、來年4月、7月和9月）從席夫納氏囊鏈藻（）中提取出一種硫酸化褐藻糖膠，其硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)和分子質(zhì)量隨收獲季節(jié)變化很大，分別從12月的7.8 %和3 745 u變化至7月的34.8 %和26 390 u。

2.5 巖藻多糖的結(jié)構(gòu)

如圖2所示，在4 000 ～ 400 cm-1的頻率范圍內(nèi)記錄了多糖樣品的FTIR圖譜。5個巖藻多糖樣品吸收峰均在3 500 cm-1～ 835 cm-1附近，5個樣品在3 500 cm-1～ 2 500 cm-1之間的區(qū)域顯示出兩個主要峰，即所有多糖的特征吸收峰。3 500 cm-1和2 940cm-1處的吸收峰是由O—H和C—H拉伸振動引起的，1 130 ～ 1 180 cm-1處的吸收峰是由糖苷的C—O—C部分或環(huán)中的C—O—H拉伸振動引起的[32]，1 070 cm-1和960 cm-1附近的吸收峰是吡喃環(huán)的伸縮振動[33]；5個樣品在1 640 cm-1和1 418 cm-1處有羧基（COO—）吸收峰，分別是由于不對稱的C==O和對稱的C==O伸縮振動產(chǎn)生，證明了糖醛酸的存在[34]；在1 265 cm-1和835 cm-1處有硫酸基團(tuán)（SO3-）的吸收峰[32]，1 265 cm-1處的吸收是S==O伸縮振動引起的，830 ～ 840 cm-1附近的吸收峰是由巖藻糖或半乳糖的C-4的軸向位置存在硫酸鹽引起的[35]；578 cm-1附近的吸收峰是由于O==S==O的彎曲振動引起的[36]，說明5個巖藻多糖都存在糖環(huán)、羥基、乙酰氨基、羧基和硫酸基等官能團(tuán)并且多糖為陰離子多糖；同時，5個多糖含硫基團(tuán)的紅外吸收峰強度與硫酸基含量呈正相關(guān)。

A，裙帶菜來源Fuc I；B，裙帶菜來源Fuc II；C，裙帶菜來源Fuc III；D，墨角藻來源Fuc；E，海帶來源Fuc

表3 不同褐藻來源巖藻多糖分子質(zhì)量分布

Table 3 Molecular weight distribution of fucoidans derived from different brown algae

注：A，裙帶菜來源Fuc I；B，裙帶菜來源Fuc II；C，裙帶菜來源Fuc III；D，墨角藻來源Fuc；E，海帶來源Fuc。表格中顯示的均為峰面積占比大的分子質(zhì)量，在色譜圖中標(biāo)記為1。

Notes: A,source Fuc I; B,source Fuc II; C,source Fuc III; D,source Fuc; E,source Fuc, respectively. All the molecular weights shown in the table are the ones with a large proportion of peak area and marked as 1 in the chromatogram.

圖2 巖藻多糖4 000 ～ 400 cm-1范圍內(nèi)FTIR圖譜

2.6 巖藻多糖的微觀形態(tài)

如圖3所示，對3種不同褐藻來源的5個Fuc分別進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，裙帶菜來源的樣品A和B微觀結(jié)構(gòu)呈球形，但樣品A球形直徑大于樣品B，裙帶菜來源樣品C呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)，且表面粗糙；樣品D呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)，表面有不規(guī)則氣泡狀；樣品E呈不規(guī)則絮凝聚集狀。5個Fuc樣品微觀結(jié)構(gòu)差異可能由于其分子質(zhì)量或主鏈構(gòu)象不同，從而影響多糖分子內(nèi)的相互作用不同，形成不同結(jié)構(gòu)[37]。

A，裙帶菜來源Fuc I；B，裙帶菜來源Fuc II；C，裙帶菜來源Fuc III；D，墨角藻來源Fuc；E，海帶來源Fuc

2.7 巖藻多糖的粒徑與電位

從圖4(a)中可以看出，5個Fuc樣品的粒徑分別為296.90、254.00、522.00、506.70和188.60 nm，裙帶菜來源的樣品A、B和C粒徑大小有顯著差異（< 0.05）。微觀形態(tài)同為片狀結(jié)構(gòu)的樣品C和D粒徑明顯較大（< 0.05）。結(jié)果表明，樣品的粒徑與分子質(zhì)量和微觀結(jié)構(gòu)均有一定關(guān)系。多糖粒徑大小對其體內(nèi)代謝和生物利用度有很大影響，小分子物質(zhì)比大分子物質(zhì)更易被人體吸收利用[38]。

從圖4(b)中可以看出，質(zhì)量濃度為5 mg/mL的5個Fuc樣品溶液均帶負(fù)電荷，這與其含大量硫酸基團(tuán)有關(guān)；5個Fuc樣品的Zeta電位分別為-28.70、-21.40、-43.80、-45.00和-44.60 mV，Zeta電位絕對值接近或超過30。Zeta電位用于反應(yīng)溶液表面所帶靜電荷的數(shù)量，一般Zeta電位絕對值大于30時，表明溶液較穩(wěn)定[39]，說明5個樣品溶液均具有較好的物理穩(wěn)定性。Fuc樣品的Zeta電位受其濃度、硫酸基含量、葡萄糖醛酸含量及構(gòu)象等因素影響[39]。

凡含一個相同字母表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）

The same letter indicates that the difference is not statistically significant（> 0.05）

圖4 巖藻多糖樣品粒徑和Zeta電位分布

Fig. 4 Particle size and zeta potential of fucoidans

2.8 巖藻多糖的熱穩(wěn)定性

如圖5(a)所示，熱重分析（TG）曲線顯示Fuc經(jīng)歷兩個主要的質(zhì)量損失過程，第一次質(zhì)量損失主要發(fā)生在39 ～ 140 ℃，這種質(zhì)量損失主要來源于多糖中水分的損失；第二次質(zhì)量的損失主要發(fā)生在140 ～ 230 ℃。5個Fuc樣品（A-E）的最大重量損失速率溫度（分解溫度）分別為：169、169、186、226、230 ℃，這種快速質(zhì)量損失可能是由多糖分解或硫酸基損失引起的[40]。

如圖5(b)所示，示差掃描量熱（DSC）曲線顯示，F(xiàn)uc樣品首先在39 ～ 52 ℃發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變；隨著溫度升高，樣品吸熱結(jié)晶，水分不斷蒸發(fā)，5個樣品質(zhì)量在173 ～ 244 ℃范圍內(nèi)減少；后樣品熔解放熱，5個巖藻多糖樣品（A-E）的熔點分別為：173、175、193、237、244 ℃，此時樣品質(zhì)量急劇減少；最終趨于穩(wěn)定。TG-DSC結(jié)果表明，裙帶菜來源的Fuc樣品A、B和C分解溫度和熔點相近，而墨角藻和海帶來源的Fuc樣品的分解溫度和熔點較高。不同樣品間的熱穩(wěn)定性差異主要取決于它的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而其化學(xué)結(jié)構(gòu)與Fuc來源、處理溫度、單糖類型等有關(guān)[41]

2.9 不同褐藻來源巖藻多糖對NO產(chǎn)生的影響

利用Griess法測定RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中巖藻多糖對NO產(chǎn)生量的影響如圖6所示。結(jié)果表明，5個多糖樣品當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.50 和0.75 mg/mL時，NO生成量顯著高于空白組，但均顯著低于LPS組（< 0.05），說明3種來源的Fuc均具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性；但是當(dāng)其質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時，5個Fuc樣品組NO生成量顯著高于LPS組（< 0.05），表明在此濃度下3種來源的5個Fuc樣品表現(xiàn)出非常強的免疫刺激活性[42]。裙帶菜來源的Fuc組NO生成量顯著高于墨角藻和海帶來源的Fuc，表明3個裙帶菜來源Fuc產(chǎn)品的免疫刺激活性優(yōu)于墨角藻和海帶來源的Fuc；并且在1.00 mg/mL質(zhì)量濃度下，5個Fuc樣品NO生成量與分子質(zhì)量大小成正相關(guān)，分子質(zhì)量最大的裙帶菜來源Fuc A具有最強的免疫調(diào)節(jié)活性。巨噬細(xì)胞分泌NO在對抗腫瘤細(xì)胞和微生物中起著重要作用，可通過測量NO產(chǎn)生來評估巖藻多糖在RAW264.7細(xì)胞中的免疫刺激活性[43]。并且來自藻類的硫酸化多糖已被證明具有免疫調(diào)節(jié)活性，可能在刺激免疫反應(yīng)或控制免疫細(xì)胞活性方面具有潛在應(yīng)用[44]。Qi等[45]研究發(fā)現(xiàn)，橢圓小球藻（）多糖的硫酸基含量和分子質(zhì)量均影響NO的釋放，且分子質(zhì)量是刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的關(guān)鍵因素，與本研究結(jié)果一致。此外，F(xiàn)uc硫酸基含量對RAW264.7細(xì)胞的刺激能力也有一定影響，因為當(dāng)多糖脫硫時，對巨噬細(xì)胞的刺激能力會減弱，這與硫酸基團(tuán)產(chǎn)生的負(fù)電荷密度水平有關(guān)[46]；Sun等[32]也發(fā)現(xiàn)，海藻石莼（）多糖分子中硫酸基基團(tuán)可以調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫刺激活性。

凡含一個相同字母表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05），小寫字母表示同一樣品不同濃度間，大寫字母表示同一濃度不同樣品間。

Where there is a same letterbetween any two data, the difference is not statistically significant (> 0.05), lowercase letters indicate the same sample with different concentrations, and uppercase letters indicate the same concentration and different samples.

.圖6 不同濃度巖藻多糖對RAW264細(xì)胞NO濃度的影響

Fig. 6 Effects of different concentrations of fucoidans on NO production in RAW264 cells

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)5個Fuc樣品的總糖含量、硫酸基含量、葡萄糖醛酸含量、分子質(zhì)量、粒徑和電位分布等存在差異。樣品A、B和C（裙帶菜來源）總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（80.09% ～ 94.52%），而樣品D（墨角藻來源）總糖含量最低（76.53%）；樣品C硫酸基含量最高（57.54%），顯著高于其他四個樣品（< 0.05）；樣品E（海帶來源）糖醛酸含量最高（20.91%），顯著高于其他四個樣品（< 0.05）。5個樣品單糖組成和種類略有不同，但均以-巖藻糖為主。樣品A重均分子質(zhì)量最大（23 909 u），樣品E重均分子質(zhì)量最?。? 858 u）。5個Fuc樣品均在1 265 cm-1和835 cm-1處具有含硫基團(tuán)的紅外吸收特征峰，且微觀形態(tài)也存在球形或片狀結(jié)構(gòu)差異。樣品C、D粒徑和Zeta電位絕對值明顯較大。相對于墨角藻和海帶來源的Fuc樣品，裙帶菜來源的樣品具有較低的分解溫度和熔點。5個Fuc樣品其質(zhì)量濃度為0.50和0.75 mg/mL時具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，在1.00 mg/mL時表現(xiàn)出非常強的免疫刺激活性，其中裙帶菜來源的Fuc相比與墨角藻和海帶來源的Fuc具有更強的免疫調(diào)節(jié)能力，這可能與裙帶菜來源的Fuc樣品含較高的總糖含量和硫酸基含量、較大的分子質(zhì)量和球形的微觀結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系。本研究表明不同褐藻來源Fuc其理化性質(zhì)對免疫活性具有一定影響。

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Physicochemical Properties and Immunomodulatory Effects of Fucoidan from Different Brown Algae

TAI Min-rui1, CAI Hong-ying1, LI Rui1,2, JIA Xue-jing1, LIU Xiao-fei1, JI Hong-wu1,2, ZHONG Sai-yi1,2

（1.////////,524088,;2.,,116034,）

【】To investigate the differences of physicochemical properties of fucoidans (Fucs) from different brown algae and the effect on immunomodulatory activity. 【】Five Fucs samples from three different brown algaes (,, and) were used as raw materials, Fourier infrared transform spectrometer (FTIR), scanning electron microscopy (SEM), nanoparticle size potentiometry, and simultaneous thermal analyzer (TG-DSC) were used to determine the molecular weight, microscopic morphology, particle size and potential, thermal stability, respectively, and the effect on NO production of RAW264.7 cells was also tested . The difference of the physicochemical properties and the immune activity of Fucs were further analyzed. 【】There was some difference in the total sugar content, sulfate group content, particle size and potential, glyoxylate content and monosaccharide composition and content of the five Fucs. All five Fucs solutions were negatively charged and had obvious infrared absorption characteristic peaks of sulfur-containing groups; SEM results showed that Fuc fromshowed spherical or lamellar shape, Fuc fromshowed lamellar shape, and Fuc fromshowed flocculent structure. The TG-DSC analysis showed that the decomposition temperatures of the five samples were different , which were between 175 ℃ and 237 ℃. All five Fucs had a certain degree of immunomodulatory activity within the concentration range of 0.50 - 1.00 mg/mL; the NO produced by RAW264.7 cells stimulated by Fucs at 1.00 mg/mL was significantly higher than that of the LPS group (< 0.05), indicating that the three sources of Fucs had significantly higher NO production than the LPS group, which had significant correlation with their molecular weight. Among which, the three Fucs fromhad the strongest immunostimulatory activity. 【】The basic composition of Fucs from different brown algae differed in total sugar content, sulfate group content, uronic acid content and particle size, as well as monosaccharide composition and types, and the molecular weight and sulfate group of the samples affect their thermal stability and the immunomodulatory effect.

brown algae; fucoidan; physicochemical properties; immunomodulatory effect

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Q26

A

1673-9159（2022）03-0062-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.009

2022-01-17

廣東省自然科學(xué)基金面上項目（2021A1515010868）；廣東省普通高校特色創(chuàng)新項目（自然科學(xué)）（2020KTSCX051）；廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃資助（2020B1111030004）；國家重點研發(fā)計劃（2020YFD0901101）；廣東科技計劃“海外名師”項目（2020A1414010069）；廣東省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊項目（2021KCXTD021）

太敏瑞（1997―），女，碩士研究生，研究方向為海洋生物多糖生物制品研究與開發(fā)。E-mail：2276854760@qq.com

李瑞（1981―），女，副研究員，博士，研究方向為食品功能因子及生物制品研究與開發(fā)。E-mail：liruihn@163.com

（責(zé)任編輯：劉朏）